Biologia Molecular

Prévia do material em texto

Biologia Molecular
Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid
J. D. WATSON & F. H. C. CRICK
Medical Research Council Unit for the Study of the Molecular Structure of Biological Systems, Cavendish Laboratory, Cambridge. April 2
Nature 171, 737-738 (25 April 1953) | doi:10.1038/171737a
 
Nobel Prize, 1968
Principio da replicação do DNA
 
Histórico...
2
3
Como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), PCR em tempo real e o Sequenciamento de genes são ferramentas importantes na investigação científica e no diagnóstico laboratorial ?
4
Reação em Cadeia da Polimerase
5
PCR - Polymerase Chain Reaction Reação em Cadeia da Polimerase
O PCR é uma técnica enzimática para a amplificação in vitro de sequências de DNA;
A especificidade é governada pelo uso de oligonucleotídeos, pequenas moléculas de fita simples de DNA quimicamente sintetizadas, que flanqueiam a sequência-alvo a ser amplificada e atuam como primers para a elongação pela DNA polimerase;
A técnica é tão sensível, que permite amplificar em ordem de grandeza de milhões genes de uma única cópia a partir de uma mistura complexa de sequências não relacionadas.
Cópia molecular
5’TACGCCGATCTCGTCCGACGCTAGTAACCGATCGGAAGGCCTAAGCATTTCGCGATGACCTAGGATCGATGCATTAAGCGTAGCTAGCATGAGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCATAGCATGACTAGCTAGGATCACTGAGTACAGTACTAGACTACGTAGCTAGACTAGATGCATAGCTAGCAGTACTTGCATGACTGACTACGTAGCTAGCCGTTAGCTAACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCATAGCATGACTAGCTAGGATCACTGAGAAGCGTAGCTAGCATGAGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCACTAGGATCGATGCATTAAGCGTAGCTAGCATGAGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCATAGCATGACTAGCTAGGATCACTGAGTACTGAGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCAACTAGCTAGGATCACTGAGTACAGTACTAGGCATATTAGTGCGTAGCTAGC 3’ 
Capaz de copiar e multiplicar parte de uma “sentença”
7
Características
O ciclo é repetido numerosas vezes e as fitas recém-sintetizadas funcionam como DNA molde nos ciclos seguintes, levando a um acúmulo exponencial do produto de DNA de fita dupla;
Amplifica melhor regiões compreendidas entre 100-1000 pares de bases;
Através de condicões especiais regiões maiores podem ser amplificadas (“long PCR”);
Utiliza quantidades extremamente pequenas de material inicial, como o DNA extraído de uma biópsia ou mesmo uma única célula.
Os produtos da reação podem ser analisados através de separações eletroforéticas em géis corados com brometo de etídeo;
A técnica pode ser acoplada a reações cromogênicas e visualizada sem necessidade de géis;
PCR em tempo real: uso de primers fluorescentes e reação quantitativa.
Características
Automação do método básico de PCR
Isolamento da DNA polimerase termoestável do termófilo extremo Thermus aquaticus, uma bactéria que habita fontesde água quente;
A enzima tem atividade máxima entre 70-80oC e resiste a temperaturas próximas da ebulição;
Desenvolvimento: aparelhos termocicladores controlados por microprocessadores.
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 1969, p. 289-297 Vol. 98, No. I
Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a Nonsporulating Extreme Thermophile
THOMAS D. BROCK AND HUDSON FREEZE
Department of Microbiology, Indiana University, Bloomington, Indiana 47401
The isolation of a new thermophilic bacterium, Thermus aquaticus gen. n. And sp. n., is described. Successful enrichment requires incubation at 70 to 75 C, and the use of nutrient media relatively dilute with respect to the organic components.
Strains of T. aquaticus have been isolated from a variety of thermal springs in Yellowstone National Park and from a thermal spring in California. The organism has also been isolated from man-made thermal habitats, such as hot tap water, in geographical locations quite distant from thermal springs. Isolates of T. Aquaticus are gram-negative nonsporulating nonmotile rods which frequently form long filaments at supraoptimal temperatures or in the stationary phase. The optimum temperature for growth is 70 C, the maximum 79 C, and the minimum about 40 C. The generation time at the optimum is about 50 min. 
Thermus acquaticus
11
Reação para amplificação de segmento específico de DNA
Exon especifico de um gene humano
12
Termocicladores
13
Quem inventou a PCR?
Kary Mullis, geneticista. Nobel Prize em Química (1993) pelo desenvolvimento de um método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA.
Seus estudos em 1985 permitiram amplificar o DNA
 Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-54
Mullis, K. and Faloona, F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 155: 335-35
