SUMARIO - Reação em Cadeia da Polimerase - PCR

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REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE - PCR 
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 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE 
- PCR 
 
 
 
A técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR – polymerase chain reaction) 
permitiu uma grande evolução na ciência e na medicina, principalmente no 
diagnóstico de doenças, incluindo as infecciosas (WEISS, 1995). Em 1993, o cientista 
Kary Mullis ganhou o Prêmio Nobel por ter desenvolvido a técnica de PCR e, a partir 
dessa biotecnologia, diversos projetos científicos e perspectivas foram se fortalecendo, 
uma vez que a PCR é capaz de manipular a molécula de DNA de maneira simples e 
concisa. A amplificação das possibilidades com a PCR fez com que fosse aplicada até 
mesmo fora do campo tradicional da biologia, como a agricultura, a arqueologia 
molecular e as ciências forenses. 
A partir do DNA obtido de amostras biológicas, a reação utiliza a ação de uma 
enzima denominada de DNA polimerase termoestável, ou seja, que consegue suportar 
temperaturas altas sem perder a atividade catalítica (processo conhecido como 
desnaturação) (INNIS et al., 1988). Esta foi, inicialmente, descoberta nas bactérias 
extremófilas Thermus aquaticus, passando a ser chamada de enzima Taq polimerase. 
A reação permite que uma sequência de DNA seja muitas vezes amplificada. Ou 
seja, a partir de uma molécula dupla-fita de DNA, após cada ciclo da reação, há a 
formação do dobro da quantidade de DNA, perfazendo, nesse caso, duas moléculas de 
DNA dupla-fita. Assim, subsequentemente, a amplificação (duplicação da quantidade 
anterior) vai ocorrendo até terminar a reação, gerando, muitas vezes, bilhões de 
cópias do DNA inicial. Para que a reação ocorra, é necessária a utilização de reagentes 
como: DNA; Taq polimerase; íons magnésio, que funcionam como cofator para a Taq; 
nucleotídeos livres (adenina, timina, guanina e citosina), que serão incorporados nas 
sequências a serem polimerizadas; além de pequenos pedaços de DNA, chamados de 
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iniciadores (primers), que são complementares (pareamento de bases) a determinada 
sequência do DNA. 
A próxima etapa é realizada em equipamento específico, o termociclador, 
capaz de alternar temperaturas predeterminadas e específicas da reação. Após a 
execução de aproximadamente 35-40 ciclos de temperaturas, o DNA é amplificado 
bilhões de vezes. Essa ciclagem baseia-se em: desnaturar o DNA a 95°C, perdendo a 
interação das pontes de hidrogênio; diminuir a temperatura para, aproximadamente, 
55-60°C, fazendo com que os iniciadores se complementem às sequências do DNA; e, 
por último, aumentar a temperatura para 72°C, para a ação catalítica da DNA 
polimerase, que incorporará os nucleotídeos livres da reação, formando fitas novas, 
complementares às fitas desnaturadas (Figura 1). Assim, em cada ciclo de três 
temperaturas, o DNA se duplica em uma progressão geométrica. Ao final, haverá uma 
quantidade suficiente a ser detectada e analisada (LORENZ, 2012). 
 
 
Figura 1 – Reação em cadeia da polimerase (PCR). 
 
