Ensaios de Identificação

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ENSAIOS DE IDENTIFICAÇÃO
São métodos analíticos de natureza qualitativa, destinados à 
confirmação da identidade da matéria-prima ou de 
determinado componente de um produto. 
A validade destes ensaios depende da sua especificidade 
ou seletividade.
Podem ser classificados em: físicos ou químicos, ou ainda 
como métodos instrumentais ou clássicos.
Ensaio deve ser:
- específico
- confiável
- baixo custo
- fácil realização
 
Importância:
Considerando que o fármaco é o princípio ativo do 
medicamento, sua identificação é um quesito básico para a 
eficácia e segurança do produto.
Há ainda o risco de adulteração de matérias-primas 
excipientes por outras de menor custo que, embora de 
características semelhantes, poderão acarretar em 
problemas potenciais de formulação.
 
1.Métodos Clássicos:
Baseados em reações químicas de grupos funcionais 
importantes em insumos farmacêuticos.
São ensaios eliminatórios e não confirmatórios, já que várias 
subst. podem apresentar grupos funcionais em comum.
Vantagens:
- Dependendo da seletividade da reação, possibilidade de 
serem aplicados à identificação de fármacos, tanto em 
matérias-primas , quanto em produtos acabados;
- Redução de custos com instrumentação.
Desvantagens:
- Menor sensibilidade;
- Não são aplicáveis a misturas de fármacos com grupos 
comuns.
 
1.1.Reações de identificação:
reações químicas úteis em ensaios 
clássicos de identificação
Devem ser perceptíveis a olho nu:
- mudança de cor (formação de produto colorido
ou desaparecimento de cor do analito ou reagente)
- formação de precipitado
- produção de gás
Exemplos de ensaios de identificação para fármacos:
INSUMO MÉTODO QÚIMICO MÉTODO FÍSICO
AAS
Ácido ascórbico
Lidocaína
Desenvolve cor violeta com FeCl3
Produz pptado cinza com AgNO3
Sol. Etanólica produz pptado verde c/ CoCl2
Infravermelho (IV)
IV, PF, RO
IV, PF
 
REAÇÕES DE 
IDENTIFICAÇÃO PARA:
EXEMPLOS PROCEDIMENTO
Ãnions comuns citrato Tratar amostra com mistura de 15 mL 
de piridina e 5 mL de anidrido acético: 
produz cor vermelho carmim
Cátions comuns cálcio - Sais de cálcio umedecido c/ HCl 
produzem em chama não luminosa cor 
vermelho-alaranjada transitória.
- Sais de cálcio produzem com oxalato 
de amônio, pptado branco insolúvel em 
ác. acético e solúvel em HCl.
Grupos orgãnicos comuns Amidas 
primárias
Sofrem hidrólise em meio ácido ou 
básico forte liberando amônia.
 
1.2. Testes de Solubilidade:
Embora baseado na constante físico-química de solubilidade 
(Ks) e não em reações químicas, apresenta, como os demais 
métodos clássicos de identificação, o fato de também não exigir 
instrumentação analítica. 
É válido como ensaio complementar de identidade.
A solubilidade dos compostos orgânicos pode ser dividida em 2 
categorias principais: 
- a solubilidade na qual uma reação química é a força motriz. Ex: 
reação ácido-base;
- a solubilidade na qual está envolvida a simples miscibilidade. 
Ex: dissolução do éter etílico no tetracloreto de carbono.
 
A avaliação da solubilidade de produtos acabados é um 
parâmetro de grande importância no CQ, especialmente de 
formas farmacêuticas sólidas, contribuindo para o estudo de 
dissolução.
 
1.3. Análise Organoléptica:
A descrição de aspectos físicos da matéria-prima, tais como 
forma e tamanho de cristais ou partículas amorfas, 
granulometria, cor, consistência e odor, está presente em 
todas as monografias.
A análise virtual é o primeiro teste de identificação 
empregado no CQ de matérias-primas. Para medicamento, 
a análise visual é um ensaio de qualidade cuja finalidade 
principal é avaliar a integridade físicae estética do produto.
Não é uma análise conclusiva. Necessita de outros testes.
 
