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IMUNOCITOQUIMICA
Imunocitoquímica é o conjunto de técnicas que usam anticorpos para identificar células, que funcionam como antigénios, nos tecidos. Esta identificação ocorre devido a reações específicas, interação anticorpo-antigénio, que confere cor aos compostos que se pretendem estudar, permitindo a sua visualização ao microscópio óptico composto.
O valor prático desta área tecnológica específica da Anatomia Patológica, resulta da possibilidade de conjugar um marcador com um anticorpo, outra proteína ou composto, sem provocar qualquer tipo de dano à ligação específica estabelecida entre o anticorpo e o antígeno. Este facto propicia a observação microscópica dos locais onde se encontra o anticorpo e, consequentemente, o antígeno.
Podemos dizer que a Imunocitoquímica se apresenta como um poderoso meio de identificação de várias estruturas celulares normais (através dos respectivos antigénios) e patogénicas (neoplásicas ou não), bem como das consequências, a nível funcional e morfológico, da ação desses mesmos elementos.
A primeira técnica de Imunocitoquímica foi introduzida por Coons et al em 1941, e consistiu na conjugação de um Anticorpo com um corante fluorescente e sua utilização para identificação de Antígenos em cortes histológicos, o que significou a entrada numa nova dimensão no diagnóstico Anatomopatológico. O primeiro composto a ser conjugado com um Anticorpo foi o isocianato de fluoresceína e mais tarde surgiu o isotiocianato de fluoresceína (mais fácil de conjugar), gradualmente passou a se utilizar novos compostos marcadores como outras moléculas fluorescentes: Isotiocianato de Rodamina (vermelho); ou enzimas: Peroxidase (1966), Fosfatase alcalina (1978), Glucose oxidase (1979). O produto final destas reações enzimáticas, pode ser tornado “electron-dense”, mas existem outros produtos que intrinsecamente já possuem esta capacidade, podendo ser utilizados em Imunocitoquímica para microscopia electrónica: Ferritina (1961) e Ouro Coloidal (1971). Também se tornou possível a marcação de Anticorpos com substâncias radioactivas, visualizando-se o resultado por Autoradiografia.
Os três métodos mais usados para marcar os anticorpos são:
- Conjugação com composto fluorescente. Torna possível a identificação do anticorpo marcado e, portanto, do antigénio a que ele se liga, pelo emprego do microscópio de fluorescência.
- Conjugação com uma enzima. O anticorpo é localizado por meio de técnicas histoquímicas, geralmente, usadas em enzimas. A enzima mais usada é a peroxidase, que pode ser localizada pelo método DAB (3-3’diaminobenzidina) e visualizada tanto no microscópio ótico como no eletrónico.
- Conjugação com uma substância que não se deixa atravessar pela luz e que dispersa eletrões. Um dos marcadores mais frequentemente usados é o ouro, cujas partículas podem ser visíveis nos microscópios ótico e eletrónico.
Técnica direta
Imagine-se que, de um determinado órgão de rato (ou de outro animal), se possa extrair e purificar uma proteína, que será denominada de proteína Y (ou antigénio). Pretende-se saber em que célula ou tecido do órgão ela se localiza. Injetando-se a proteína Y num outro animal, por exemplo num coelho, este formará um anticorpo com a capacidade de se combinar de uma forma específica com a proteína alvo, mas não com outras. Do sangue do coelho extrai-se e purifica-se o anticorpo contra a proteína Y, podendo-se ligar quimicamente este anticorpo a um composto fluorescente ou a um outro marcador. Assim, procedendo desta forma, obtém-se um anticorpo que se liga à proteína de interesse (neste caso, proteína Y), e que consegue ser identificado ao microscópio. De seguida, mergulha-se um corte do mesmo órgão do qual se obteve a proteína Y numa solução que contenha o anticorpo marcado, haverá uma combinação dos dois e as estruturas que contiverem a proteína Y serão visíveis.
Técnica indireta
Esta técnica é realizada da seguinte forma: faz-se a imersão do corte histológico em solução com anticorpo não marcado, obtido do sangue de um animal no qual foi injetado o antigênico cuja localização se pretende determinar. O anticorpo liga-se ao antigénio, mas não pode ser observado ao microscópio, um vez que não está marcado. Seguidamente, imerge-se o preparado em solução com antigamaglobulina marcada. Esta fixa-se à gamaglobulina que já estáligada ao antigénio, revelando a sua localização. A antigamaglobulina é obtida pela injeção da fração gamaglobulina no plasma sanguíneo do animal que recebeu injeções do antigénio numa outra espécie diferente.
Os métodos imunocitoquímicos vêm sofrendo aperfeiçoamentos para que se obtenha uma maior especificidade e uma localização cada vez mais precisa das macromoléculas pesquisadas. Uma dessas melhorias é o método do ouro-proteína A que tem sido muito usado e tem contribuído significativamente na investigação da Biologia Celular e na evolução de algumas técnicas de diagnóstico médico.