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P1 – BIOENGENHARIA Aula 1 – Biotecnologia DEFINIÇÃO - “Conjunto de conhecimentos, técnicas e métodos, de base científica ou prática, que permite a utilização de seres vivos como parte integrante e ativa do processo de produção industrial de bens e serviços”; - “Conjunto de processos industriais que englobam processos biológicos”; - “Aplicação da bioquímica, da biologia e da engenharia química aos processos e produtos industriais e ao meio ambiente”; - “Utilização de sistemas celulares para a obtenção de produtos ou desenvolvimento de processos industriais”. APLICAÇÕES - Alimentos: Bebidas, laticínios; - Química Orgânica: Produção de etanol, ácidos orgânicos; biopolímeros, enzimas; - Agricultura: Biopesticidas; - Energia: Biocombustíveis (etanol, metanol). IMPACTOS DECORRENTES DE INOVAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS - Tecnologias mais limpas ● Matérias primas renováveis; ● Baixo impacto ambiental (Processo); ● Rejeitos de baixa toxicidade; ● Menor demanda de energia. - Melhoria na produção de um determinado produto ● Qualidade; ● Rendimento; ● Produtividade. BIOPROCESSOS - Conjunto de operações que incluem: ● Tratamento da matéria prima; ● Preparo dos meios de cultivo para propagação e produção; ● Esterilização; ● Propagação das células e transformação do substrato em produto; ● Processo de recuperação e purificação de produtos. COMPARAÇÃO ENTRE BIOPROCESSOS E PROCESSOS QUÍMICOS BIOPROCESSOS – CARACTERÍSTICAS DE OPERAÇÃO MATÉRIAS PRIMAS PARA A INDÚSTRIA DE BIOPROCESSOS -Matéria prima é a fonte do substrato para um determinado bioprocesso. Pode ser de natureza orgânica ou inorgânica. CRITÉRIOS DE ESCOLHA DA MATÉRIA PRIMA - Presença e teor de substrato adequado ao metabolismo do agente biológico; - Custo (Economicamente vantajosa); - Disponibilidade – Fácil obtenção; - Facilidade de beneficiamento – Não exigir tratamentos prévios onerosos; - Facilidade de transporte e estocagem; - Caráter de sazonalidade; - Baixa toxicidade; - Não deve prejudicar o processo de separação do produto. CLASSIFICAÇÃO DAS MATÉRIAS PRIMAS a) NATUREZA DO SUBSTRATO 1) Sacaríneas ou Açucaradas - Os substratos presentes encontram-se na forma de mono ou dissacarídeos, diretamente disponíveis para o cultivo (Ex. Glicose, Frutose, Lactose, etc.); - Não necessitam de tratamentos onerosos - Exemplos de matérias primas : ● Cana de açúcar; ● Frutas e suco de frutas; ● Beterraba; ● Leite; ● Etc. 2) Amiláceas - O substrato presente encontra-se sob a forma de amido - Necessitam de tratamento prévio para a hidrólise do amido para a liberação da glicose. - Exemplos de matérias primas amiláceas: ● Mandioca; ● Milho; ● Cevada; ● Batata; ● Trigo; ● Etc. 3) Lignocelulósicas - Os substratos presentes encontram-se na forma de celulose e hemicelulose. - Necessitam de extensivas etapas de tratamento prévio para a hidrólise dos polissacarídeos visando a obtenção de açúcares. - Exemplos de matérias primas celulósicas: ● Bagaço de cana; ● Sabugo e talos de milho; ● Cascas de grãos; ● Resíduos de madeireiras. b) ACESSIBILIDADE DO SUBSTRATO - Substrato é a substância química cuja estrutura ou parte da mesma está presente na molécula do produto. Pode ser de natureza orgânica (Açúcares, amido) ou inorgânica (CO2, sais mineirais) 1) Substratos Solúveis - São diretamente solubilizáveis, ou seja, não necessitam de beneficiamento prévio. - Exemplos: ● Cana de açúcar; ● Melaço; ● Soro de leite; ● Beterraba 2) Substratos Insolúveis de Fácil Hidrólise - Necessitam de tratamento moderado para a solubilização e hidrólise. - Exemplos: ● Amido de milho; ● Mandioca; ● Trigo; ● Cevada. 