2. Métodos Instrumentais:
São ensaios físicos de identificação baseados em 
espectros, cromatogramas ou medidas diretas de 
propriedades físico-químicas.
Vantagem: sensibilidade e reprodutibilidade
Desvantagem: custo do equipamento
Métodos baseados em espectros são confirmatórios. Porém 
são limitados a matérias-primas relativamente puras, não 
sendo aplicados a produtos, por apresentarem interferência 
dos excipientes ao espectro.
Para métodos baseados em medidas simples e diretas de 
propriedades físico-químicas a interferência é ainda mais 
importante.
 
Comparação entre método baseados espectro e em 
medidas simples de prop. Físico-químicas:
Apesar da vantagem relacionada ao custo baixo dos 
equipamentos como: refratômetro, picnômetro, 
determinador do ponto de fusão; quando comparados aos 
espectrômetros, além de igualmente limitados a matérias-
primas, não são por si só confirmatórios.
Para métodos cromatográficos, devido a característica 
capacidade de separação, destaca-se como grande 
vantagem a possibilidade de sua aplicação, tanto nas 
provas de identidade de matérias-primas, quanto de 
fármacos em prod. acabados.
 
2.1. Identificação via análise de gráficos instrumentais:
Entre os métodos instrumentais de identificação destacam-se 
aqueles cuja interpretação dos resultados se dá por meio de 
análise de gráficos.
Métodos apresentam maior poder conclusivo. Porém, amostras 
devem estar relativamente puras.
Ex: espectros na região do UV-visível e infravermelho, os 
voltamogramas, curvas calorimétricas, espectros de massas, 
RMN, ...
 
UV-VISÍVEL
Os espectros são relativamente pobres sobre a sua 
aplicação à identidade de subst. químicas.
 1-Poucas bandas de absorção típicas de grupos 
cromôforos;
 2-Interferentes;
 3-Sobreposição e alargamento de bandas;
INFRAVERMELHO
Espectro mostra detalhes bem mais expressivos da 
identidade da estrutura molecular.
Por causa das maiores diferenças espectrais, custo baixo, 
bem como facilidade de operação técnica mais 
utilizada na identificação de matérias-primas.
 
RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)
É uma ferramenta conclusiva na identificação e caracterização 
de subst. puras. 
Inviável para em ensaios de rotina: pelo tempo da máquina e 
necessidade de reagentes deuterados ( muito caros).
Utilização: pesquisa na elucidação estrutural de novos fármacos 
e produtos de degradação.
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Método muito caro: aquisição e manutenção do equipamento.
Não aplicada em ensaios de identificação rotineira: alto custo e 
rigor dado à preparação da amostra.
Utilização: caracterização de uma molécula, requer uso de 
equipamentos acoplados ( CG-MS e HPLC-MS)
 
RAIO X
A aquisição de dados em difratometria de raio x é bastante 
dispendiosa no que diz respeito a tempo e investimento.
Utilização: pesquisa na elucidação estrutural molecular.
VOLTAMETRIA
Observa-se a corrente gerada por um analito, enquanto este é 
submetido à varredura de potencial. Entre as informações 
obtidas estão: potencial de oxidação ou redução (pico anódico e 
catódico), reversibilidade de processo redox (proximidade dos 
picos) e número de elétrons envolvidos na transferência de 
cargas (intensidade dos picos).
O voltamograma não é propriamente um espectro, mas poder 
fornecer dados úteis para a identificação química de um fármaco.
Técnica ainda não ganhou espaço no CQ.
 
Espectrômetro de massas Infravermelho
 RMN UV-Visível
 
2.2. Identificação via medidas de constantes físico-
químicas:
Os compostos orgânicos podem ser identificados por meio 
de suas propriedades físico-químicas. Porém, obtém-se um 
valor único , que pode ser passível de coincidência. Assim 
estas medidas, além de limitadas a matérias-primas, 
apresentam menor poder confirmatório.
A determinação da solubilidade pode levar a resultados 
mais conclusivosque a determinação de outras 
propriedades físico-químicas, por causa do número de 
testes efetuados, seja variando solventes, seja temperatura.
 
