Produção e caracterização parcial de α-amilase deSyncephalastrum racemosum

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Produção e caracterização parcial de 
α-amilase de
Syncephalastrum racemosum
Laira Silva Freitas1, Eduardo da Silva Martins1* e Osania Emerenciano Ferreira1
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA 
BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL 
Alunas: Amanda Soares de Sousa
 Fabiola Cabral
João Pessoa, março de 2018
As enzimas são denominadas de acordo com o substrato sobre o qual atuam, portanto, o termo amilase indica a ação sobre o amido (amilo), que contém dois tipos de polissacarídeos: a amilose (15-20%) e a amilopectina (80-85%) (HARGER, 1982). 
As amilases podem ser divididas em três grupos: 
α-amilases: as quais rompem as ligações no interior do substrato (endoamilases); 
β-amilases: que hidrolisam unidades das extremidades não redutoras do substrato (exoamilases); 
glucoamilases (amiloglucosidases): as quais liberam unidades de glicose do terminal não-redutor das moléculas do substrato.
Introdução
As amilases estão entre as mais importantes enzimas industriais;
Usadas como aditivos em detergentes, e nas indústrias de alimentos, fermentação, papel e têxtil, farmacêutica, médica e químico-analítica;
A α- amilase (1,4-𝛼-glucano 4-glucano-hidrolase, EC 3.2.1.1.) é uma enzima que quebra as ligações 𝛼 (1,4) dos polissacarídeos com três ou mais unidades de D-glicose;
A 𝛼-amilase
Figura 1: Representação da α-amilase pancreática humana.[1]
Fermentação em estado sólido (FES)
Pode ser definida como a deposição de micro-organismos sobre partículas sólidas com a quantidade de água suficiente para o crescimento celular (Gervais & Molin 2003).
Este processo apresenta algumas vantagens em relação à fermentação submersa (FSM), tais como: 
Maior concentração dos produtos formados; 
Menor espaço necessário para equipamentos; 
Condições de crescimento de fungos filamentosos mais similares às de seu habitat natural; 
Redução de riscos de contaminação bacteriana, pela menor atividade de água do substrato.
 (Rodríguez Couto & Sanromán 2006)
Subprodutos agroindustriais
 Torna o processo de produção dessas enzimas mais econômico;
 Prevenir problemas ambientais decorrentes do seu manejo e/ou descarte inadequado;
Interessante em países que geram grandes quantidades destes materiais, como ocorre no Brasil, por sua extensa atividade agroindustrial.
Fungo Syncephalastrum racemosum
 é um fungo filamentoso;
Pode ser considerado uma espécie tropical, frequentemente encontrada no solo e na matéria orgânica. 
A produção de uma amilase do fungo Syncephalastrum racemosum foi relatada por Ray & Hakraverty (1998). O estudo foi feito em fermentação submersa, com a utilização de diferentes substratos, sendo o amido aquele que proporcionou maior atividade da enzima. 
Figura 2: Desenho esquemático de S. racemosum [2]
Objetivos
Avaliar a produção de α-amilase pelo fungo S. racemosum, em fermentação em estado sólido utilizando subprodutos agroindustriais. 
Micro-organismo
Foi utilizada a linhagem fúngica Syncephalastrum racemosum, isolada do solo, no município de Frutal, MG. O fungo foi identificado pela Coleção de Culturas– Micoteca URM da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).
Meio de cultivo para crescimento do fungo
O cultivo do fungo foi feito em frascos Erlenmeyer de 500 mL, contendo meio Agar Sabouraud com amido a 1% (m/v), incubados a 28 ºC, durante 4 dias.
Material e Métodos 
 Preparo do inóculo, substratos para a fermentação e obtenção do extrato enzimático 
fungo S. racemosum
100 mL de solução esterilizada composta por (NH4)2SO4 a 0,1%.
