Biotecnologia em Farmácia - Genes, Terapia gênica, DNA

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Biotecnologia - Farmácia
UNIMEP - 2018
 Profa. Dra. Margarete de F. Costa
 REVISÃO DE CONCEITOS 
 crescimento
 divisão celular
 especialização
MATÉRIA VIVA → CÉLULAS movimento
 ↓ interação
 menor unidade de vida
BIOLOGIA MOLECULAR → descrição das estruturas, funções e interações das macromoléculas.
Biotecnologia = conjunto de tecnologias que utilizam células e moléculas biológicas
 ↓
Gera grande especificidade de interações
↓
Ferramentas da biotecnologia são muito precisas e foram desenvolvidas para operar de forma conhecida e previsível
↓
Qualquer uma das biotecnologias pode produzir uma grande variedade de produtos, cada uma com aplicações diferentes!!!!
As propriedades de um organismo → dependem de suas células individuais;
A continuidade se dá através do material genético!!
Formas mais simples de vida → unicelulares (propagação por divisão celular)
Organismos superiores → pluricelulares (com funções especializadas)
Células – nos diferentes organismos são similares quanto à estrutura e constituintes moleculares.
Constituintes moleculares → considerar: 
- Propriedades individuais das moléculas, interações entre elas e localização nas células.
Ribossomos
Nucleoide (DNA compactado)
Pili
Flagelo
Envelope celular (membrana)
Célula procariótica (bactérias):
Não tem organelas (núcleo, mitocondrias, etc)
Material genético compactado no nucleóide (não compartimentalizado)
Cromossomo único, circular fechado (na maioria das bactérias, ex: Escherichia coli)
5
Nucleóide expelido de um célula bacteriana lisada:
Alças de uma fibra
Nucleóide da Bactéria
Célula eucariótica:
Organelas (núcleo, mitocondrias, cloroplastos, etc)
Material genético compactado no núcleo
Cromossomos lineares
Ribossomos
Envelope nuclear
Núcleo
Ribossomos
Mitocondrias
Cloroplasto
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Célula eucarionte ao microscópio eletrônico
MATERIAL GENÉTICO
É a estrutura que contenha a informação hereditária → características!!!
Deve ser:
Estável;
Capaz de se expressar nas células sempre que necessário;
Ter replicação precisa;
Ser transferido de forma inalterada dos genitores para a prole.
Questões:
1. Como sabemos que o DNA é o material genético?
2. Quais propriedades do DNA o tornam adequado para funcionar com esta capacidade??
Descobertas:
Antes da Biologia Molecular – início dos estudos sobre as propriedades das células vivas.
1800 – estudos mostram a importância do núcleo para a hereditariedade;
1869 – Miescher – núcleo dos leucócitos continha um componente químico único → nucleína – rica em fósforo (ao contrário das proteínas, não continha enxofre) – posteriormente esta substância foi identificada como DNA;
Fusão de núcleos → gametas – condição para originar a célula ovo;
Núcleo das células contém cromossomos → duplicam antes da divisão celular (manutenção do número de cromossomos nas células filhas);
Gametas – com metade do número de cromossomos – com a fusão dos gametas o número de cromossomos da espécie é reconstituído.
CONCLUSÃO: 
O núcleo tem o papel primordial na hereditariedade; o núcleo contém cromossomos; os cromossomos contém componentes da hereditariedade que poderiam levar à informação genética?
QUAL A NATUREZA QUÍMICA DO MATERIAL GENÉTICO??
1928 – Griffith – Princípio da Transformação!!
Como se descobriu a natureza química do material genético ?
A transformação genética
1928 – Frederick Griffith estudou a “transformação” de cepas da bactéria Diploccocus pnuemoniae não patogênicas em patogênicas.
(1881-1941)
Deste fato, podia-se ter duas explicações:
1. As bactérias S mortas haviam ressuscitado, o que seria um absurdo.
2. As bactérias R haviam sido transformadas em bactérias S por algum tipo de substância liberada pelas bactérias mortas.
Essa substância foi chamada de “princípio transformante” e essa transformação das bactérias R em S, foi chamada de transformação bacteriana.
O princípio transformante:
O experimento original de Griffith foi repetido com sucesso em vários laboratórios.