3) Substratos Insolúveis de Difícil Hidrólise - Necessitam de pré tratamento extensivo para a liberação do substrato. - Exemplos: ● Celulose; ● Hemicelulose. OUTRAS DEFINIÇÕES - Agente de fermentação: micro-organismo capaz de cumprir o metabolismo que leva à formação do produto desejado, com altos rendimentos; - Produto: É uma substância de interesse comercial acumulada devido a diferenças nas taxas reacionais das reações do metabolismo celular. Pode ser extracelular ou intracelular MEIO DE CULTIVO - Características Desejáveis: ● Ser o mais barato possível; ● Atender às necessidades nutricionais do micro-organismo; ● Auxiliar no controle do processo (evitar a formação de espuma / Controle de pH); ● Não gerar efluentes; ● Ter composição razoavelmente fixa (Problemas sazonais); ● Facilitar a recuperação e purificação do produto. - Tipos de Meio de Cultivo 1) Sintéticos - Pode ser facilmente reproduzido, pois a composição química é bem conhecida; - Não apresenta problemas quanto a recuperação e purificação do produto final; - Adição de fatores de crescimento (Biotina, Tiamina, Riboflavina, etc.) → Elevam o custo do meio. 2) Meios Complexos - Matérias primas naturais (ex. caldo de cana); - Mais baratos, quando comparados com os sintéticos; - Composição química desconhecida → Apenas teores de açúcares, nitrogênio e fósforo disponíveis; - Não se conhece o teor de sais minerais; - Problemas na recuperação e purificação do produto; - Geração de efluentes. ESTEQUIOMETRIA DE BIOPROCESSOS INDUSTRIAIS - Nomenclatura ● P: concentração de produto (g/L); ● S: concentração de substrato (g/L); ● X: concentração de células (g/L); ● Y: fator de rendimento ou fator de conversão (g/g); ● QP : produtividade volumétrica em relação ao produto (g/L.h) ● QX : produtividade volumétrica em relação à concentração de células (g/L.h) ● PRM : produtividade mássica (g/h); ● Ef : eficiência do bioprocesso; ● Eg : eficiência global da planta. FATORES DE RENDIMENTO OU CONVERSÃO (Y) 1) Fator de rendimento de produto em relação ao substrato (YP/S). 2) Fator de rendimento de células em relação ao substrato (YX/S) 3) Fator de rendimento de produto em relação ao crescimento celular (YP/X) RELAÇÃO ENTRE OS FATORES DE CONVERSÃO: FATORES DE CONVERSÃO RELACIONADOS À CONTRAÇÃO INICIAL DE SUBSTRATO 1) Fator de rendimento de produto em relação à concentração inicial de substrato (YP/S0) 2) Fator de rendimento de crescimento celular em relação à concentração inicial de substrato (YX/S0) FATORES DE CONVERSÃO RELACIONADOS À MATÉRIA PRIMA 1) Fator de rendimento de produto em relação à matéria prima (YP/MP) 2) Fator de rendimento de células em relação à matéria prima (YX/MP) EFICIÊNCIAS 1) Eficiência do Bioprocesso (Ef) 2) Eficiência Global (Eg) - Algumas perdas possíveis: ● Tratamento da matéria prima; ● Preparo do meio; ● Esterilização do meio; ● Separação de células; ● Recuperação do produto. PRODUTIVIDADES VOLUMÉTRICAS 1) Em relação ao produto (QP) 2) Em relação às células (QX) PRODUTIVIDADE MÁSSICA ESTEQUIOMETRIA DE ALGUNS BIOPROCESSOS INDUSTRIAIS a) Não aerados b) Aerados Aula 2 – Cinética de Bioprocessos - O estudo de um processo fermentativo consiste inicialmente na análise da evolução dos valores de concentração de um ou mais componentes do sistema de cultivo em função do tempo de fermentação: • Microrganismo ou biomassa (X); • Produtos do metabolismo (P); • Nutrientesou substratos (S). - Os valores experimentais de concentração (X, P e S), quando representados em função do tempo, permitirão traçar as curvas de ajuste e assim poder determinar suas concentrações instantâneas: • X=X(t); • P=P(t); • S=S(t). - Dentre os produtos formados escolhe-se para o estudo cinético o produto de interesse econômico e o substrato limitante; - Quando determinados somente os valores finais e iniciais destes parâmetros, não se pode dizer que houve um estudo cinético; - Para um estudo cinético de fato, é necessário determinar os valores intermediários, para definir os perfis das curvas e o modelo matemático do processo COMO MEDIR BIOMASSA? - Câmara de Neubauer ● Quando se trabalha com microrganismos, na maioria das vezes deseja se determinar a concentração de células da suspensão preparada; ● Uma das formas mais comuns de se obter esta estimativa é através da contagem ao microscópio, utilizando-se uma Câmara de Neubauer, também conhecida como Hemacitômetro ou Câmara de Contagem; ● A Câmara de Neubauer é uma lâmina grossa de uso microscópico, com formato retangular e normalmente de vidro, com uma depressão no centro, utilizada para fazer contagem de células por unidade de volume de uma suspensão. - Matéria seca: - Turbidimetria OBJETIVOS - Medir as taxas de transformação; - Estudar a influência de fatores nessas