14
Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao serviço da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califórnia, recebeu o prémio Nobel da Química pelo desenvolvimento de um método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta técnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a áreas como o diagnóstico de doenças, medicina forense entre muitas outras para além da Investigação em Biologia.
Kary Mullins ganhou o prêmio Nobel de química em 1993 por desenvolver o famoso PCR, Reação em Cadeia da Polimerase, que é um processo usado muito em labs de biologia molecular para multiplicar uma pequena quantidade de DNA em muito DNA, facilitando nosso trabalho
15
Aplicações do PCR em biologia molecular
Construção de bibliotecas de cDNA a partir de quantidades diminutas de mRNA;
Mutação sítio-dirigidas de genes;
Análise de interações proteína-DNA;
Identificação de expressão tecido- ou estágio-específica (“mRNA differential display”);
Detecção de RNA viral através de RT-PCR.
Aplicações do PCR como ferramenta de
diagnóstico
Genética animal e vegetal - melhoramento genético assistido por marcadores moleculares;
Câncer - uso de marcadores tumorais;
Tipagem de tecidos (histocompatibilidade) e Estudos paleontológicos;
Laboratórios forenses - paternidade, parentesco, estupros;
Patologia e Detecção de agentes infecciosos.
Reação de PCR
COMPONENTES:
Solução tampão - Tris-Cl/KCl/NH4(SO4)2/Triton X-100 
dNTPs - ~ 200 mM
MgCl2 - ~1,5 mM
Primers (oligonucleotídeos iniciadores) - ~ 25 pmoles/50 ml
Taq DNA polimerase (Thermus aquaticus) - ~ 1 U
ETAPAS:
Desnaturação térmica do DNA de fita dupla: 94-96oC
Pareamento dos primers nas fitas separadas: 40-65oC
Elongação pela Taq DNA polimerase: 72oC
Elementos da PCR
DNA amostra, DNA polimerase, Termociclador – substitui a helicase e
DNTP – nucleotideos trifosfatados
19
Trabalhando com PCR convencional
1. Etapas Pré- PCR:
Coleta da Amostra
Estabilização
Extração do Ácido Nucleico
2. PCR ou Ciclagem:
Preparo da Reação
Termociclagem
3. Pós-PCR:
Análise em Gel
20
EXTRAÇÃO DO DNA
Tecidos frescos, células ou cultura de células;
Tecido fixado com formalina, em bloco de parafina, ou montado em lâmina corado por H&E.
Esfregaços citológicos, lavados.
Peças de museu (fixadas).
Fósseis, múmias;
Fezes. 
Quantificação do DNA amplificado
 Nanodrop (espectofotômetro)  260 nm
22
Reação de PCR em Termociclador
Etapas da PCR - Termociclador
1. Desnaturação
2. Anelamento
3. Extensão
24
Principio da PCR
25
26
Amplificação Exponencial
27
Ao sair do termociclador a aparência é a mesma – revelação da região amplificada 
http://teach.genetics.utah.edu/
28
Aplicação das amostras amplificadas no gel de agarose
Visualização do gel sob luz UV e documentação
Reação de PCR -parâmetros-
Tempo de extensão - ~ 1 min/kb de sequência; 
[MgCl2] - >1,5 mM leva a uma redução da especificidade;
Temperatura de pareamento (anelamento) -define a estringência da reação – especificidade;
Número de ciclos - depende da quantidade de DNA-alvo - geralmente 20 a 30;
Volume de reação - 20 a 50 ml;
Desnaturação térmica do DNA de fita dupla: 94-96oC ~ 30” - DNA com alto conteúdo de GC pode aumentar o tempo e temperatura.
Quais foram as limitações?
Purificação de DNA polimerase
Síntese de oligonucleotideos (primers)
33
Qual a importância de oligos/primers bem desenhados?
Pré-requisito para obter sucesso no PCR
* alta eficiência
* maior sensibilidade
* produtos de PCR específicos
* ausência de co-amplificação com DNA genômico
34
DESENHO DOS PRIMERS
REGRAS GERAIS:
Sequência nucleotídica única – especificidade
Distribuição e composição randômica de bases (conteúdo G/C 45-55% - especificidade
Presença de bases G e C (1-2 bases) na extremidade 3’ terminal - melhor eficiência de priming
Ausência de estruturas secundárias (grampo de cabelo) - melhor eficiência de priming
DESENHO DOS PRIMERS
REGRAS GERAIS:
Ausência de auto-complementaridade - evitar formação de dímeros de primers;
Ausência de complementaridade entre os 2 primers - evitar formação de dímeros de primers;
Ausência de complementaridade entre os primers e a sequência do DNA-alvo fora dos sítios de priming - especificidade e homogeneidade do produto; 
Comprimento dos primers (18 a 25 bases) – especificidade;
Tm similar entre os primers - eficiência da reação.
DESENHO DOS PRIMERS
Softwares para desenho de primers:
Oligo 4.0 - Primer Analysis Software - Wojciech Rychlik (DOS);
Primer Express - PE Biosystems (Mac);
Lasergene - DNASTAR (Windows/Mac);
Vector NTI - Informax Inc. (Windows/Mac).
LIMITAÇÕES DA TÉCNICA
1.Conhecimento da sequência-alvo de amplificação;
	