Em frascos Erlenmeyer de 250 mL, foram esterilizados em autoclave, durante 30 minutos: 
5 g dos subprodutos: farelo de arroz, quirera de milho e farelo de trigo
Estes foram inoculados com a suspensão micelial
Umidade: 70% 
Estufa a 28 ºC
Durante 7 dias
Para a obtenção do extrato enzimático:
40 mL de água destilada
Agitados a 40 rpm, durante 20 minutos
filtrado e centrifugado
O sobrenadante foi o extrato enzimático analisado.
 A cada 24 horas foram retiradas amostras, das quais foi determinada a atividade enzimática.
A superfície do meio foi suavemente raspada com alça de inoculação esterilizada, obtendo a suspensão micelial para inóculo nos diferentes substratos (subprodutos agroindustriais).
Avaliação de diferentes condições fermentativas para a produção da enzima
Inicialmente, foram avaliados os fatores substrato (farelo de arroz, quirera de milho e farelo de trigo) e tempo de cultivo (de 24 a 192 horas), sobre a produção da α-amilase. 
Os experimentos foram feitos em três repetições, sendo realizada análise estatística dos dados. Foram estudadas as seguintes fontes de nutrientes como aditivos ao meio de fermentação (p/v):
.
Fontes de nutrientes suplementares ao meio de fermentação, em diferentes valores de pH
Solução nutriente 1: 
NH4NO3 0,1%
MgSO4.7H2O 0,1% 
(NH4)2SO4 0,1%
 pHs 4,5, 5,0, 5,5 e 6,0.
Solução nutriente 2: suspensão 0,5% de farelo de soja em água
 pHs 4,5, 5,0, 5,5 e 6,0
Solução 3 (controle): 
Água
Os valores de pH das soluções foram ajustados com NaOH 0,2 M e HCl 0,2 M.
Medida da atividade de α-amilase (reação dextrinizante)
A atividade de α-amilase foi determinada seguindo o método descrito por Fuwa (1954), com modificações na quantidade de enzima utilizada. 
O controle foi preparado conforme o processo descrito, porém em duas etapas: 
controle do substrato (amido) foi preparado substituindo-se a enzima pelo volume equivalente em água destilada 
controle da enzima, substituindo-se a solução de amido pelo volume equivalente de tampão acetato.
A mistura de reação foi diluída com 10 mL de água destilada.
incubação a 60 ºC 
Tempo: 10 minutos
0,5 mL de reativo de Iodo (KI 0,30% + I2 0,03%)
0,9 mL de solução de amido solúvel 0,3% (p/v) em tampão acetato 0,25 M
pH 5,0 
0,1 mL da solução enzimática bruta convenientemente diluída.
Medida da atividade de α-amilase (reação dextrinizante)
Determinação do pH e temperatura ótimos para a atividade enzimática
A atividade da enzima em função do pH foi estudada incubando, por 10 minutos a 60 °C a solução:
A atividade da enzima em função da temperatura foi avaliada na condição ótima de pH, incubando-se o meio reacional em temperaturas de 40 ºC a 80 ºC (com variação de 5 ºC).
solução enzimática + substrato
0,2 M acetato (pH 3,0 a 5,0)
Citrato (pH 5,5 a 7,0)
Tris (7,5 a 8,5)
glicina (pH 9,0 a 10,0) 
Solução Tampão
Determinação da estabilidade da enzima frente a variações de pH e temperatura
estabilidade da enzima - em diferentes valores de pH foi avaliada incubando o extrato enzimático em tampões, em ausência de substrato, a 25 ºC, por 24 horas. 
estabilidade à temperatura - em temperaturas de 30 °C a 70 °C (com variação de 5 °C).
A “meia-vida” da enzima, tempo no qual a atividade diminuiu em 50% em relação ao tempo zero (utilizado como referência), foi determinada incubando o extrato enzimático a 70 °C, durante 1 h, retirando alíquotas de 5 em 5 min.
Análise estatística
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com três repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância e suas médias comparadas pelo teste de Tukey (p≤0,05), usando o programa Sisvar, da Universidade Federal de Lavras/Brasil.
Resultados e discussão
Dos substratos avaliados, todos suportaram o crescimento do fungo e a produção de α-amilase, com destaque para o farelo de trigo.