No entanto, sua elucidação só aconteceu em 1944, após anos de estudos de Oswald Avery (1877 – 1955) e seus colaboradores. Eles descobriram que a transformação das bactérias ocorria também in vitro (em um meio de cultura, fora do corpo do camundongo), e que, em uma cultura com bactérias R e bactérias S (mortas pelo calor), apareciam células S vivas.
O material genético
(1877-1955)
O princípio transformante (1944) – Oswald Avery; C.M. MacLeod e McCarty estudaram a “decomposição das células “S” e teste da capacidade infectiva de cada componente 
Assim, em 1944, Avery e seu colaboradores, chegaram à conclusão de que a substância transformante era o DNA.
O princípio transformante
Estrutura do DNA
out/2007
18
DNA é um polímero em forma de hélice dupla.
Hoje – DNA é o material genético (maioria)
Obs. Alguns bacteriófagos têm RNA como material genético.
DNA E RNA = Ácidos Nucléicos
↓
MACROMOLÉCULAS
↓
Nucleotídeos
Ácidos Nucléicos
Pirimidina
Purina
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James Watson e Francis Crick (1953)
DNA – A dupla hélice
James Watson – com o modelo original do DNA
ESTRUTURA DO DNA
Rosalind Franklin
Uracila
Timina
Citosina
2´desoxirribose
Ribose
Adenina
Guanina
Ácido fosfórico
Componentes dos ácidos nucleicos
Ribonucleotídeo
32
Desoxirribonucleotídeos
33
34
CARACTERÍSTICAS DO DNA
DNA → fita dupla;
 fitas complementares;
 em hélice;
 fitas antiparalelas (polaridades opostas)
DNA fita dupla: cadeias antiparalelas
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Dupla hélice de DNA:
Watson-Crick, 1953
Sulco maior
Sulco menor
43
44
FORMAS DO DNA
DNA - conformações: A-DNA, B-DNA e Z-DNA. 
A-DNA E B-DNA - a hélice gira para a direita, e a diferença entre elas está na distância necessária para fazer uma volta completa da hélice e no ângulo que as bases fazem com o eixo da hélice. 
A-DNA tem a forma mais curta e mais grossa, e para completar uma volta na hélice são necessários 11 pares de bases; enquanto no DNA do tipo B são necessários 10 pares de bases para completar uma volta na hélice, além disso, a dupla hélice é mais longa e mais fina. 
Em solução, geralmente o DNA assume a conformação B. Quando há pouca água disponível para interagir com a dupla hélice, o DNA assume a conformação A-DNA. 
Z-DNA - apresenta seu sentido de rotação para a esquerda. Esta conformação é mais alongada e mais fina do que o B-DNA. 
Para completar uma volta na hélice são necessários 12 pares de bases. O DNA, em solução com altas concentrações de cátions, assume a conformação Z-DNA. 
Em eucariotos o DNA tende a assumir a conformação Z-DNA devido a metilação do DNA. 
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AINDA DNA PODE SER:
CIRCULAR – cadeia fechada (procariontes)
LINEAR – cadeia aberta
Tamanho do genoma
Genoma – variável em relação ao nº de pares de bases (pb) →
Nº pb= valor c (quantidade de DNA)
Procariontes – c varia de 105 a 107pb
Eucariontes – c varia de 107 a 1011pb
Valor c → complexidade do genoma → não há correlação!!!!
A complexidade do genoma não tem a ver com a quantidade de material genético (pb), mas sim com a expressão dos genes.
Existe uma impossibilidade de correlacionar complexidade do organismo com o tamanho do genoma → PARADOXO DO VALOR c.
Ex. humanos – 25.000 genes → 100.000 tipos de proteínas!!!!
EMPACOTAMENTO DO DNA NOS PROCARIONTES
CROMOSSOMO – abriga um segmento de DNA
BACTÉRIAS – somente um cromossomo:
DNA desnudo – não associado à proteínas;
Molécula de DNA fica presa em um núcleo/cerne de proteínas (nucleóide);
DNA
– só segmentos éxons (sem íntrons)
EMPACOTAMENTO DO DNA NOS EUCARIONTES
DNA linear, 
DNA associado a proteínas (maioria histonas) – compactar dentro do núcleo e também com papel na expressão de genes;
DNA com segmentos éxons e íntrons
CROMOSSOMOS AO MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
TELÔMEROS
PARTES DO CROMOSSOMO:
Telômeros – sequências especializadas de DNA, com centenas de cópias de uma curta sequência repetida (p.ex. humanos – 5’TTA GGG3’);
Constrição primária (centrômero) – com genes que codificam proteínas que formam placas protéicas (cinetocórios) – se ligam nessa região do centrômero na separação das cromátides, na divisão celular;
Constrição secundária – com genes repetitivos = DNA satélite (útil em taxonomia).
