BIOMOL - ESpectrofotometria, PCR, Southern blot

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BIOMOL - PRIMEIRA PROVA 
Espectrofotometria → Técnicas de hibridização
 OU
Espectrofotometria → PCR → Eletroforese → Sonda de Nucleotídeos
ESPECTROFOTOMETRIA
Metódo analitico que se baseia na interação da matéria com energia radiante.
Um feixe de energia atravessa a solução e sua absorção oferece informações sobre a qualidade e quantidade dos componentes presentes.
Objetivo: saber a concentração de DNA em uma solução de volume conhecido.
Passo a passo:
I- Passar um feixe de luz UV de comprimento de onda 260nm pela solução (esse comprimento é utilizado, pois é o mais absorvido pelas bases nitrogenadas)
Obs: fitas simples possuem as bases nitrogenadas expostas e portanto possuem maior absorbância.
II- Utilizar um galvanômetro que irá transformar a absorbância em valores. 
Resultado
Utiliza-se a seguinte relação: Se a densidade óptica for igual a 1 existem 50 microgramas de DNA para cada mL de solução.
SUPOSIÇÃO: Faz-se a espectrofotometria para saber a quantidade de DNA existente (concentração) para então saber a quantidade de PCR ou Sondas de ácido nucléico a serem colocadas.
 PCR (MATÉRIA DA PRÓXIMA PROVA)
A PCR pode ampliar seletivamente uma única molécula de DNA ou RNA várias milhões de vezes em algumas horas.
Permite a detecção e a análise de genes específicos na amostra de uma paciente sem a necessidade de clonagem e hibridização (ou seja, usa-se hibridização OU o PCR antes de prosseguir com a eletroforese)
TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO
A hibridização de ácidos nucleicos envolve a mistura de DNA de duas fontes desnaturadas (pelo calor ou por uma solução alcalina), para que as fitas duplas de DNA se transformem em fitas simples, permitindo o pareamento das bases complementares de sequências homólogas (como o DNA e a sonda). 
A marcação com uma sonda irá permitir a identificação das sequências específicas do DNA em estudo. Sondas são segmentos específicos de DNA (fita simples) que reconhecem e hibridizam-se com sequências complementares. As sondas são marcadas com radioisótopos, enzimas ou moléculas quimioluminescentes para que possam ser identificadas posteriormente.
As principais técnicas de hibridização são:
Southern blotting (STH): Técnica que permite detectar um fragmento específico de DNA em uma amostra.
Passo a passo:
I - Faz o tratamento (clivagem) de DNA genômico com enzimas de restrição (endonucleases de restrição). A enzima reconhece uma sequência curta (4 a 8 nucleotídeos) e específica de DNA de fita dupla, clivando-a. (Geralmente a sequência alvo da clivagem é um palíndromo, ou seja, pode ser lida da mesma forma 5´para 3´ou 3´para 5´ - “ATAATA”).
Dois tipos de enzimas:
a) extremidades coesivas ou adesivas: corta o DNA de forma assimétrica. Ex. EcoRI
b) extremidades cegas ou obtusas: corta o DNA de forma simétrica (com extremidades retas). Ex: Bal I, Sam I.
PS. para cortar precisa reconhecer toda a fita de DNA, então será cortado um lugar
específico da sequência.
II - Depois de clivar com enzima de restrição coloca-se o gel de agarose para fazer a eletroforese (separação dos fragmentos de acordo com seu tamanho - números de pares de bases PB). 
III - O gel de agarose é muito quebradiço para se trabalhar, então os fragmentos são transferidos, por ação capilar, do gel para uma membrana de nitrocelulose ou nylon (é a cópia do gel, só que mais maleável).
Obs: Pode-se confirmar que houve a transferência dos fragmentos se depois de olhar o gel com a luz UV não houver fragmentos.
IV - Bloqueio da membrana com DNA inespecífico: a membrana tem alta afinidade por qualquer tipo de DNA, logo coloca-se um DNA inespecífico (tipo DNA de peixe - esperma de salmão) para cobrir os espaços “vazios” do papel, bloqueando-os para a sonda não se ligar nesses espaços e sim no fragmento de DNA específico e complementar a ela. 
V - Desnatura-se os fragmentos de DNA de fita dupla por meio de aumento da temperatura ou mudança de condições do solvente (por exemplo, colocar uma solução alcalina), transformando o DNA fita dupla em fita simples. Isso é crucial para que a sonda possa se ligar ao seu fragmento complementar de DNA.
VI - O DNA desnaturado é incubado com uma sequência complementar para o gene de interesse (sonda). A sonda mostrará se tem ou não o fragmento com determinada sequência complementar a ela, para isso ela é marcada com radioisótopos, quimioluminescentes, etc.
VII - Lavagem da membrana e exposição em filme radiográfico para posterior interpretação. 
Northen Blotting (NTH): Semelhante ao STH blotting, mas por trabalhar com RNA e não DNA, não há a fase de “clivagem” pelas enzimas de restrição (RNA tem menor número de bases que DNA), sendo separado diretamente pelos seus diferentes tamanhos na eletroforese. A sonda também será RNA. 
Western Blotting: 
Usa-se essa técnica para obter informações sobre o tamanho e quantidade de uma proteína mutante em extratos celulares de pacientes com doenças genéticas.
Proteínas isoladas são separadas por tamanho (eletroforese) e depois são transferidas para um filtro de nylon. Esse filtro contendo as proteínas é incubado com antissoro do paciente (plasma + anticorpos) que reconhece especificamente a proteína a ser analisada (por exemplo, se a proteína a ser analisada for a do HIV, o portador terá anticorpos que irão se ligar). Para saber se a interação do anticorpo e seu antígeno ocorreu, ou seja, se a pessoa possui o anticorpo (e, portanto, porta o antígeno), liga-se um segundo anticorpo (um anti-anticorpo) marcado (sonda), que pode ser visualizado por diversas técnicas, como autorradiografia.
ELETROFORESE 
Usada para separar moléculas com base em seu tamanho e carga elétrica.
 - Passo a passo:
I - A eletroforese em gel de agarose separa moléculas de DNA. Esse gel é poroso e deve ser derretido em uma solução tampão, e após deve ser colocado em um recipiente de plástico. Ao resfriar, o gel adquire forma semelhante a uma gelatina dura.
II - Deve-se fazer pequenos poços na extremidade do gel, para que possa ser colocada a solução dos fragmentos de DNA. Para que sejam melhor visualizados, deve-se acrescentar corante (azul de bromofenol, brometo de etídeo, etc) que adquire cor fluorescente quando exposto a UV, facilitando a identificação das bandas. Para que o DNA passe por dentro do gel (nem acima nem abaixo) é colocado, também, o glicerol, substância que se ligará à amostra dando “peso” a esta.
III - Faz-se passar uma corrente elétrica pelo gel. Devido ao grupo fosfato de carga negativa dos nucleotídeos do DNA, os fragmentos migram para extremidade positiva do gel (os menores avançam mais rapidamente do que os maiores). Desse modo, os fragmentos são separados de acordo com o seu tamanho, ficando os maiores mais próximos do ponto de aplicação já que migram mais lentamente.
IV- Usando, para termos de comparação, um fragmento padrão de tamanho conhecido em outro poço e comparando a distância de migração dos fragmentos desconhecidos com a distância percorrida pelos fragmentos conhecidos, pode-se saber o tamanho aproximado de cada fragmento desconhecido.