Cromatografia e HPLC

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Princípios de Cromatografia e 
Cromatografia Líquida
Análise Instrumental II
Prof. Leonardo Cescon
2016.2
Introdução
A Cromatografia é um processo de separação
dos componentes de uma mistura em contato com
duas fases: uma chamada de fase estacionária, fixa,
e outra chamada de fase móvel.e outra chamada de fase móvel.
A separação pode ter o objetivo de
purificação, identificação ou quantificação de
compostos químicos em misturas complexas.
A técnica foi descoberta por um botânico
Russo em 1903, ao tentar separar pigmentos
vegetais em uma coluna contendo carbonato de
cálcio e éter de petróleo como solvente.
Histórico
cálcio e éter de petróleo como solvente.
O termo cromatografia foi utilizado pela
primeira vez em 1906.
Cromatografia = Chroma (cor) + graphe (escrever)
Histórico
Princípios Básicos
• A separação é baseada em diferentes interações que
os diversos componentes da mistura apresentam
com a fase estacionária e a fase móvel.
• As diferentes interações dependem das forças
intermoleculares que regulam a interação dosintermoleculares que regulam a interação dos
componentes com cada fase.
• O componente que interage mais com a fase
estacionária e/ou interage menos com a fase móvel
caminha mais devagar pela fase estacionária. Logo
se diz que o mesmo ficou mais retido.
Classificações
As técnicas cromatográficas podem ser
classificadas de acordo com diferentes critérios
como:
• Por tipo de sistema cromatográfico – montagem;• Por tipo de sistema cromatográfico – montagem;
• Por tipo de fase móvel;
• Por evento que define a separação;
Classificações
Por tipo de sistema cromatográfico – montagem:
• Cromatografia planar:
▫ Cromatografia em papel (CP);▫ Cromatografia em papel (CP);
▫ Cromatografia em camada delgada (CCD);
• Cromatografia em coluna;
Classificações
Por tipo de fase móvel:
• Utilização de fase móvel líquida:
▫ Cromatografia Líquida (CL);
▫ Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)▫ Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
ou HPLC (High Performance Liquid
Chromatography)
• Utilização de fase móvel gasosa:
▫ Cromatografia Gasosa (CG);
Classificações
Por evento que define a separação:
• Partição – Separação por diferença de
solubilidade em duas fases líquidas.
• Adsorção – Separação por interação com fase• Adsorção – Separação por interação com fase
sólida.
• Troca Iônica - Separação por cargas.
• Exclusão por tamanho – Separação por tamanho.
• Afinidade – Separação por afinidade por grupo
funcional específico
Cromatografia em Papel
Cromatografia em Papel
• Tipo mais simples, podendo ser feito até em casa
por utilizar materiais de fácil acesso e baixo custo.
• A fase estacionária é o papel, composto
basicamente por fibras de celulose.basicamente por fibras de celulose.
• Podem ser utilizados diversos solventes como
fase móvel, como água e etanol.
• Pouco utilizada em laboratórios químicos.
Cromatografia em Camada Delgada
• Uma fina camada de fase estacionária sólida é depositada
sobre uma placa metálica ou de vidro.
• Uma pequena porção da amostra é depositada próxima à
base da placa.
• A placa é posicionada com a base em contato com a fase
móvel, como na cromatografia em papel.
Cromatografia em Camada Delgada
• Principais fases estacionárias – Sílica (SiO2) e
Alumina (Al2O3)
•Muito utilizada em laboratórios de química•Muito utilizada em laboratórios de química
orgânica para verificação da pureza de produtos e
identificação da presença de substâncias por
comparação com padrões.
• A análise qualitativa é feita através do cálculo do
fator de retenção (Rf).
Cromatografia em Camada Delgada
Ssolvente
Smancha
Rf



a
Rfa 
s
Rfa 
s
b
Rfb 
s
c
Rfc 
Cromatografia em Camada Delgada
Conclusões:
• Substância B não está
presente;
Amostra Padrões Após Eluição
presente;
• Substância A pode estar
presente;
• Existem outras substâncias
além de A.
A B
Cromatografia em Coluna – Líquida Clássica
• A coluna consiste em um tubo preenchido com a
fase estacionária (recheio da coluna);
• A amostra é colocada no topo da coluna.• A amostra é colocada no topo da coluna.
• Em seguida a fase móvel percorre a coluna sendo
recolhida na outra extremidade.
• Muito utilizada para obter compostos puros, por
isso costuma receber o nome de PREPARATIVA.
Cromatografia em Coluna – Líquida Clássica
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
(CLAE) 
• A CLAE é também muito conhecida pela sigla do
Inglês – HPLC (High Performance Liquid
Chromatography).
• Técnica enquadrada dentro da classe de• Técnica enquadrada dentro da classe de
cromatografia em coluna.