ESTABILIDADE DO DNA
Molécula estável – para não ocorrer quebras e evitar mutações.
Estabilidade do DNA → empilhamento das bases e ligações fosfodiéster.
Empilhamento das bases: bases são
Hidrofóbicas e fosfatos hidrofílicos.
Hidrofobia – evita presença de 
enzimas – também auxilia na
Estabilidade.
DESESTABILIZAÇÃO DO DNA
EFEITO DE ÁCIDOS 
ácidos fortes (HCl4 – perclórico) + altas temperaturas
 ↓
Hidrólise dos ácidos nucléicos
Ácido mineral diluído (pH – 3 a 4) → quebra mais seletiva de ligações (p. ex. ligações glicosídicas das bases púricas do açúcar).
EFEITO DE ÁLCALIS
Aumento de pH – 7 a 8 → causa mudanças sutis no estado tautomérico das bases.
Esses processos → DESNATURAÇÃO DO DNA
DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO DO DNA
 ↓
 Separação e reanelamento das fitas de DNA
 ↓
Fenômenos fundamentais para os processos de replicação do DNA (antes da divisão celular)
DESNATURAÇÃO – ocorre quando as pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares de DNA são rompidas e as fitas se separam;
RENATURAÇÃO – inverso da desnaturação
“In vivo” – Duplicação do DNA utiliza enzimas
“In vitro” – Processos físicos (altas temperaturas) e químicos
Tm= Temperatura de fusão
50% da molécula de DNA está desnaturada
Efeito hipercrômico
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REPLICAÇÃO OU DUPLICAÇÃO DO DNA
Ocorre antes dos processos de divisão celular;
Permite: transferência do material genético;
 continuidade;
 hereditariedade
DNA – a maioria é bifilamentar → complexidade na duplicação!!
Replicação do DNA
O mecanismo de replicação está baseado no pareamento das bases da dupla hélice do DNA.
A estrutura do DNA contém a informação necessária para perpetuar sua sequência de bases
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A replicação do cromossomo circular - PROCARIONTES
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Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação
Replicon: 
Origem + Término
Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular
O genoma de uma célula procariótica constitui um único replicon
Cada cromossomo eucariótico constitui vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente
O genoma eucariótico constitui vários replicons
 A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000pb/min
 Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes
 Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somática
Fita contínua (líder)
Fita descontínua
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Desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato (precursor)
Fita sendo polimerizada
Fita molde
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ENZIMAS QUE ATUAM NA REPLICAÇÃO DO DNA
DNA polimerase → δ (sigma) – cadeia contínua (longa)
 α (alfa) - cadeia descontínua (curta)
Funções: reconhecer as Ori; polimerizar as novas fitas; promover a correção de alguns “erros”;
2. RNA primase – polimerização dos iniciadores (primers);
3. RNAse H – remoção dos iniciadores;
4. Nucleases reparadoras – cortam o DNA nos locais onde o segmento duplicado está incorreto;
5. Helicases – promovem o rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas (abertura do DNA);
6. Topoisomerases e girases – desenrolam e enrolam a molécula de DNA;
7. DNA ligases – ligam segmentos de DNA
As histonas (proteínas) dos nucleossomos são codificadas por um grupo de genes (20 a 50), e são transcritos simultaneamente na fase S (do ciclo celular).
TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO DO DNA
Síntese e Processamento de Proteínas
Transcrito primário
mRNA maduro
Proteína (inativa)
Tradução
Transcrição
Processamento pós-transcricional
Dobramento
Modificações covalentes nos aminoácidos
Processamento
pós-tradução
Proteína ativa
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RNA – sintetizada pela RNA polimerase;
Tipos de RNA: RNA mensageiro
 RNA transportador
 RNA ribossômico
RNA: fita simples (unifilamentar);
 segmento curto;
 bases nitrogenadas: adenina, citosina, guanina e uracila
 RNTPs – ribonucleotídeos trifosfatados = precursores das bases
 açúcar da base = ribose
 RNAs – sintetizados à partir de uma fita molde de DNA (não há necessidade de um primer ou iniciador)
 
ESTRUTURA DO RNA
Gene – segmento de DNA que codifica um polipeptídeo
Procarionte
Eucarionte
Gene: 
Região reguladora – controla a expressão do conjunto de genes de uma mesma via metabólica (são sequências de nucleotídeos sem codificação para proteína);
Região promotora – sequência de nucleotídeos que irá reagir com a RNA polimerase permitindo o início da transcrição;
Região finalizadora (terminador) – fica após o último gene, reconhecida pela própria RNA polimerase e ação da enzima rô promove o desligamento do RNA sintetizado.
TRANSCRIÇÃO NOS EUCARIONTES
Transcrição – ocorre no núcleo (separado da tradução) → primeiro transcreve no núcleo e depois o RNA vai para o citoplasma.
3 classes de RNAs polimerases (enzimas que sintetizam os diferentes RNAs):
RNA polimerase I – RNA ribossômico;
RNA polimerase II – RNA mensageiro;
RNA polimerase III – RNA transportador.
RNAs → atuam em conjunto nos processos de síntese protéica
 e, somente o RNAm é degradado após várias leituras, 
 o RNAt e o RNAr são reciclados.
DNA eucarionte – possui éxons (segmentos codificantes) e íntrons (segmentos não codificantes);
Região reguladora controla um único gene;
Cístron = segmento de DNA com região codificadora de uma cadeia polipeptídica + iniciador + terminador.
Região reguladora é específica para cada tipo de gene.
No RNA – pontos 5’ e 3’ apresentam modificações (regiões surgem após a transcrição):
5’ = CAP → capuz de nucleotídeos = proteção contra ação de nucleases e pode ser o local de reconhecimento do ribossomo (início da tradução). Radicais metil podem se ligar neste local e inativar a tradução.
3’ = Poli A → 250 adeninas
Quatro etapas são importantes para a transformação do pré-RNA em RNAm: 
Retirada dos íntrons - Os introns não deverão passar para o citoplasma, porque não irão ser traduzidos em proteínas. Isto é o que se denomina de economia celular. 
Ligação dos éxons – Os éxons ligados originarão a sequência correta de nucleotídeos que é a informação para originar a cadeia polipeptídica. 
A adição do CAP – Uma molécula de 7-metil-guanosina é adicionada na extremidade 5’ do pré- RNA com a finalidade de direcionar o RNAm até os ribossomos. 
A adição da cauda de Poli A – Várias sequências de adenina são adicionadas na extremidade 3’.
CLASSES DE RNA
RNAs – todos são sintetizados à partir do DNA e são unifilamentares;
Bases – A, C, G, U
RNA mensageiro (RNAm) 
sintetizado pela RNA polimerase II;
Determina quais são e a sequência de aminoácidos em proteínas específicas, e é transcrito à partir de um segmento do DNA. A sequência de bases é lida em grupos de 3 nucleotídeos = códons;
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b. RNA transportador (RNAt): 
Transcrito à partir do DNA pela RNA polimerase III;
Constitui um segmento curto de 73 a 93 nucleotídeos;
Com 3 bases
livres = anticódons (reconhece o códon no RNAm)
Na extremidade 3’ –OH → sítio de ativação do aminoácido – ponta CCA (enzima aminoacil – que retira a hidroxila e se liga ao aminoácido);
Função: reconhece e se liga ao aminoácido específico e transporta até o RNAm.
RNAt = estrutura secundária com grampos e alças formando um trevo e com alto número de bases modificadas depois da sua transcrição.
Para cada tipo de aa. Existe uma enzima aminoacil-RNAt-sintetase específica.
RNAt ativado – quando carregado com um aa. Específico.
RNAt
-Estrutura secundária com grampos e alças formando um trevo
-Alto número de bases modificadas depois da sua transcrição
c. RNA ribossômico (RNAr);
Sintetizado à partir da RNA polimerase I;
Se associa com proteínas/enzimas – formando o ribossomo;
Ribossomo – tem 2 subunidades – específico para procariontes e eucariontes.
Ribossomo bacteriano
70S (2,7 x 106)
Ribossomo Eucariótico
80S (4,6 x 106)
CÓDIGO GENÉTICO E SÍNTESE PROTÉICA
DNA e RNA são → constituídos por 4 bases distintas.......
