Espectrofotometria: Análise de Substâncias Biológicas

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Aula 4 – Espectrofotometria 
Profa. Msc. Thayane Antoniolli Crestani 
 
 
FACULDADE CENECISTA DE OSÓRIO 
Métodos de análise quantitativa de 
substâncias biológicas 
As substâncias biológicas são multicomponentais. Ex: plasma 
sanguíneo possui mais de mil substâncias entre água, íons (Na+, K+, 
Cl-, HCO3
-) e diversas moléculas (glicose, uréia, creatinina, 
colesterol, lipídies, hormônios, etc.) 
 
Estudar a composição qualitativa e quantitaiva desses sistemas 
é indispensável  Métodos biofísicos de estudo: permitem 
separar e identificar esses componentes, além de permitir estudo 
de suas propriedade de estrutura e função 
 
O uso da cor como um indicador de concentração por meio de 
instrumentos chamados colorímetros vem sendo feito na química 
analítica há um longo tempo e chama-se de colorimetria 
 
Métodos de análise quantitativa de 
substâncias biológicas 
Os procedimentos fotométricos baseiam-se na medida direta da 
intensidade da cor produzida por uma determinada concentração da 
solução em estudo com a intensidade de uma solução conhecida. 
 
Essa análise deve ser feita numa determinada região do espectro 
luminoso e caracteriza-se pela medida da absorção ou da transmissão 
da luz. 
 
A fotometria não se limita à porção visível do espectro luminoso, 
sendo, também, aplicável na absorção de energia radiante em 
comprimentos de onda () desde o ultravioleta até o infravermelho. 
 
Os instrumentos utilizados em fotometria são os 
fotocolorímetros e espectofotômetros. 
Espectrofotometria 
• É o método de análises ópticas mais usado nas 
investigações biológicas e físico-químicas 
 
• O espectrofotômetro é um instrumento que compara 
a radiação absorvida ou transmitida por uma 
solução. Um feixe energia atravessa a solução e a sua 
absorção oferece informações sobre a qualidade e 
quantidade dos componentes do sistema. 
Espectrofotometria 
• Conceitos fundamentais: 
 
– A energia de radiação é medida em nm (nanômetros)  Letra 
grega λ (lambda) = comprimento de onda; 
– A faixa mais utilizada do espectro vai do ultravioleta (200nm) até 
o infravermelho curto (1.000nm); 
– Faixa visível (percebida pelo olho humano): 400 a 750nm 
– Cor: “sensação psicofísica que associamos a um comprimento 
de onda predominante” 
– Branco (mistura de cores que se anulam): reflete as todas as 
cores 
– Negro : absorve todas as cores 
 
Espectrofotometria 
• Transmitância: é a fração da luz incidente em um comprimento 
de onda específico, que passa por uma amostra de matéria. É a 
razão entre a intensidade da luz transmitida e a intensidade da 
luz incidente. 
 
• Absorbância: É a capacidade do material em absorver radiações 
em frequência específica. A absorbância de uma substância em 
solução é diretamente proporcional a sua concentração e a 
espessura que a luz atravessa. 
 
 O melhor comprimento de onda para uma determinada 
solução é aquele no qual há maior absorção e, portanto, menor 
transmissão de luz; ou seja: maior absorbância e 
menor transmitância. 
 
Absorção de Radiação 
• Os comprimentos de onda que uma certa 
substância absorverão são característicos da 
sua estrutura, diferindo de substância para 
substância. 
 
– DNA e RNA = 260nm 
– Proteínas = 280nm 
– Células bacterianas= 600nm 
Espectrofotometria 
 A transmitância relaciona-se com a concentração, 
porém, de forma não linear. Para fins práticos, ela se 
mostra, portanto, de difícil aplicabilidade. Por essa razão, 
utiliza-se a absorbância. 
Espectrofotometria 
• Espectrofotometria Óptica 
– Comprimento de onda corresponde a luz visível 
ou ultra-violeta: 
• faixa entre aproximadamente 180 a 800 nm 
Espectrofotômetro 
 
• É um instrumento que serve para medir a 
intensidade da luz em função de um 
comprimento de onda específico. 
 
 
Funcionamento de um espectrofotômetro 
– A fonte de luz tem seu feixe localizado pelo colimador (C) e é 
fracionada (decomposta) sobre um prisma de quartzo; 
– Uma fenda seletora escolhe uma porção desse espectro como 
Luz Monocromática (Luz MC) que passa através da cubeta que 
contém a solução onde parte será absorvida e parte será 
transmitida; 
– A fotocélula acoplada ao galvanômetro mede a luz transmitida; 
– A diferença é a luz absorvida; 
– A absorbância será proporcional à concentração da substância 
da cubeta 
https://www.youtube.com/watch?v=R4ZT3g2-Ryg 
 
Funcionamento de um espectrofotômetro de luz 
visível e ultravioleta 
Amostra absorve a luz amarela, deixando 
passar as outras cores. Então aparece uma 
mistura dessas cores, a cor rosa. 
Fontes Luminosas 
• Luz UV 
– Lâmpada de gás hidrogênio 
– Mercúrio 
 
• Luz Visível 
– Tungstênio 
 
 
Cubetas 
• Espectrofotometria de Luz Visível 
– Cubeta de Vidro ou Plástico 
 
• Espectrofotometria de Luz Ultra- Violeta 
– Cubeta de Quartzo 
Determinação da Concentração de substâncias 
 
 
 
Determinação da Concentração de substâncias 
 
 
 
Lei de Lambert-Beer 
 
Lei de Lambert-Beer 
• Através dessa lei, intensidades da radiação 
incidente e emergente podem ser 
relacionadas com as concentrações do 
material presente na solução. 
 
– Efeitos de reflexão, refração e espalhamento não 
são considerados nessa lei. 
– A radiação incidente deve ser monocromática 
Fator de calibração e curva de calibração 
• Na prática diária (para fins clínicos), pode-se 
determinar a concentração de substâncias a partir da 
comparação com concentrações padronizadas 
 
1) Fator de calibração (f) 
 
 
 
Fator de calibração e curva de calibração 
2) Curva de calibração 
– Quando uma substância não segue a lei de Beer (a absorção 
não é linear em função da concentração) não se pode usar 
fator de calibração para dosar essa substância; 
– Nesse caso, recorre-se à curva de calibração  obtida com a 
leitura da absorção de padrões de várias concentrações.