DETERMINAÇÃO DO PONTO DE FUSÃO
Análise indicativa de pureza e identificação de compostos, 
pois cada subst., por sua estrutura química, apresenta uma 
faixa de fusão característica. 
 A presença de qualquer outra subst. vai alterar o 
resultado.
O PF é uma das propriedades físicas de gde importância na 
área de farmácia, principalmente para a avaliação de 
matérias-primas sólidas utilizadas na indústria de 
medicamentos e farmácia de manipulação.
FUSÃO: subst. estado sólido subst. estado líquido
 temperatura
Se subst. é pura, a temperatura permanece constante 
durante a fusão.
 
Qdo subst. pura muda de estado físico ou estado de 
agregação, a temperatura permanece constante enquanto a 
mudança estiver se processando. 
A vaildade da determinação do PF como ensaio de 
identificação é aumentada quando utiliza a técnica da 
comparação com o padrão.
A presença de impurezas tende a alargar a faixa de fusão e, 
em alguns casos (ex: misturas eutéticas), pode causar 
abaixamento significativo do PF esperado.
Vantagens: 
- simplicidade e rapidez do ensaio;
- baixo custo do equipamento;
 
Os aparelhos comercialmente disponíveis para a 
determinação do PF apresentam-se em 2 configurações: 
banho de imersão e chapa de aquecimento.
Vantagem:
 - do banho de imersão: melhor visualização da transição de 
estado.
 - da chapa de aquecimento: não requer eventuais trocas de 
óleo de silicone, utilizado no banho.
 
DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE ABSOLUTA E
DENSIDADE RELATIVA
A densidade absoluta de uma subst. é definida como a 
massa de uma determinada unidade de volume desta 
subst. em condições padronizadas de pressão e 
temperatura. A unidade internacional é expressa em kg/m3, 
mas a maioria das farmacopéias adota g/cm3 ou g/mL.
A densidade absoluta ou massa específica é uma 
característica própria de cada material, por isso, é uma 
propriedade específica. É definida como a razão entre a 
massa de uma amostra e o volume ocupado por essa 
massa.
d = m/v
 
 Para a determinação da densidade de líquidos são 
empregados densímetros ou balança analítica e 
picnômetro. 
 
 Densímetro Picnômetro
 
Na prática se utiliza a determinação da densidade relativa, que é 
dada pela razão entre densidade da subst. e densidade da água 
a uma mesma temperatura. A temp. empregada usualmente é de 
20oC.
O procedimento para determinação de densidade relativa de 
líquidos está descrito nos métodos gerais de todas as 
farmacopéias. Porém, todos os laboratórios quím. ou 
farmacêuticos de análise devem possuir também o procedimento 
operacional padrão.
A densidade relativa é o número de vezes que uma subst. é mais 
pesada que igual volume de água a uma determinada 
temperatura. Para determinar a densidade relativa de uma 
subst.: dividir o seu peso pelo peso de igual volume de água.
 
Para sólidos, aplica-se a densidade aparente, pois a 
determinação da densidade absoluta ou relativa é 
prejudicada por características da partícula como, 
porosidade, tamanho e forma.
Utiliza-se uma balança e uma proveta para a medida do 
volume ocupado pelo pó. Esse pó deve ser previamente 
compactado.
 
DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE REFRAÇÃO
Método baseia-se na diferença que se pode observar na 
direção de propagação de um feixe de luz entre diferentes 
meios transparentes.
Utilização: -identificação de matérias-primas líquidas;
 -como ensaio qualitativo de pureza; 
 -como ensaio semiquantitativo de teor
 (empregado na detecção de diluições fraudulentas).
Vantagens: rapidez, facilidade de operação, baixo consumo 
de amostra
Aplicações: caracterização de gorduras, óleos, ceras, 
açúcares e análise de pureza de óleos vegetais.
Ex: ácido oléico 1,4585; frutose a 10% 1,3477
 
DETERMINAÇÃO DA ROTAÇÃO ÓPTICA E
ROTAÇÃO ESPECÍFICA
A interação entre matéria e luz pode ser tanto pela absorção 
(UV-vis, IV), quanto pela reflexão (refratometria) de parte da luz. 
Assim, tanto a magnitude quanto o sentido do raio de luz influem 
na dimensão desta interação.
A polarimetria baseia-se no fato de que para algumas subst., a 
extensão dos processos de absorção e reflexão difere para luz 
polarizada de sentidos opostos (esquerda ou direita). Estas 
subst. são chamadas de opticamente ativas e podem ser 
identificadas pela determinação do poder rotatório (alfa), o qual é 
o ângulo que a luz polarizada forma como o plano de polarização 
ao atravessar um líquido ou solução. 
 
