Anti tumor effect of bevacizumab on a xenograft model of feline mammary carcinoma

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Anti-tumor effect of bevacizumab on a xenograft model of feline mammary carcinoma
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4873862/ 
Abstrato
Os carcinomas mamários felinos são caracterizados por progressão rápida e metástases. O factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um regulador chave da angiogênese, proliferação e metástase do tumor. O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos de uma única terapia medicamentosa do bevacizumab em um modelo de xenoenxerto de carcinoma mamário felino que expressa a proteína VEGF. O tratamento com Bevacizumab suprimiu o crescimento do tumor inibindo a angiogênese e aumentando a apoptose; no entanto, não afetou o índice de proliferação tumoral. Assim, o bevacizumab teve efeitos antitumorais em um modelo de xenoenxerto, e isso pode ser útil para o tratamento de carcinoma mamário felino.
Keywords: bevacizumab, feline mammary carcinoma, vascular endothelial growth factor (VEGF), xenograft
TRABALHO
O carcinoma mamário é o terceiro câncer mais comum em gatos, afetando principalmente mulheres com idade média de 10-12 anos no diagnóstico. Mais de 80% dos tumores mamários felinos apresentam uma malignidade considerável, juntamente com progressão rápida e metástase no pulmão e nos linfonodos locais em estágio inicial [23]. Portanto, a cirurgia inicial agressiva é considerada o melhor tratamento para o carcinoma mamário felino. A quimioterapia adjuvante que utiliza ciclofosfamida, vincristina e doxorrubicina não é útil para o tratamento de carcinomas mamários felinos [10, 14]. Portanto, novas estratégias terapêuticas são necessárias para melhorar a qualidade de vida nesses gatos. Terapias específicas visando moléculas, como a ciclooxigenase-2, estão sendo desenvolvidas para o tratamento de carcinomas mamários felinos [3]. No entanto, no momento, não existe um tratamento efetivo estabelecido para carcinomas mamários felinos.
A angiogênese tumoral desempenha um papel crítico no crescimento tumoral e na metástase. O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um regulador chave da angiogênese, crescimento e metástase em vários tumores [2]. Os receptores de VEGF, tais como VEGFR-1 / fms-like tyrosine kinase-1 (Flt-1) e receptor de domínio de inserção de VEGFR-2 / quinase (KDR), se ligam a VEGF com alta afinidade, mas apenas o VEGFR-2 é capaz de mediar angiogênese [4, 21]. O VEGFR-1 diminui a disponibilidade de VEGF para VEGFR-2 e desempenha um papel regulador negativo na angiogênese [5]. O Bevacizumab, um anticorpo monoclonal humanizado recombinante contra o VEGF, foi testado clinicamente para o tratamento de diferentes cancros em seres humanos. Bevacizumab demonstrou interagir especificamente com VEGF humano, mas não com VEGF de rato e rato [19]. Alguns estudos veterinários relataram que os inibidores do receptor de tirosina quinase (RTK) de Bevacizumab e VEGF, como o sunitinib, podem ser úteis para o tratamento de animais de companhia com tumores [15, 20]. Por outro lado, a aplicação do potencial terapêutico do novo vírus vaccinia recombinante oncocítico GLV-5b451 que expressa o anticorpo anti-VEGF de cadeia simples GLAF-2 também foi avaliada em um modelo de xenoenxerto para carcinoma mamário felino [1]. Nos gatos, estudos anteriores demonstraram que o VEGF é expresso em vários tipos de câncer, incluindo carcinomas mamários, e sua expressão está significativamente correlacionada com a classificação do tumor e um curto período de sobrevivência. Além disso, a co-expressão de VEGF e KDR pode refletir a existência de possíveis laços autocrinos e paracrinos entre células epiteliais, endoteliais e / ou estromais no carcinoma mamário felino [17]. No entanto, os efeitos antitumorais destas terapias anti-angiogénicas em estudos pré-clínicos permanecem obscuros.