•Técnica muito utilizada para separação, identificação
e quantificação de compostos em misturas complexas e
em quantidades pequenas.
• Não costuma ser utilizada para fins preparativos
como a Cromatografia Líquida Clássica.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
(CLAE) 
Instrumentação Básica:
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
(CLAE) 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
(CLAE) 
Componentes e Funções:
• Bomba: Mantém o fluxo de fase móvel no sistema;
• Injetor: Dispositivo por onde a amostra é introduzida
no sistema;no sistema;
• Coluna: onde ocorre o processo de separação;
• Detector: Mede a intensidade de alguma propriedade
física dos componentes da amostra, permitindo que se
detecte a presença de uma substância diferente da fase
móvel. O sinal deve ser proporcional à concentração do
analito;
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
(CLAE) 
Componentes e Funções:
• Registrador: Interpreta e trata o sinal produzido
pelo detector e cria os chamados
CROMATOGRAMAS;CROMATOGRAMAS;
Mais detalhes sobre cada componente serão 
tratados posteriormente!
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
(CLAE) 
Cromatograma
Gráfico que relaciona intensidade do sinal
produzido pelo detector e o tempo.
O tempo que uma
dada substância demora
para chegar ao detector
à partir da injeção da
amostra é chamado de
tempo de retenção (tR)
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
(CLAE) 
• Na CLAE a separação pode ser por PARTIÇÃO,
ADSORÇÃO, TROCA IÔNICA, EXCLUSÃO POR
TAMANHO OU POR AFINIDADE.
• Os cinco tipos se diferem apenas pela natureza do
material que preenche a coluna e forma portanto a
fase estacionária.
• Os 3 últimos serão tratados no final dada a
particularidade das aplicações.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
(CLAE) 
CLAE por Adsorção – Cromatografia Líquido - Sólido:
• Neste caso a fase estacionária consiste em um
material sólido, como sílica ou alumina.
• A fase estacionária sólida apresenta sítios ativos
capazes de interagir com a fase móvel e com os
componentes da amostra.
• Se a fase estacionária for polar, como a sílica
substâncias polares terão maior interação com a sílica,
ficando mais retidas que substâncias menos polares.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
(CLAE) 
CLAE por Adsorção – Líquido - Sólido:
• Os componentes da amostra devem ser solúveis
na fase móvel. Dessa forma é estabelecido um
equilíbrio entre o analito na forma solubilizada e
adsorvida.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Tipos de Coluna Para Adsorção:
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Principais Fases Móveis Em ordem de 
Polaridade
Hexano < Éter etílico < Diclorometano < 
Clorofórmio < Tetraidrofurano < Etanol < Metanol 
< Acetonitrila < Água
CLAE por Partição – Líquido - Líquido:
•Neste caso a fase estacionária consiste em um
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
•Neste casoa fase estacionária consiste em um
material líquido adsorvido ou ligado quimicamente
em suporte sólido.
CLAE por Partição – Líquido - Líquido:
Fase Adsorvida:
• Primeiramente foi desenvolvida fase estacionária
líquida adsorvida no suporte. Ex: Água adsorvida
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
líquida adsorvida no suporte. Ex: Água adsorvida
em sílica.
• Apresentava a desvantagem da fase estacionária
se desprender do suporte com o uso, e com isso a
coluna não apresentava resultados reprodutíveis.
CLAE por Partição – Líquido - Líquido:
Fase Ligada:
Neste caso o líquido é ligado quimicamente ao
suporte sólido.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
suporte sólido.
• A sílica é o suporte mais utilizado:
R neste caso corresponde à fase ligada e pode ser
constituído de cadeias carbônicas com diferentes
grupos funcionais.
CLAE por Partição – Líquido - Líquido:
• A separação é baseada em diferença de
solubilidade dos componentes da amostra nas duas
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
solubilidade dos componentes da amostra nas duas
fases.
• As diferenças de solubilidade dependem da
polaridade das duas fases.
CLAE por Partição – Líquido - Líquido:
• Ocorre competição pelas duas fases em
solubilizar o analito, se estabelecendo um
equilíbrio:
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
equilíbrio:
Polaridade das Fases Estacionárias -
Classificação
• Fase Normal: Quando a fase estacionária é mais
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
• Fase Normal: Quando a fase estacionária é mais
polar que a fase móvel.
• Fase Reversa: Quando a fase estacionária é menos
polar que a fase móvel.
Fase Normal
• Principais fases estacionárias: Sílica ligada
quimicamente a grupos polares como amina (-NH2) ,
nitrila (-CN) ou hidroxila (-OH).
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Fase Normal
• Principais fases estacionárias:
Fase Normal
•Ordem de eluição: Moléculas menos polares
apresentam menor interação com a coluna, logo são
menos retidas, apresentando menor tempo de
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
menos retidas, apresentando menor tempo de
retenção que as mais polares.