 
As proteínas são constituídas por 20 aminoácidos diferentes....
 
Como se resolve esse problema de “escala”? 
Combinações de + de 1 nucleotídeos: 
1 “letra” = 2 nucleotídeos 42 = 16 insuficiente 
1 “letra” = 3 nucleotídeos 4 3 = 64 suficiente 
Cada aminoácido deve ser codificado por, pelo menos, 3 nucleotídeos → CODON 
2a. Letra do códon
1a. Letra do códon
Degeneração do código genético
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Etapas da síntese de proteínas
1. Ativação do aminoácido
2. Iniciação
3. Elongação
4. Terminação
5. Dobramento/processamento pós-tradução
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RESUMINDO → SÍNTESE PROTÉICA:
1º Ativação dos aminoácidos e carregamento dos RNAs transportadores – aminoacil RNAt-sintetase;
2º A extremidade 5’ do RNAm se combina com a subunidade menor do ribossomo, que contém o códon de iniciação metionina (nos eucarionte é a N-formil-metionina), se ligando o RNAt com o anticódon correspondente ao códon do RNAm;
3º A subunidade maior do ribossomo se liga ao mensageiro, e o códon de iniciação e o segundo códon ocupam, respectivamente, os sítios P e A do ribossomo. Nos ribossomos vai ocorrer a ligação peptídica entre os aminoácidos (2 a 2), pela enzima aminoacil sintetase;
4º A leitura progride códon a códon, na direção 5’ → 3’, até o códon de terminação. Um fator de liberação se liga ao ribossomo, finalizando a tradução. Ocorre o desprendimento do ribossomo.
FATORES DE TRANSCRIÇÃO
São necessários para o início da transcrição:
A) Proteínas:
Basais – interage com a região promotora do gene (são iguais para todos os genes) – presentes em todas as células.
Específicas (facultativas) – interage com a região reguladora do gene (uma para cada gene) – presentes nas células que produzem a proteína específica. 
Os fatores de transcrição basais e específicos, após se unirem nas regiões reguladora e promotora do gene, ocorre o dobramento do DNA e a interação entre as duas regiões, permitindo a inserção da RNA polimerase II e a transcrição do RNAm.
O surgimento dos organismos pluricelulares só foi possível após o surgimento do cromossomo eucarionte, que se diferencia do procarionte por possuir extensas regiões ou domínios regulatórios, que são sensíveis a uma ampla gama de proteínas reguladoras. 
Estas proteínas são bastante variáveis entre diferentes espécies e tecidos de uma mesma espécie, indicando a grande complexidade dos domínios regulatórios dos cromossomos eucariontes, que podem se localizar, por vezes a uma considerável distância do gene estrutural.
B) Histonas – promovem o empacotamento do DNA (compactação).
Acetil se liga a cromatina → se expressa (eucromatina)
Acetil não se liga a cromatina → não expressa (heterocromatina) .
Enzimas - acetiltransferase → adiciona acetil
 desacetilase → retira acetil
Acetilação/desacetilação de Histonas controlam a atividade da cromatina
Cromatina Ativa é mais sensível ao tratamento com nucleases.
C) Metilação do DNA (CH3)
Metil (CH3) – pode se ligar à molécula de DNA e tem preferência pela citosina (seguida de uma guanina) – metilcitosina. 
Este mecanismo impede a transcrição do gene.
Regulação da atividade gênica em eucariontes
Corpo → + de 200 tipos (muscular, hepático, 
Humano celulares nervosa, epitélio....)
 ↓
 Diferentes na morfologia e funções
 ↓
 Com a mesma informação genética
Células diferentes em um mesmo organismo surgem pela expressão diferencial de um genoma idêntico
Porque controlar a expressão gênica?
Complemento total de genes de uma única célula → grande quantidade de informação biológica
 ↓
 Informação que é requisitada todo tempo 
Ex. transcrição de RNAr e genes das proteínas ribossomais; genes da RNA polimerase; genes das vias metabólicas básicas...
 ↓
Genes de manutenção (house keeper) → ativos o tempo todo;
Em todas as células do organismo: proteínas essenciais para a manutenção da vida, normalmente envolvida em processos básicos como geração de energia, replicação e manutenção do material genético. Esses genes são chamados house keeping genes
Genes com papéis especializados - Regulados → informações são necessárias em situações específicas.