Um motivo de ligação para o receptor de VEGF foi conservado entre VEGF humanos e felinos [12]. Neste estudo, investigamos o efeito antitumoral do bevacizumab em um modelo de xenoenxerto de carcinoma mamário felino.
Uma linha celular de carcinoma mamário felino FKNp estabelecido anteriormente foi utilizada no presente estudo [22]. As células foram mantidas em RPMI 1640 (Wako Pure Chemical Co., Ltd., Osaka, Japão), suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS, Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT, EUA) e 1 x solução antibiótica / antimicótica ( Nakarai Tesque, Kyoto, Japão) e incubadas a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO2.
As células foram cultivadas, lavadas com PBS e lisadas em tampão RIPA [Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM e Triton X-100 a 1% contendo um coquetel de inibidor de protease (Completo; Roche Diagnostics, Tóquio , Japão). Vinte μg de lisado ultra-sonicado de FKNp ou VEGF felino recombinante (R & D, Minneapolis, MN, U.S.A.) foram analisados ​​por SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF, que foram bloqueadas usando 5% de agente bloqueador de ECL (GE Healthcare, Tóquio, Japão) em PBS e incubadas durante a noite a 4 ° C com bevacizumab e os seguintes anticorpos: VEGF (Santa Cruz Biochemistry, Santa Cruz , CA, EUA), VEGFR-1 (Flt-1, Santa Cruz Biochemistry) e VEGFR-2 (Flk-1 / KDR, Santa Cruz Biochemistry). As membranas foram incubadas com imunoglobulina G (IgG) conjugada com peroxidase de rábano (HRP) (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD, EUA) para bevacizumab e IgG anti-coelho conjugado com HRP (Santa Cruz Biochemistry) para outras. A imunorreatividade foi detectada usando um kit de detecção ECL plus Western blot (GE Healthcare) e imaginador de luminescência LAS4000 (GE Healthcare).
Para determinar o efeito antiproliferativo do bevacizumab, foram cultivadas 5 × 103 células FKNp numa placa de fundo plano de 96 poços durante 24 horas e estimuladas com meio de cultura contendo cinco doses diferentes (concentração final = 0,001, 0,01, 0,1, 1,0 ou 10,0 μg / ml) de bevacizumab. O número de células sobreviventes foi contado usando Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japão) após 24, 48 e 72 h de tratamento. A absorvância foi medida para cada poço a um comprimento de onda de 450 nm. Para examinar o efeito citotóxico do bevacizumab, foram cultivadas 5 × 103 células FKNp numa placa de 96 poços de fundo plano (PerkinElmer, Waltham, MA, U.S.A.) e estimuladas com bevacizumab em condições como descrito acima. Após 48 horas de incubação, as células FKNp foram analisadas com ensaio de citotoxicidade CytoTox-Glo (Promega, Madison, WI, U.S.A.), de acordo com as instruções do fabricante. A luminescência de células mortas foi medida pelo sistema de detecção múltipla GloMax (Promega).
Para o transplante de xenoenxerto, uma suspensão de 5 × 105 células FKNp viáveis ​​foi injetada subcutaneamente em ratos machos não-obesos (NOD) / Shi-scid IL2Rγnull (NOG) de 14 semanas de idade, obtidos do Instituto Central de Animais Experimentais (Kawasaki , Japão). Após a formação do tumor foi confirmada macroscopicamente, administramos soro fisiológico (n = 4 / grupo) ou bevacizumab (4,0 mg / kg; n = 4 / grupo) intraperitonealmente duas vezes por semana durante 28 dias. A dose de bevacizumab foi determinada com base em um relatório anterior [15]. O volume do tumor (V) foi estimado usando a equação V = (comprimento) × (largura) 2/2. Todas as experiências foram aprovadas pelo Comitê de Experimentos de Animais da Universidade de Ciência da Vida e Veterinária da Nippon.
