prática 7

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PRÁTICA N° 7: CURVA DE SOLUBILIDADE DA CASEÍNA EM FUNÇÃO DO PH
Os aminoácidos apresentam dois grupos que são passíveis de sofrer protonação (adição de H) e desprotonação (retirada de H). Observe:
	
          A figura demonstra as etapas de ionização em que podem ser encontrados os aminoácidos:
          1. Forma positivamente carregada.
          2. Forma eletricamente neutra. Note que existe uma densidade de carga negativa e uma densidade de carga positiva sobre a molécula, conferindo carga total nula. Essa forma também é denominada isoelétrica ou zwitteriônica.
          3. Forma negativamente carregada
      Essas formas são encontradas em maior ou menor quantidade dependendo do pH em que a solução do aminoácido se encontra. Isso porque quanto menor o valor de pH, maior a concentração de íons H+ em solução e, conseqüentemente, maior a prevalência da forma positivamente carregada (1). Em contrapartida, quanto maior o valor de pH, menor a quantidade de íons H+ em solução, havendo prevalência da forma negativamente carregada (3). A forma eletricamente neutra (2) só poderá existir, então, numa condição de pH intermediária à existência predominante da forma positiva e negativa do aminoácido. Esses valores de pH podem ser facilmente determinados experimentalmente e também podem ser estendidos às proteínas, ou seja: as proteínas também apresentam uma distribuição de cargas, que pode ser alterada em função do pH.
O ponto onde a carga líquida total da molécula de aminoácido ou proteína é nula é tão importante, que recebeu uma denominação especial. Assim, o valor de pH onde existe equivalência entre as cargas positivas e negativas da molécula é denominado PONTO ISOELÉTRICO.
Importância do Ponto Isoelétrico
          A solubilidade das proteínas, como veremos mais adiante, depende de vários fatores. Dentre eles, destaca-se a presença das cargas elétricas ao longo da molécula. A existência de uma carga positiva ou negativa determina a interação com o meio aquoso, além de estabelecer um estado de repulsão entre as próprias moléculas de proteína, aumentando a interação com o solvente e, conseqüentemente, favorecendo a solubilidade . 
Com vimos, no ponto isoelétrico existe um equilíbrio entre o número de cargas positivas e negativas, o que gera uma situação em que as forças de repulsão entre as moléculas de proteína e as forças de interação com o solvente são mínimas. Assim, as proteínas vão formando aglomerados que, cada vez maiores, tendem a precipitar. 
É importante destacar que essa diminuição de solubilidade varia de proteína para proteína.
OBJETIVO 
- Verificar a influência do pH na solubilidade de uma proteína. 
MATERIAL UTILIZADO 
- Vidraria: Becher, tubos de ensaio, pipetas, cubetas. 
- Reagentes: Solução de Caseína 0,3 g/100mL em acetato de sódio 0,1 M; Ácido Acético 0,1 M; 
Ácido Acético 1,0 M 
- Espectrofotômetro 
PROCEDIMENTOS
Numerou-se 8 tubos de ensaio e procedeu-se de acordo com a tabela 1 abaixo
Em seguida. Adicionou-se 0,5 mL da solução de caseína em acetato de sódio nos tubos 2 até 7 e leu-se as absorbâncias em 570 nm. 
RESULTADOS
Cálculo da concentração final do sal 
Vcaseína = 0,5mL 
[acetato] = 0,1M 
Vfinal = 5mL 
[acetato]final = ? 