Genes expressos em alguns tecidos, cuja função está diretamente relacionada à função do órgão/tecido
Genes expressos em somente um tecido, de função altamente especializada. Ex: β-globina é expressa somente em eritrócitos
Genes expressos em somente uma célula, e todas as células clonais descendentes dessa progenitora. Ex: maturação de anticorpos em linfócitos B durante a resposta imune tardia.
Todos os organismos são capazes de regular a expressão de seus genes → genes de proteínas que não são utilizados são desligados.
Regulação gênica (síntese controlada) para:
Adaptação celular;
Variação;
Diferenciação;
Desenvolvimento
EUCARIONTES – com mecanismos complexos de regulação para expressar um gene em um tipo celular.
Respostas à mudanças ambientais são restritas (exceto em unicelulares - leveduras)
Organismos pluricelulares – células respondem à estímulos originados dentro do organismo:
Hormônios;
Fatores de crescimento;
Vários tipos de moléculas regulatórias.
Hormônios:
Esteróides – moléculas pequenas que penetram nas células;
Polipeptídeos – se ligam à um receptor na superfície da célula.
* Esteróides – formação de um complexo receptor-hormônio no citoplasma → vai para o ´núcleo e reconhece sequências regulatórias específicas → ativação e transcrição de alguns genes.
* Polipeptídeos – a ligação nos receptores de membrana desencadeia uma cascata de eventos intracelulares → controle da expressão gênica de formas variadas.
Existem proteínas que são liberadas em certas células e agem em células vizinhas ou longe → Ex. fatores de crescimento.
Obs. Atualizando, são aproximadamente 25.000 genes
NOVA DEFINIÇÃO DE BIOTECNOLOGIA :
 UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS E MOLÉCULAS BIOLÓGICAS PARA A SOLUÇÃO DE PROBLEMAS OU PRODUÇÃO DE PRODUTOS ÚTEIS
ENZIMAS CELULARES UTILIZADAS EM BIOTECNOLOGIA
DNA polimerases – copiam o DNA – sintetizam uma nova fita simples que é complementar à fita molde da molécula original → adicionando novos nucleotídeos à extremidade 3`da fita em crescimento. Requer um iniciador (primer) – RNA – à partir deste os novos nucleotídeos são adicionados.
Isoladas de vários organismos – os mais importantes são os que vivem em temperaturas extremas (usadas em PCR)
RNA polimerases – leêm uma sequência de DNA e sintetizam uma molécula de RNA complementar. Requerem uma sequência inicial de bases chamada Promotor – sinaliza onde começa a transcrição.
Não necessitam de iniciadores (primers).
DNA ligases – combinam fragmentos de DNA ou RNA pela formação de novas ligações
fosfodiéster entre os fragmentos.
TRANSCRIPTASE REVERSA – leêm uma sequência de RNA e sintetizam uma sequência de DNA complementar (cDNA);
São produzidas por vírus RNA – convertem seu genoma RNA para DNA, quando infectam a célula hospedeira.
Esta enzima permitiu aos cientistas sintetizar genes do DNA à partir de um RNAm;
Útil para trabalhar com genes eucarióticos (por possuírem íntrons).
W. Alber
H. Smith
D. Nathans
Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre que identificar uma seqüência particular de nucleotídeos que seja o sítio de restrição da enzima;
Descritas em 1970,
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
4/23/2018
127
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Função Natural: proteger o DNA bacteriano do DNA exógeno 
4/23/2018
128
A enzima BamHI reconhece a sequência dupla fita:
- reconhecem sequências específicas de nucleotídeos no DNA, atuando como verdadeiras tesouras moleculares
BamHI
4/23/2018
129
BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H
5’ G/GATCC 3’
EcoRI - Escherichia coli R
5’ G/AATTC 3’
HaeIII - Haemophilus aegyptius
5’ GG/CC 3’
PstI - Providencia stuartii
5’ CTGCA/G 3’
Nomenclatura
4/23/2018
130
 370 C, 1 hora, com tampão adequado
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
EcoRI
4/23/2018
131
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Tipos de cortes: 
- Produção de terminais coesivos (adesivos, protuberantes) 
- Produção de terminais abruptos (ou cegos)
4/23/2018
132
4/23/2018
134
 370 C, 1 hora, com tampão adequado
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
EcoRI
4/23/2018
135
Vetores
Hospedeiros
Utilização
Plasmídeos
Cosmídeos
Virus 
Bactérias / leveduras
clonagem
Terapia gênica
Células eucarióticas
Bacteriófagos
A) Plasmídeos 
São moléculas de DNA extracromossômico, circulares, bifilamentares → bactérias.