Os tumores que se formaram em ratinhos NOG foram fixados com 10% de formalina tampão neutro e rotineiramente incorporados em cera de parafina. As secções cortadas (4 μm) foram coradas com hematoxilina e eosina (H & E). As seções em série foram imunossincionadas pelo método LSAB usando anticorpos monoclonais de mouse contra Ki67 (Dako, Glostrup, Dinamarca) e α actina de músculo liso (αSMA, Dako) e anticorpo policlonal de coelho contra VEGF (Santa Cruz Biochemistry). As seções também foram tratadas com um kit comercial de detecção de apoptose in situ (Millipore, Billerica, MA, U.S.A.) ApopTag, de acordo com as instruções do fabricante. A densidade dos microvasos, da proliferaçãoe dos índices apoptóticos foi avaliada para αSMA pelo método hot-spot [15]. Em resumo, as lâminas foram examinadas sob baixa potência (40 ×) para identificar 10 áreas com densidades de vasos elevadas, e estas áreas foram avaliadas em alta potência (400 ×). O número médio de embarcações por 10 campos foi determinado. Os vasos contínuos foram contados como um vaso. Um método semelhante foi utilizado para avaliar as células positivas para rotulação de endereços de dUTP (TUNEL) mediada por Ki67 ou TdT para proliferação ou apoptose, respectivamente. As diferenças de significância foram determinadas usando o teste t de Student. Os valores de P <0,05 foram considerados significativos.
Western blot mostrou que FKNp expressou VEGF, VEGFR-1 e VEGFR-2 (Fig. 1A), sugerindo a possível associação entre VEGF e seus receptores em FKNp. O Bevacizumab foi detectado no peso molecular esperado de 21 e 42 kDa, correspondente ao monómero de VEGF e ao dímero, respectivamente, em extratos preparados a partir de células FKNp, bem como com monómero de VEGF felino recombinante (Fig. 1B). Estes resultados indicam que o bevacizumab interage com o VEGF felino secretado pela FKNp. A proliferação e a citotoxicidade das células FKNp não foram significativamente diferentes em condições tratadas e não tratadas com bevacizumab (dados não mostrados). 
Figura 1. Bevacizumab interage com o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) da linha FKNp. (A) Os extratos celulares de FKNp e VEGF felino recombinante (rfVEGF) foram analisados por imunotransferência com anticorpos anti-VEGFR-1 e anti-VEGFR-2 (superior) e anti-VEGF (inferior).
A atividade antitumoral do bevacizumab foi avaliada utilizando um modelo de xenoenxerto de carcinoma mamário felino. Em comparação com o grupo controle, o crescimento agressivo do tumor foi significativamente suprimido no grupo tratado com bevacizumab (Fig. 2). Não foram observados sinais clínicos anormais durante o período de seguimento. No exame histológico dos camundongos, os tumores induzidos mostraram proliferação com padrões tubulopapilares e um padrão sólido com necrose central (Fig. 3A e 3B). As características histológicas foram semelhantes nos grupos tratados com bevacizumab e controle. As células tumorais foram fortemente positivas para o VEGF (Fig. 3C e 3D). Não observamos metástases de células tumorais em outros órgãos, incluindo os linfonodos vizinhos, pulmão ou fígado. A densidade de microvessels αSMA positivos nos tumores formados foi significativamente menor no grupo tratado com bevacizumab do que no grupo controle (Fig. 4A-4C). O índice apoptótico foi significativamente maior no grupo tratado com bevacizumab do que no grupo controle (Fig. 4D-4F). Não houve diferença significativa no índice de proliferação entre os dois grupos (Fig. 4G-4I).
