AULA PRÁTICA 03 caracterização de proteínas 2 (2)

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PROPRIEDADE FÍSICAS E QUÍMICAS DAS PROTEÍNAS
I - OBJETIVOS
 
Observar o aumento da solubilidade de proteínas pelo aumento da força iônica da solução (efeito “salting in”);
Promover precipitação de proteínas em altas concentrações de sal (precipitação por sulfato de amônio, efeito “salting out”);
II - INTRODUÇÃO
 
Todas as proteínas e peptídeos (enzimas, hormônios, toxinas, etc) são polímeros formados por unidades monoméricas, os L-aminoácidos. Os peptídeos se diferenciam das proteínas pelo seu baixo peso molecular, o que equivale, aproximadamente, a uma cadeia com até 100 unidades de aminoácidos. As proteínas podem ser separadas uma das outras e de outros tipos de moléculas através de métodos baseados em certas propriedades características, tais como solubilidade, peso molecular, carga elétrica e afinidade por determinados compostos.
 Um processo para caracterizar as proteínas é a solubilidade em determinados solventes e/ou sob determinadas condições. A solubilidade é o resultado de um balanço entre as diferentes interações energéticas que ocorrem inter e intramolecular, via os grupos dos resíduos de aminoácidos (proteína:proteína) e entre a proteína e o solvente (proteína:solvente). Além disso, a presença de grupos carregados positivo ou negativamente de alguns resíduos de aminoácidos favorece a interação entre proteínas e íons presentes na solução. De uma maneira geral, qualquer fator que interfere na estabilidade e equilíbrio desse conjunto de interações provoca uma alteração na solubilidade de proteínas. Assim sendo, a precipitação de proteínas ocorre quando as interações intermoleculares proteína:proteína se tornam mais fortes do que as interações proteína:solvente. Desta forma, a solubilidade de uma proteína (assim como sua estrutura tridimensional) é dependente da concentração e natureza dos sais, polaridade do solvente, pH e temperatura. 
As proteínas possuem uma estrutura tridimensional bem definida que está relacionada com suas propriedades físicas e biológicas. A desnaturação pode ser definida como a modificação na estrutura tridimensional nativa de uma proteína com conseqüente alteração de suas propriedades funcionais. A desnaturação é caracterizada por diminuição da solubilidade, perda da atividade biológica, aumento da reatividade dos grupos da cadeia polipeptídica, etc. A desnaturação envolve alterações nas estruturas quaternária, terciária e secundária das proteínas, mas não da estrutura primária. São vários os agentes desnaturastes de proteínas como, por exemplo, calor, ácidos, álcalis, solventes orgânicos, soluções concentradas de uréia e guanidina, sais de metais pesados, detergentes, etc.
As reações de precipitação, além de serem utilizadas para caracterizar a presença de proteínas em solução, também são úteis para proceder a desproteinização de soluções biológicas para análise de componentes não protéicos. Neste caso específico, a remoção de proteínas contaminantes é freqüentemente acompanhada por métodos drásticos de�
precipitação que acarretam em simultânea desnaturação protéica (agentes desnaturastes). Por outro lado, existem condições que promovem precipitação de proteínas sem contudo causar desnaturação. Estas condições são preferencialmente usadas em protocolos de purificação de proteínas que visam à manutenção da atividade biológica da proteína purificada.
Efeito da concentração do sal na solubilidade de proteínas: precipitação por ação da força iônica
As proteínas demonstram uma enorme variabilidade na solubilidade em função da concentração e natureza dos sais. Estes efeitos, freqüentemente complexos, podem envolver interações específicas entre grupos de aminoácidos carregados e íons em solução ou, particularmente, concentrações altas de sais podem refletir mudanças nas propriedades do solvente.
“Salting in”
O efeito “salting in”: pode ser definido como sendo a propriedade de certos sais em aumentar a solubilidade de uma proteína. Esta propriedade é freqüentemente relacionada com a capacidade de certos sais, como por exemplo: NaCl, em aumentar a força iônica da solução, o que leva a uma maior interação eletrostática entre os íons salinos e os grupos carregados da proteína. Cada um dos grupos iônicos da molécula protéica fica protegido por uma camada de íons salinos de carga oposta, impedindo interações mútuas entre as moléculas protéicas.
“Salting out”
O efeito “salting out”: embora o aumento da concentração da maioria dos sais inorgânicos resulte em aumento na solubilidade das proteínas, existem alguns poucos exemplos, tais como (NH4)2SO4 e Na2SO4, que causam um efeito inverso. Nestes casos, em altas concentrações, esses sais provocam uma diminuição significativa na solubilidade das proteínas. Esse efeito oposto é denominado “salting out” e ocorre com sais que efetivamente competem com a proteína pelas moléculas disponíveis de água, abaixando o grau de solvatação das proteínas. 
 Neste caso, as moléculas das proteínas tendem a se associarem entre elas porque em altas concentrações de sais as interações proteína:proteína se tornam energeticamente mais favoráveis do que as interações proteína:solvente. De uma maneira geral, íons que diminuem a solubilidade de proteínas estabilizam a estrutura nativa de tal forma que as proteínas que precipitam pela adição de sais não são desnaturadas.
 
III - MATERIAIS E REAGENTES
Materiais
● becker
● tubos de ensaio
● bastão de vidro
● pipetas de 1, 2 e de 5 mL
● pipeta Pasteur
● gaze
● funil
  Reagentes
Solução de ovalbumina 
NaCl 0,1 mol.L-1
Solução saturada de sulfato de amônia;
 
IV - PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
PREPARO DA SOLUÇÃO DE OVALBUMINA: bater uma clara de ovo por alguns minutos. Juntar água suficiente para duplicar o volume obtido. Filtrar a mistura obtida (usar um pedaço de gaze) e guardar em geladeira. Preparar de preferência no dia dos experimentos.
 
Precipitação por ação da força iônica
“Salting in”
a) Pipetar 3 mL da solução de ovalbumina em um becker
b) Adicionar solução de cloreto de sódio 0,1 mol.L-1, gota a gota
c) Observar e anotar os resultados
“Salting out”
a) Pipetar 2 mL da solução de ovalbumina em um becker
b) Adicionar 2mL da solução saturada de sulfato de amônia
c) Observar e anotar os resultados
d) Adicionar 4 a 5 mL de água destilada
e) Observar e anotar os resultados
 
V -EXERCÍCIOS
Descreva o que ocorreu na proteína na adição dos sais, relacionando com os processos de “salting in” e “salting out”. Explique se a precipitação que ocorre em uma das fases é reversível.