A maioria replica automaticamente;
Muitos têm genes para resistência à antibióticos (marcadores selecionáveis ideais) – ampicilina, tetraciclina
São usados para clonar fragmentos de DNA de 1kb até 15kb.
Tipos de Vetores
140
Vetor de Clonagem Plasmidial
Componentes básicos de vetor plasmidial de clonagem
Região de Múltiplos Sítios de Clonagem
Vetor Plasmidial de Clonagem
141
Vetor de Clonagem Plasmidial
pBR322: plasmídio para clonagem em Escherichia coli (1977)
1-Origem de replicação em E. coli (10 a 20 cópias do plasmídio por célula)
2-Genes que conferem resistência a antibióticos
3-Sítios únicos para diferentes endonucleases de restrição
142
Vetor de Expressão em Eucariotos
VETORES PLASMIDIAIS
4/23/2018
143
B) Bacteriófago
A maioria à partir do cromossomo do fago do Bacteriófago λ que possui 48.502 pares de bases;
Utilizados para clonar fragmentos de DNA até 23 kb;
Clonagem do DNA no Bacteriófago λ é baseado em duas carcaterísticas-chave do genoma do λ: a) um terço do genoma não é essencial e pode ser substituído pelo DNA estranho b) moléculas do DNA recombinante podem ser embaladas na cabeça do fago in vitro → partículas do fago podem injetar o DNA recombinante em células de E. coli que multiplicarão os clones de DNA recombinante.
144
145
C) Cosmídios 
Vetores para acomodar inserções maiores de DNA;
São basicamente plasmídeos alojados em cápsulas proteicas virais vazias;
São transferidos para bactérias por infecção viral;
É um híbrido entre plasmídeos e cromossomo λ;
Cos = sítio coesivo em relação às pontas unifilamentares complementares de 12 bases do cromossomo λ final.
Aceitam DNA exógeno até 44 kb, e contém:
a) uma origem plasmidial de replicação; 
b) um ou mais marcadores de seleção; 
c) um certo número de sítios únicos de restrição onde o DNA estranho pode ser inserido e; 
d) um sítio cos (sequência de DNA do bacteriófago λ).
 
146
Vantagens – plasmidiais e fago λ:
Capacidade dos plasmídeos se multiplicarem de forma autonoma em E. coli;
Capacidade de embalagem do cromossomo λ;
Com origem de replicação e gene de resistência do plasmídeo + o sítio cos de λ (acomodação do DNA);
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
USO DE TÉCNICAS COLETIVAS PARA OBTER, AMPLIFICAR E MANIPULAR FRAGMENTOS ESPECÍFICOS DE DNA.
Desde a metade dos anos 70 – esta técnica revolucionou o campo da Biologia → abertura de áreas de pesquisa para investigação molecular.
Engenharia Genética: aplicação desta tecnologia à problemas específicos biológicos, médicos, agriculturais....
Genômica: extensão da tecnologia à análise global dos ácidos nucléicos presentes em um núcleo, uma célula, um organismo ou um grupo de espécies correlacionadas.
A capacidade de construir moléculas recombinantes é a base da tecnologia do DNA recombinante, que revolucionou a Biologia Molecular nas últimas três décadas.
Hoje → Tecnologia do DNA Recombinante
Técnicas coletivas que visam obter, amplificar e manipular fragmentos específicos de DNA.
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 Engenharia Genética
Produção de moléculas recombinantes, requer:
Enzimas de restrição;
Técnicas para isolar fragmentos de DNA;
Vetores de clonagem de genes (transferência);
Técnicas para transferência e seleção.
PRODUÇÃO DE MOLÉCULAS DE DNA RECOMBINANTE
- Como isolar amostras de segmentos individuais de DNA?
A princípio seria buscar uma agulha no palheiro!!!!