taxas; - Correlacionar por meio de equações empíricas ou modelos matemáticos as taxas de transformações com os fatores; - Aplicar as equações na otimização e no controle do processo. PARÂMETROS DE TRANSFORMAÇÃO a) Velocidade instantânea - De consumo de substrato (rs), de formação de produto (rp) e de crescimento celular (rx). Podem ser calculadas em qualquer tempo, a partir da inclinação das tangentes das respectivas curvas (coeficiente angular – derivada) b) Velocidade específica de transformação em relação à biomassa X FATORES DE CONVERSÃO - Como na maioria dos cultivos Yx/s, Yx/p ou Yp/s não são constantes, então somente seus valores instantâneos deverão ser levados em conta: Então: CARACTERÍSTICAS DA CURVA DE CRESCIMENTO MICROBIANO EM SISTEMA DESCONTÍNUO (BATELADA) 1 – Fase Lag: Rearranjo do sistema enzimático (síntese de enzimas). Não há variação da concentração de biomassa (X = X0 = cte). Fatores que afetam a duração desta fase→ O inóculo estar velho, pouca concentração celular, baixa concentração de nutrientes, o meio de cultura tem que ser o mais próximo possível do meio usado na fermentação. 2 – Fase de Transição: Aumento gradativo da concentração celular. 3 – Fase Log: Células adaptadas, massa celular e número de células aumentam exponencialmente com o tempo, consumo de substrato, formação de metabólitos primários, velocidade específica de crescimento máxima e constante (μ = μmáx = cte). → μ = 1X dt dX . dt∫ X X0 X dX = ∫ t t0 μ Então: n X μ .t n X l = máx + l 0 Juntamente com a velocidade específica máxima, a fase exponencial de crescimento é caracterizada pelo tempo de geração (tg), que é o tempo necessário para o microrganismo dobrar o valor da concentração celular (X=2Xo) → = . dt∫ 2X0 X0 X dX = ∫ t t0 μ n( ) μ . (t )l X0 2X0 = − t0 → n 2 μ . tg l = tg = μ ln 2 4 – Fase Linear de Crescimento: Velocidade de reprodução constante. 5 – Fase de Desaceleração: diminuição de crescimento celular (rx) e a velocidade específica de crescimento celular (μx), devido ao esgotamento de um ou mais componentes do meio de cultura, ou devido ao acúmulo de metabólitos. 6 – Fase Estacionária: Aqui, a concentração de biomassa Xchega ao seu valor máximo Xm. Além disso, há um acúmulo de metabólitos tóxicos, fim do substrato limitante e a taxa de crescimento celular se iguala a de morte celular. 7 – Fase de Morte ou Lise: A concentração celular diminui a uma velocidade que excede a velocidade de produção de células, ocorrendo lise celular, autólise, ou rompimento dos microrganismos, provocado pela ação de enzimas intracelulares. MODELO DE MONOD - O crescimento da biomassa é dependente da disponibilidade do nutriente; - Quando estamos em condições de limitação do nutriente a μx reduz-se até cessar completamente o crescimento, em condições de exaustão do nutriente Linearização: Aula 3 – Fermentação Descontínua - A fermentação descontínua também é chamada “em batelada”. - Neste tipo de processo fermentativo, há a inoculação do microrganismo desejado em uma solução nutriente esterilizada, de tal forma a permitir que a fermentação ocorra em condições ótimas. - Nada é adicionado além de oxigênio, para processos aeróbios, ácidos e bases para controle de pH ou antiespumantes. Ao final da fermentação, ocorre o descarregamento da dorna e o fermentado segue para os tratamentos finais. A dorna é então lavada e esterilizada para ser utilizada novamente. VANTAGENS - Menores riscos de contaminação; - Grande flexibilidade de operação (Plantas multi propósito); - Melhor controle da estabilidade genética do micro-organismo; - Condições de controle mais simples; - Capacidade de identificar todos os materiais relacionados ao processo; - Possibilidade de realizar fases sucessivas no mesmo recipiente. DESVANTAGENS - Tempo “morto”; - Pode haver baixo rendimento e/ou produtividade, caso o substrato adicionado no início da fermentação exerça efeitos de inibição, repressão ou desviar o metabolismo celular a produtos que não interessam (efeito de inibição). CLASSIFICAÇÃO - 3 grandes grupos: ● Cada dorna recebe 1 inóculo; ● Recirculação de microrganismos; ● Processo por meio de cortes. NÚMEROS DE DORNAS - Influencia no custo, espaço ocupado e volume de produção - Considere uma fermentação em batelada que forneça de maneira contínua líquido fermentado para o tratamento final. Seja: F = vazão de líquido fermentado (Volume/tempo) tf = tempo de fermentação de uma dorna V = capacidade de cada dorna (Volume) D = número de dornas necessários para garantir F contínuo td = tempo de descarga de uma dorna tc = tempo de limpeza e carga de uma dorna - F vai depender dos seguintes fatores: a) da massa do produto final requerida (M) em um tempo t; b) do rendimento do processo (r) c) da concentração do produto final (C) F = MC.t.r - O tempo de descarga td pode ser calculado: td = F V - E para fins de cálculo, ttc = f Essa consideração facilita na avaliação de D, e pode ser obedecida na prática industrial. - Consideremos uma dorna, que será chamada de dorna número 1, em início de trabalho; no intervalo de tempo tc=td, ela será limpa e carregada; decorrido um intervalo de tempo t1, o líquido nela contido estará completamente fermentado e, após outro intervalo de tempo td, ela se encontrará vazia e em condições de reiniciar seu ciclo de trabalho. - Para que não haja interrupção de fornecimento de material fermentadoao setor dos tratamentos finais, quando terminar a descarga da dorna número 1 deverá existir outra (que será indicada por dorna número 2) pronta para ser descarregada. Quando a dorna número 2 tiver sido descarregada, deverá existir uma terceira em condições de iniciar sua descarga. - Deverá existir, portanto, um intervalo de tempo td separando o início de funcionamento de duas dornas consecutivas. Nessas condições, tomando-se convencionalmente como instante zero o início de trabalho da dorna número 1, a dorna D deverá começar a funcionar no instante (D-1)td. - A última expressão em verde nos permite calcular o número de dornas, desde que se conheça F, V e tf. FERMENTAÇÃO CONTÍNUA - Alimentação e retirada de produto feita de forma contínua; - Volume reacional constante = Variáveis de estado (X, S, P) constantes ao longo do tempo de operação do sistema. VANTAGENS - Aumento da produtividade do processo (sem tempos “mortos”); - Fermentado uniforme – Facilita as operações de recuperação do produto; - Manutenção das células em um mesmo estágio fisiológico – Estudos de mecanismo de regulação metabólica e otimização de composição de meios de cultura; - Não ocorre aumento da concentração de metabólitos. DESVANTAGENS - Maior risco de contaminação; - Possibilidade de degenerescência do agente (mutação); - Dificuldade de manutenção da homogeneidade do meio reacional (Variação da viscosidade do meio); - Deve-se evitar a formação de espuma. APLICAÇÃO - Produção de etanol; - Tratamento de efluentes. FORMAS DE OPERAÇÃO NO SISTEMA CONTÍNUO. a) Único estágio (Com ou sem reciclo de células) b) Múltiplos estágios ● Alimentação única (com ou sem reciclo de células) ● Alimentação múltipla (com ou sem reciclo de células). EQUACIONAMENTO DE UM REATOR CONTÍNUO SEM RECICLO DE CÉLULAS F = vazão volumétrica de alimentação (L/h) V = volume de meio reacional (L) X = conc de células no reator (g/L) X0 = conc de células na alimentação (g/L) S = conc de substrato no reator (g/L) S0 = conc de substrato na alimentação (g/L) P = conc de produtos no reator (g/L) P0 = conc de produtos na alimentação (g/L) μ = velocidade específica de crescimento (h) qP = velocidade específica de formação de produtos (gP /gX.h) qS = velocidade específica de consumo de substrato (gS /gX.h) YX/S = fator de conversão de células em relação ao consumo de substrato (gX /gS). BALANCO DE MASSA PARA O MICRORGANISMO Aula 4 – Enzimologia ENZIMAS - São proteínas com atividade catalítica que viabilizam a atividade das células, reduzindo a energia de ativação necessária ao início de uma reação bioquímica. - As enzimas não alteram os valores de energia de Gibbs, nem a constante de equilíbrio. Apenas aceleram a velocidade com que a reação chega ao equilíbrio. - No equilíbrio, as velocidades são iguais em ambos os lados (tanto no de formação de produto, quanto de substrato). SÍTIO ATIVO - É o local específico da enzima que reconhece o substrato - Participa da sequência da reação, mas não sofre transformação - Apresenta alto grau de especificidade 1) Modelo