Existem variações da técnica de PCR que permitem análises diferenciadas e 
mais rápidas para a obtenção dos resultados. Não serão abordadas nesta aula, mas o 
RT-PCR permite que toda análise após a amplificação tenha como origem uma 
molécula de RNA. Isso se torna importante para a detecção de infecções virais em que 
o genoma dos vírus é de RNA, assim como para a identificação e quantificação de RNAs 
mensageiros de algum tecido, fornecendo informações valiosas a respeito da 
expressão de um determinado gene. 
Após alguns anos da padronização da técnica de PCR, uma nova metodologia, 
denominada de PCR em tempo real (qPCR), ganhou espaço dentro das ciências 
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biomoleculares. A otimização do tempo para análise e obtenção dos resultados foi um 
fator importante para seu desenvolvimento, pois permite que, a cada ciclo da reação 
pela Taq DNA polimerase, haja a quantificação logarítmica do DNA que está sendo 
amplificado. Tudo com o auxílio de softwares e sondas, muitas vezes fluorescentes, 
que indicam essa quantificação. 
Com isso, percebe-se que a técnica de PCR está em constante evolução. Novas 
variações são cada vez mais pensadas e desenvolvidas para otimizar e focar 
determinados resultados. A escolha da melhor metodologia culminará em um sucesso 
no resultado e na interpretação de suas hipóteses. 
Tendo em vista a necessidade constante de aplicação da técnica de PCR, vários 
desenvolvedores disponibilizaram no mercado kits diagnósticos praticamente prontos 
para serem utilizados, seja para a correta extração do DNA, seja para a montagem da 
reação enzimática com os reagentes em suas concentrações ideais (PFALLER, 2001). 
No diagnóstico clínico, isso foi um ganho temporal importante. 
Como exemplos dentro das análises clínicas e básicas, a metodologia é muito 
adequada para a identificação de genes de resistência a drogas contra patógenos, 
permitindo uma intervenção mais precisa nos casos de infecção hospitalar. Em 
algumas doenças virais, a utilização da PCR é importante tanto para a detecção quanto 
para a mensuração da carga viral. Existem kits diagnósticos de PCR voltados 
exclusivamente para a detecção de HIV, HCV e, mais recentemente, SarsCov-2 
(coronavírus causador da pandemia). A síndrome respiratória aguda severa (SARS), por 
exemplo, fortalece a importância do diagnóstico eficiente e rápido para a tomada de 
decisões com relação a triagem de pacientes, controle da infecção, tratamento e, 
posteriormente, vacinação – fatores cruciais para a população afetada. Portanto, 
apresenta uma grande sensibilidade e especificidade como teste confirmatório, 
principalmente durante as infecções agudas. 
Como toda técnica molecular é passível de erros, a PCR não escapa dessa 
desvantagem. Como é um método preciso, necessita que todos os reagentes estejam 
em suas concentrações ideais; além disso, é importante que as temperaturas dos ciclos 
estejam de acordo com a especificidade da ação catalítica da enzima, bem como para 
o anelamento dos primers. A correta construção dos primers, por meio de softwares 
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cada vez mais confiáveis, vai denotar grande parte do sucesso da reação. A escolha do 
alvo no DNA está diretamente relacionada ao par de primers. Estes devem ter um 
tamanho entre 18 a 25 nucleotídeos e, intrinsecamente, uma temperatura de 
anelamento com o DNA entre 55°C a 60°C, preferencialmente, podendo variar um 
pouco para mais ou menos. Muitos resultados negativos no PCR são causados por 
pares de primers inespecíficos ou que não estão compartilhando temperaturas ideais. 
Logicamente, o erro na reação pode ser causado por outros fatores, como ausência de 
magnésio como cofator da enzima ou contaminantes na reação inibindo a atividade 
catalítica da Taq DNA polimerase. 
De toda forma, a técnica de PCR tem muitas vantagens, sendo amplamente 
utilizada em centros de pesquisas básicas e aplicadas. Novas biotecnologias de terapia 
gênica e clonagens a utilizam como ferramenta primordial, indicando, possivelmente, 
um futuro próximo que sevivenciará, sabendo que o início de todo esse processo e 
ganho na ciência se baseou nos conhecimentos da replicação do DNA nas células. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
 
 
E-ESCOLA. PCR – Amplificação de DNA in vitro. ULisboa, 2005. Disponível em: http://e-
escola.tecnico.ulisboa.pt/topico.asp?id=339. Acesso em: 8 fev. 2021. 
 
INNIS, M. A.; MYAMBO, K. B.; GELFAND, D. H.; BROW, M. A. DNA sequencing with Thermus 
aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified 
DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of 
America, 85(24), 9436-9440, 1988. 
 
LORENZ, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and 
optimization strategies. Journal of Visualized Experiments, 63, e3998, 2012. 
 
PFALLER, M. A. Molecular approaches to diagnosing and managing infectious diseases: 
practicality and costs. Emerging Infectious Diseases, 7:312-318, 2001. 
 
WEISS, J. B. DNA probes and PCR for diagnosis of parasitic infections. Clinical Microbiology 
Reviews, 8:113-130, 1995. 
 
YANG, S.; ROTHMAN, R. PCR-based diagnostics for infectious diseases: uses, limitations and 
future applications in acute-care settings. Lancet, 4: 337-348, 2004. 
 
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