2. Contaminação com produto pré-amplificado;
3. Especificidade.
	
OTIMIZAÇÃO DO ENSAIO DE PCR
Tempo de extensão;
Temperatura de pareamento;
Concentração do tampão; 
Tempo de rampagem;
Número de ciclos;
Touchdown.
PROBLEMAS
Ausência de bandas; 
Existência de várias bandas; 
Existência de dímeros de primers;
Presença de bandas no controle negativo.
AUSÊNCIA DE BANDAS 
EXISTÊNCIA DE VÁRIAS BANDAS
DÍMEROS DE PRIMERS 
BANDAS NO CONTROLE NEGATIVO
BANDAS NO CONTROLE NEGATIVO
Erro de pipetagem;
Contaminação cruzada com outra amostra;
Contaminação com o produto amplificado;
PARA EVITAR ESTE PROBLEMA
Recomenda-se o uso de três ambientes distintos, fluxo laminar somente para preparar a reação de PCR, material novo, reagentes autoclavados, luvas. Sempre preparar controle negativo..
Tipos de PCR
Hot Start
In situ
Inverse
Long
Multiplex
Nested
Competitive
Touchdown
Degenerate
Fast
47
PCR multiplex – escolha dos marcadores
217
E. necatrix
NcH-J18-217
272
E. maxima
MxL-A09-272
350
E. mitis
MtH-A18-350
460
E. praecox
PrH-J20-460
529
E. tenella
TnH-R01-529
620
E. brunetti
BrC-J18-620
810
E. acervulina
AcI-A03-810
Size (bp)
Species
SCAR Marker
PCR multiplex – determinação da especificidade
600 bp -
 100 bp ladder
 E. acervulina
- E. brunetti 
 E. tenella
 E. praecox
- E. mitis
- E. maxima
E. necatrix
 7 species
- No DNA control
217
E. necatrix
272
E. maxima
350
E. mitis
460
E. praecox
529
E. tenella
620
E. brunetti
810
E. acervulina
Size (bp)
Species
Limitações da PCR convencional
* Intensa padronização;
* Baixa sensibilidade e resolução;
* Curta extensão dinâmica (< 2 logs);
* Colorações não quantitativas;
* Contaminação (brometo);
* Discriminação baseada somente no tamanho do amplicon;
* Necessidade de pós processamento do produto da PCR.
50
51
Representação Gráfica da PCR em tempo real
Real-time PCR with the SYBR® Green I dye. 
O corante torna-se fluorescente (diamantes verdes) quando se liga a dupla fita de DNA
54
Real-time PCR with TaqMan® primers
55
Sequenciamento de genes – um único primer
57
Sequenciamento de genes - elucidação de genoma http://www.ncbi.nlm.nih.gov
58
Aplicação
Aplicação
Os testes moleculares mais comumente empregados 
Aplicação
Os resultados destes ensaios podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico, determinação da terapia a ser utilizada, e até mesmo na avaliação da suscetibilidade a doenças.