0,5 x 0,1 = 5 x [sal]final
[sal]final = 0,01M 
Cálculo do pH teórico em cada tubo
Tubo 1: 
Vac. acético = 0,1 mL 
[ac. acético]inicial = 0,1 M 
Vfinal = 5mL 
Vac. acético x [ac. acético]inicial = Vfinal x [ac. acético]final 
0,1 x 0,1 = 5 x [ac. acético]final
[ac. acético]final = 0,002M 
pH = pka + log ( [sal]final / [ac. acético]final ) 
pH = 4,76 + log (0,01/0,002) = 5,46 
Tubo 2: 
Vac. acético = 0,2 mL 
[ac. acético]inicial = 0,1 M 
Vfinal = 5mL 
Vac. acético x [ac. acético]inicial = Vfinal x [ac. acético]final 
0,2 x 0,1 = 5 x [ac. acético]final
[ac. acético]final = 0,004M 
pH = pka + log ( [sal]final / [ac. acético]final ) 
pH = 4,76 + log (0,01/0,004) = 5,16 
Tubo 3: 
Vac. acético = 0,5 mL 
[ac. acético]inicial = 0,1 M 
Vfinal = 5mL 
Vac. acético x [ac. acético]inicial = Vfinal x [ac. acético]final 
0,5 x 0,1 = 5 x [ac. acético]final
[ac. acético]final = 0,01M 
pH = pka + log ( [sal]final / [ac. acético]final ) 
pH = 4,76 + log (0,01/0,01) = 4,76 
Tubo 4
Vac. acético = 1,0 mL 
[ac. acético]inicial = 0,1 M 
Vfinal = 5mL 
Vac. acético x [ac. acético]inicial = Vfinal x [ac. acético]final 
1,0 x 0,1 = 5 x [ac. acético]final
[ac. acético]final = 0,02M 
pH = pka + log ( [sal]final / [ac. acético]final ) 
pH = 4,76 + log (0,01/0,02) = 4,46 
Tubo 5: 
Vac. acético = 2,0 mL 
[ac. acético]inicial = 0,1 M 
Vfinal = 5mL 
Vac. acético x [ac. acético]inicial = Vfinal x [ac. acético]final 
2,0 x 0,1 = 5 x [ac. acético]final
[ac. acético]final = 0,04M 
pH = pka + log ( [sal]final / [ac. acético]final ) 
pH = 4,76 + log (0,01/0,04) = 4,16 
Tubo 6: 
Vac. acético = 4,0 mL 
[ac. acético]inicial = 0,1 M 
Vfinal = 5mL 
Vac. acético x [ac. acético]inicial = Vfinal x [ac. acético]final 
4,0 x 0,1 = 5 x [ac. acético]final
[ac. acético]final = 0,08M 
pH = pka + log ( [sal]final / [ac. acético]final ) 
pH = 4,76 + log (0,01/0,08) = 3,86 
Tubo 7: 
Vac. acético = 0,6 mL 
[ac. acético]inicial = 1,0 M 
Vfinal = 5mL 
Vac. acético x [ac. acético]inicial = Vfinal x [ac. acético]final 
0,6 x 1,0 = 5 x [ac. acético]final
[ac. acético]final = 0,12M 
pH = pka + log ( [sal]final / [ac. acético]final ) 
pH = 4,76 + log (0,01/0,12) = 3,68
Gráfico 
A partir da tabela 1 e dos valores de pH calculados no item anterior tem-se o gráfico abaixo:
Análise do gráfico e pI da caseína 
Em solução, quando as moléculas de determinada proteína estiverem carregadas positivamente ou negativamente, a solubilidade dessa proteína será maior, pois as moléculas se repelirão entre si, aumentando a interação com o solvente. Observando o gráfico acima, essas substância estão na faixa de pH no valor m enor que 4 para as que estiverem c arregadas positivamente e no valor maior que 5 para que estiverem carregadas negativamente 
Existe um pH intermediário, que varia de proteína para proteína (pois depende dos radicais R dos aminoácidos que a constituem), em que há um equilíbrio entre as cargas positivas e negativas. Este pH é conhecido como ponto isoelétrico da proteína – p I. Nesse pH, a proteína apresenta solubilidade mínima, porque a carga efetiva da molécula é nula (há um balanço entre cargas positivas e negativas), ficando diminuída a repulsão entre as moléculas e havendo interação eletrostática das moléculas entre si. Como conseqüência, forma-se grumos que tendem a precipitar. 
Então para se ter o pI a partir do gráfico observa -se o menor valor d e 1/Abs (maior absorbância), pois com a formação dos grumos qu e tendem a precipitar há um a maior obstrução do caminho da luz, tendo uma absorbância maior. A partir do gráfico a faixa onde se situa o pI da caseína seria entre 4,25 e 4,75. 
CONCLUSÃO
A partir da curva de solubilidade da caseína em função do pH pôde-se encontrar a faixa onde se situa o pI da caseína entre 4,25 e 4,75. O valor do pI da literatura1 4,6 encontra-se dentro da faixa estipulada pelo gráfico da figura 1. Observou -se também que pelo gráfico a solubilidade d a caseína é altamente influenciada pelo pH.