O VEGF desempenha um papel importante no crescimento do tumor, incluindo angiogênese, proliferação e inibição da apoptose mediada por laços autocrinos ou paracrinos entre VEGF e seus receptores. No presente estudo, o tratamento com bevacizumab inibiu o crescimento do tumor por supressão da angiogênese tumoral e aumento da apoptose em um modelo de xenoenxerto de carcinoma mamário felino que expressa VEGF. No entanto, o bevacizumab não mostrou atividade antiproliferativa. Semelhante aos nossos resultados, Fujita et al. relatou os efeitos antitumorais mediados por microvasos decrescentes e aumento da apoptose em modelos de xenoenxerto de carcinoma de células escamosas humanas [6]. Os efeitos semelhantes de uma única terapia medicamentosa do bevacizumab foram relatados em xenotepostos de cancros humanos, incluindo câncer de mama, embora tenham sido observados mais efeitos antitumorais quando a administração de bevacizumab foi combinada com drogas quimioterapêuticas tradicionais [9]. No entanto, não avaliamos os efeitos antitumorais do bevacizumab em combinação com fármacos quimioterápicos tradicionais neste estudo. Estudos adicionais são necessários para esclarecer os efeitos do bevacizumab e terapia combinada em modelos de xenoenxerto de outras linhas celulares de carcinoma mamário felino.
As proteínas VEGF são moléculas diméricas que existem em várias formas devido ao splicing alternativo [7]. Nos tumores mamários felinos, verificou-se que a sobre-expressão do VEGF estava relacionada com a classificação do tumor e angiogênese usando imuno-histoquímica [16]. No presente estudo, o bevacizumab foi fortemente interagido com o dímero de VEGF do que o monómero na linha FKNp, sugerindo que a linha FKNp contém uma alta proporção de VEGF dimérico.
Vários medicamentos antitumorais, como doxorrubicina, mitoxantrona, vincristina e cisplatina, foram avaliados quanto aos efeitos antiproliferativos nas linhas celulares de carcinoma mamário felino. As linhas celulares eram sensíveis aos efeitos inibitórios dessas drogas, embora as respostas variassem [18]. Nos carcinomas mamários felinos, a quimioterapia adjuvante com vincristina e doxorrubicina não foi estabelecida [10, 14]. No entanto, os efeitos antitumorais de fármacos quimioterapêuticos podem ser provocados por anti-angiogênese intratumor e normalização vascular através da diminuição do VEGF [11].
Os inibidores de tirosina quinase de pequena molécula que inibem TK de receptores específicos de alvo (RTKs) e anticorpos monoclonais que inibem um amplo espectro de RTKs foram amplamente utilizados na medicina humana. As terapias anti-angiogênicas mediadas por bevacizumab e inibidores de VEGF RTK, incluindo sunitinib, resultam em regressão tumoral e podem aumentar os efeitos da quimioterapia [8]. Em medicina veterinária, duas pequenas moléculas, toceranib (Palladia®) e masitinib (Masivet®) foram recentemente aprovadas pela Agência Europeia de Medicamentos e pela American Food and Drug Administration para uso em cães com tumores de mastócitos [13, 20]. O Toceranib, um inibidor de multiquinase, que atende a Kit, receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas e VEGFR-2, é aprovado para uso em tumores de mastócitos de grau II / III recorrentes e não resecáveis. Também parece possuir atividade biológica contra outros tumores, como sarcomas de tecido mole e carcinoma mamário, em cães [20]. Em estudos pré-clínicos, uma única administração de bevacizumab demonstrou efeitos anti-tumorais em um modelo de xenoenxerto de hemangiopericitoma canino [15]. No entanto, os efeitos da terapia de alvo molecular contra a angiogênese em tumores felinos permanecem difíceis. Estudos adicionais são necessários para desenvolver terapias anti-angiogênicas mediadas por inibidores de TK, bem como pelo bevacizumab.
Em resumo, o tratamento com bevacizumab suprimiu o crescimento do tumor em um modelo de xenoenxerto de carcinoma mamário felino que expressa VEGF. Portanto, o bevacizumab pode ser útil para o tratamento de carcinoma mamário felino com uma atenção cuidadosa sobre os efeitos clínicos adversos potenciais.
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