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 ENZIMAS
Uma amostra de moléculas contendo o gene de interesse = DNA doador 
2. Os fragmentos do DNA doador são inseridos em cromossomos acessórios não essenciais → VETORES
Tecnologia do DNA recombinante requer:
Construção da molécula recombinante;
Amplificação dessas moléculas recombinantes (produção de cópias ou clones) → garantir que o DNA da molécula recombinante seja capaz de auto-replicação;
Inserção do gene ou sequencia de DNA de interesse em um vetor de clonagem.
VETOR DE CLONAGEM – 3 componentes essenciais:
Uma origem de replicação;
Um gene marcador (repórter) dominante selecionável (resistência à antibiótico, produção de algum composto...);
Pelo menos um único sítio de clivagem da endonuclease de restrição.
Clonagem do gene gfp (Green Fluorescent Protein) de Aequorea victoria água-viva (celenterado, jellyfish) em E. coli (LE392)
GFP é utilizado como gene repórter em estudos de expressão gênica e na localização de proteínas em uma grande variedade de organismos.
Transferência do gene de interesse – usando plasmídeo
O plasmídio é o material genético circular não ligado ao cromossomo que fica espalhado pelo hialoplasma das bactérias. Ele sofre o mesmo processo do DNA cromossomal de transcrição e tradução, além de, se multiplicar a cada divisão celular, passando uma cópia para cada célula “filha”.
 
PRODUÇÃO DE MOLÉCULAS DE DNA RECOMBINENTE
Etapas:
Escolha do DNA:
DNA genômico – obtido diretamente do cromossomo;
cDNA (complementar) – versão bifilamentar do DNA à partir de um RNAm (sem íntrons); 
DNA sintetizado quimicamente - é necessário a sequência ser conhecida.
2. Cortando o DNA genômico:
- Enzimas de restrição – cortam as sequências alvo específicas = sítios de restrição → geram fragmentos de restrição
Finalidade da tecnologia do DNA recombinante: 
– estudo de genes,
transgênicos,
produção de biomoléculas....
Por exemplo:
Os pesquisadores querem estudar um gene humano que produz uma proteína que não se sabe a função.
Os pesquisadores “recortam” (utilizando enzimas de restrição), do DNA humano, o gene de interesse.
Esse fragmento de DNA contendo o gene é multiplicado por PCR para obter várias cópias do mesmo fragmento (ou da mesma informação).
A mesma enzima que clivou o gene do DNA humano é utilizada para clivar o plasmídio bacteriano.
 
Lembre-se que o fragmento de DNA, ao ser clivado, gera pontas adesivas que são complementares ao plasmídio se este for clivado com a mesma enzima.
A seguir o plasmídio clivado é misturado com os fragmentos de DNA (contendo
o gene) e uma enzima chamada ligase “cola” os fragmentos ao plasmídio, produzindo o chamado DNA recombinante. 
Isso feito, o DNA recombinante é introduzido em uma bactéria hospedeira.
A bactéria hospedeira é colocada em um meio nutritivo seletivo, apenas aquelas que possuem o DNA recombinante crescem, formando colônias. 
Após muitas gerações de bactérias, o produto da expressão dos genes, as proteínas humanas, são purificadas das bactérias (são separadas das proteínas das bactérias).
 Construção de uma Bactéria pela Engenharia Genética
Obtenção do gene do organismo doador ou, em alguns casos, pode ser sintetizados em laboratório por nucleotídeos artificiais.
DNA plasmidial (ou outro vetor de clonagem) é isolado para servir como carreador de determinado gene.
O DNA doador e o plasmidial são tratados com a mesma enzima, uma endonuclease de restrição, que cliva o DNA, formando fitas simples com terminais complementares (“terminais coesivos”). Esses são capazes de ligar-se a outros fragmentos de DNA que apresentam o mesmo terminal complementar das fitas simples.
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O terminal coesivo de um fragmento de DNA doador liga-se com o terminal coesivo do DNA plasmidial através da DNA ligase → plasmídio com o fragmento do DNA doador.
O plasmídio é adicionado a uma suspensão de bactérias receptoras  transformação.
As bactérias geneticamente construídas são propagadas em grande quantidade e o produto (proteína) codificado pelo gene transferido é extraído da cultura e purificado. Ou outro caminho é colocar esta bactéria transformada com outro tecido e fazer a transferência do gene.
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PRODUÇÃO DA INSULINA HUMANA – BACTÉRIAS TRANSGÊNICAS
4/23/2018
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