Chave-Fechadura - O sítio ativo é complementar em tamanho, forma e natureza química do substrato 2) Encaixe Induzido - O sítio ativo não precisa existir de uma forma rígida; - Deve existir um arranjo espacial preciso e específico das cadeias laterais dos aminoácidos constituintes, induzido pela presença do substrato. GRAUS DE ESPECIFICIDADE 1) Baixa Especificidade – Enzimas não discriminam entre substratos, somente as ligações que irão atacar. Ex. Peptidases, fosfatases e esterases 2) Especificidade de Grupo – A enzima é específica para uma ligação química de um determinado grupo. Ex. Hexoquinases catalisam a fosforilação de uma variedade de açúcares do grupo das aldohexoses. 3) Especificidade Absoluta – A enzima atua somente sobre um substrato (Reação única) Ex. Urease hidrolisa a ureia, mas não hidrolisa seus derivados. 4) Especificidade Estereoquímica – A enzima atua somente em um dos estereoisômeros. Ex. Lactato Desidrogenase é específica para o isômero L do lactato. OBJETIVOS DA CINÉTICA ENZIMÁTICA - Medir as velocidades das transformações que ocorrem - Estudar a influência de condições de trabalho nas velocidades (concentrações de substrato, inibidores, T, pH,...) - Correlacionar as velocidades das transformações com alguns dos fatores que as afetam, por meio de equações empíricas. - Ajudar na otimização do processo estudado. - Estabelecer critérios para o controle do processo - Projetar o reator mais adequado SISTEMA UNIDIRECIONAL SIMPLES a) um único substrato se transformando em um único produto b) O complexo ES se forma na proporção de 1 mol de enzima e 1 mol de substrato. c) O complexo se decompõe sem reagir com outras substâncias - A equação da velocidade pode ser obtida considerando condições de equilíbrio rápido: a) E, S e ES alcançam o equilíbrio muito rapidamente em comparação com a velocidade com a qual ES se transforma em E + P (etapa lenta) b) A velocidade instantânea em qualquer tempo depende de [ES]: v = kp[ES], onde, kp = cte de velocidade catalítica A quantidade total de enzima está distribuída entre E e ES [E]t = [E] + [ES] v [E]t = kp[S] ks+[S] - Se v = kp[ES], logo a velocidade será máxima quando [ES] for máxima, ou seja, [ES]= [E]t . Logo: vmáx = kp[E]t TRATAMENTO NO ESTADO ESTACIONÁRIO - Se a enzima está em quantidades catalíticas ([S]>>>>kp[E]t), a velocidade de formação de ES é igual a velocidade de dissociação de ES, ou seja, [ES]=CTE Então, desenvolvendo os cálculos, chega-se à equação de Michaelis Menten: v vmáx = [S] km+[S] OBS: km ≠ ks Ks é a constante de dissociação do complexo ES, no equilíbrio, Já Km se refere à relação das concentrações reais no estado estacionário ao invés das concentrações de equilíbrio. QUANDO [S] = km → vvvmáx = km km+km = 2 vmáx DETERMINAÇÃO DE KM E Vmáx COM DADOS EXPERIMENTAIS DE [S] E V. ORDEM DE REAÇÃO INIBIÇÃO ENZIMÁTICA - Inibidor é toda substância que reduz a velocidade da reação enzimática. - Os inibidores podem ser Reversíveis (Competitivos ou Não Competitivos) ou Irreversíveis. - Inibição Competitiva - Na inibição competitiva, o valor de Vmáx não se altera (a reatividade do complexo enzima-substrato se mantém), ao passo que a afinidade da enzima pelo substrato (Ks) diminui. Linearizando a equação: Quanto maior a inclinação, maior a influência do inibidor. - Inibição Não Competitiva O valor de Vmáx se altera, porém a afinidade da enzima pelo substrato (Ks) se mantém constante. Linearizando a equação - Inibição Irreversível Pode se assemelhar com um inibidor não competitivo, pois a velocidade máxima diminui, ao passo que km não se altera. FATORES QUE INFLUENCIAM A ATIVIDADE ENZIMÁTICA a) pH - pH Ótimo → A distribuição de cargas no sítio catalítico é ideal para a catálise - O pH altera a configuração espacial da enzima (alteração de forças eletrostáticas) - O pH deve sercontrolado durante toda a reação → Uso de solução tampão - Alterações no pH interferem na afinidade enzima/substrato → reflete no valor de km b) Temperatura - O aumento da temperatura favorece o aumento da velocidade de reação → Aumenta a energia cinética - Atenção → Desnaturação proteica - Temperatura Ótima → Maior atividade catalítica
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