Figura 1. Produção de α-amilase pelo fungo Syncephalastrum racemosum, conforme o tempo de fermentação, em diferentes substratos.
-■- farelo de trigo; -♦- quirera de milho; -▲- farelo de arroz.
Observou-se maior produção da enzima após 72 horas de cultivo do fungo
Foi escolhido o tempo de 72 horas para a obtenção da enzima, uma vez que foi o período mais curto que proporcionou valores de atividade enzimática maiores.
Resultados e discussão
Efeito dasuplementação de fontes de nitrogênio, com diferentes valores de pH, sobre a produção de α-amilase
não há necessidade de suplementação com fontes de nitrogênio suplementares.
Resultados e discussão
Figura 2. Produção de α-amilase pelo fungo Syncephalastrum racemosum em farelo de trigo, contendo diferentes soluções suplementares de nitrogênio, com diferentes valores de -□- pH 4,5; -■- pH 5,0; -■- pH 5,5; -■- pH 6,0.
Não houve diferença estatística sobre a produção da enzima, em nenhum dos valores de pH avaliados (Tab. 4), não houve inibição da síntese da enzima pelo fungo.
Resultados e discussão
Efeito do pH sobre a atividade da enzima
A α-amilase do fungo S. racemosum mostrou atividade em uma ampla faixa de pH (principalmente entre 4,0 e 8,0), com o pico ocorrendo em pH 4,5 (90,7 U/g). 
Resultados e discussão
Figura 3. Efeito do pH sobre a atividade da α-amilase do fungo Syncephalastrum racemosum, a 60 °C. -■- Atividade de α-amilase em diferentes valores de pH; -▲- Estabilidade da enzima quando exposta por 24 horas, na ausência de substrato, a diferentes valores de pH.
Efeito da temperatura sobre a atividade da enzima
A α-amilase de S. racemosum mostrou ser termofílica;
Maior atividade na faixa de temperatura entre 60 °C e 70 °C, atingindo o maior valor a 70°C (98,3 U/g). 
Resultados e discussão
Figura 4. Efeito da temperatura sobre a atividade da α-amilase do fungo Syncephalastrum racemosum, em pH 4,5. -■- Atividade de α-amilase em diferentes temperaturas; -▲- Estabilidade da enzima quando exposta por 1 hora, na ausência de substrato, a diferentes temperaturas, em pH 4,5.
Na determinação da sua “meia-vida” a 70 °C (valor no qual sua atividade foi determinada como ótima), a enzima mostrou uma “meia-vida” de cerca de 40 minutos.
Figura 5. “Meia-vida” da α-amilase do fungo Syncephalastrum racemosum, a 70 °C.
Resultados e discussão
Conclusão
Os resultados obtidos demonstram que a utilização de subprodutos agroindustriais no processo de fermentação em estado sólido é viável para a produção de α-amilase pelo fungo Syncephalastrum racemosum.
O substrato que proporcionou maior produção da enzima foi o farelo de trigo, entre 72 h e 192 h de cultivo. 
A suplementação do farelo de trigo com solução orgânica de nitrogênio diminuiu a produção de α-amilase. 
A enzima apresentou atividade ótima entre pH 4,0 e 5,5 e mais de 90% de estabilidade em pH entre 3,0 e 9,0. 
A temperatura ótima foi de 70 °C e a enzima mostrou mais de 90% de termoestabilidade até 55 °C, por 1 h.
Referências
[1] https://pt.wikipedia.org/wiki/Alfa-amilase
[2] BARCOTO, Mariana de Oliveira. Patogenicidade de Syncephalastrum racemosum nos jardins de formigas cortadeiras. 2015. 87 f. Trabalho de conclusão de curso (bacharelado - Ciências Biológicas) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro, 2015. Disponível em: <http://hdl.handle.net/11449/131734>.
Produção e caracterização parcial de 
α-amilase de
Syncephalastrum racemosum
Laira Silva Freitas1, Eduardo da Silva Martins1* e Osania Emerenciano Ferreira1
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
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DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA 
BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL 
Alunas: Amanda Soares de Sousa
 Fabiola 
João Pessoa, março de 2018