Índice de rotação óptica específica ou poder rotatório 
(alfa)20D : relação entre poder rotatório e densidade relativa da 
subst. Líquida, medido a 20oC em polarímetro com tubo de 1dm 
de comprimento, cuja fonte empregue raia D de sódio (comp. 
onda 589,3 nm).
Para sólidos, o poder rotatório específico é determinado em 
relação à concentração da solução (g/mL).
Subst. opticamente ativas podem ser:
- Dextrógiras: desviam a luz polarizada para a direita;
- Levógiras: desviam a luz polarizada para a esquerda;
Aplicações: - ensaios de identificação;
 - avaliação da pureza e valor terapêutico de 
fármacos quirais (apresentam diferenças consideráveis quanto a 
atividade biológica);
Exemplo: frutose a 2% -132 a -92o
 
DETERMINAÇÃO DO pH
Para produtos acabados muito útil como ensaio de 
qualidade, pois diz respeito à biocompatibilidade, estabilidade e 
biodisponibilidade.
Para matérias-primas utilizada como ensaio de identificação. 
O pka é também uma constante físico-química e se relaciona 
diretamente com o pH.
Várias monografias de matérias-primas indicam faixas de pH 
para soluções de amostras preparadas conforme especificação.
Exemplos: 
ác. ascórbico a 5% pH esperado: 2,1-2,6
 nistatina a 3% pH esperado: 6,0-8,0
 
2.3. Identificação via análise de cromatogramas:
A aplicação primária de cromatografia líquida de coluna 
está na separação de subst., cujas características de 
polaridade e/ou peso molecular são distintas.
A separação ocorre em função de afinidade que as 
diferentes subst. têm por uma fase móvel e outra 
estacionária. Estas afinidades diferenciadas podem ser 
exploradas para fins analíticos, especialmente em ensaios 
de identificação. 
Tempo de retenção (tr)= tempo que o analito leva para 
passar pela coluna cromatográfica.
Distância de retenção (dr) = distância percorrida pelo analito 
na cromatografia de papel.
 
 
tr e dr 
 
Relacionados com o tipo e a intensidade das 
interações do analito com a fase estacionária.
Relacionados com a estrutura química do analito, 
com os grupos de interação da fase estacionária
e com as características químicas da fase móvel. 
Conjunto das relações físico-químicas da: FM, FE e 
analito que promovem a retenção diferencial
 
 
Se as condições físicas (temperatura, pressão...) e químicas 
(grupos de interação, concentração, composição) tanto da FM 
como da FE, forem sempre as mesma, o tr e o dr de um analito 
devem ser, teoricamente, sempre os mesmos.
 Desta forma, é possível identificar compostos 
desconhecidos pela comparação do seu tr ou dr com o tr ou dr 
apresentados por padrões.
Tr e dr não são totalmente confiáveis porque muitos compostos, 
principalmente isômeros, possuem suas propriedades físico-
químicas muito parecidas, quando não idênticas, o que faz com 
que os compostamentoscromatográficos deles sejam 
exatamente iguais.
 Para reduzir erros: utilizar cromatografia por gradiente 
ou a cromatografia de papel bidimensional.
 
A mudança da composição da FM por meio de gradiente 
altera as características físico-químicas do sistema 
cromatográfico e diminui as chances de haver outro 
composto que responda da mesma maneira que o 
composto de interesse.
Outra alternativa para resultados mais seguros: utilização 
de sistemas de detecção mais seletivos e adequados.
Uso de cromatógrafos de alta eficiência (HPLC): técnica 
analítica mais empregada em CQ pelas indústrias 
farmacêuticas. 
 - Para ensaios de identificação não são tão utilizados pois, 
existem técnicas satisfatórias de menor custo.
 
Desvantagens do HPLC em ensaios de identificação:
 - Para maior confiabilidade em ensaios de identificações é 
necessário uso de padrões. São de custo elevado;
 - Elevado custo dos solventes ¨grau HPLC¨; 
 - tempo de análise;
 - manutenção de equipamento;
 - ausência de detectores universais.
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