Fase Normal
• Força da fase móvel: Quanto mais polar a fase
móvel maior a capacidade de competir com a coluna
pelo analito, logo maior a força. Fases móveis mais
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
pelo analito, logo maior a força. Fases móveis mais
fortes proporcionam menor tempo de retenção nas
colunas.
Fase Reversa
• Principais fases estacionárias: Sílica ligada
quimicamente a cadeias alquílicas com 4, 8 ou 18
átomos de carbono.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
átomos de carbono.
Fase Reversa
• Ordem de eluição: Moléculas mais polares
apresentam menor interação com a coluna, logo são
menos retidas, apresentando menor tempo de
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
menos retidas, apresentando menor tempo de
retenção que as menos polares.
Fase Reversa 
• Força da fase móvel: Quanto menos polar a fase
móvel maior a capacidade de competir com a coluna
pelo analito, logo maior a força. Fases móveis mais
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
pelo analito, logo maior a força. Fases móveis mais
fortes proporcionam menor tempo de retenção nas
colunas.
Eficiência de Coluna e Resolução 
Cromatográfica
A resolução consiste na capacidade de separação
dos componentes da amostra proporcionada pelas
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
dos componentes da amostra proporcionada pelas
condições cromatográficas. Consiste basicamente na
capacidade de distinção dos picos no cromatograma.
Quando o cromatograma apresenta os picos bem
distintos diz-se que o mesmo está “bem resolvido”.
Caso contrário o cromatograma está “mal resolvido”.
Eficiência de Coluna e Resolução Cromatográfica
A eficiência está relacionada com a capacidade
de uma coluna em produzir boa separação, ou seja,
proporcionar boa resolução. A eficiência é
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
proporcionar boa resolução. A eficiência é
determinada em função do número de pratos teóricos:
H
L
N 
Onde L é o comprimento
da coluna e H é a altura do
prato.
Eficiência de Coluna e Resolução Cromatográfica
• O número de pratos teóricos pode ser entendido
como o número de estágios de separação.
• A determinação experimental do número de pratos
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
• A determinação experimental do número de pratos
teóricos é dada por:
w
t
b
RN
2
2
16
Resolução Cromatográfica
A resolução é relativa a dois picos consecutivos e
pode ser calculada por:
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
2 t
Onde ΔtR é a diferença de tempo de retenção dos picos,
considerando o ponto máximo, e w é a largura de cada
pico. Logo, quanto maior a distância e menor a largura dos
picos, maior a resolução.
)(
2
21 ww
t
Rs
R



Alargamento de Banda e eficiência da Coluna
• Distribuição Gaussiana do pico cromatográfico.
▫ Cada molécula do analito sofre milhares de
transferências entre a fase estacionária e a fase móvel ao
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
transferências entre a fase estacionária e a fase móvel ao
longo da eluição.
▫ As moléculas apenas caminham quando estão na fase
móvel.
▫ O tempo de permanência de uma molécula em cada
fase e completamente aleatório.
Alargamento de Banda e eficiência da Coluna
• Distribuição Gaussiana do pico cromatográfico.
▫ Algumas moléculas podem acidentalmente ficar mais
tempo na fase móvel e caminhar com maior velocidade
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
tempo na fase móvel e caminhar com maior velocidade
enquanto outras ficam mais retidas na fase estacionária.
▫ Assim as moléculas se distribuem uniformemente em
torno de um valor médio onde a maior parte das
moléculas se enquadram.
Alargamento de Banda e eficiência da Coluna
• Alargamento de banda.
▫ A distribuição das moléculas fica mais larga a medida
que o analito percorre a coluna.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
que o analito percorre a coluna.
▫ Assim, quanto maior o tempo de permanência na
coluna maior a chance de alargamento do pico
cromatográfico.
Resolução Cromatográfica
A resolução depende da capacidade de separação
da coluna, mas em geral pode ser melhorada
modificando a fase móvel de maneira a aumentar os
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
modificando a fase móvel de maneira a aumentar os
tempos de retenção dos componentes.
Quando os componentes são eluidos mais 
lentamente a chance de separação é maior!
Caso 1: Separação de Parabenos
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
OO
CH3
OO CH3 OO
CH3
OO CH3
OH OH OH
OH
Metilparabeno Etilparabeno Propilparabeno Butilparabeno
Caso 1: Separação de Parabenos
• Fase Estacionária: Qual seria a recomendada? Polar 
ou apolar?
• Fase Móvel: Que tipo de fase móvel? Polar ou apolar?
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
• Fase Móvel: Que tipo de fase móvel? Polar ou apolar?
Qual o tipo de cromatografia? 
Qual a ordem de saída dos analitos?
Caso 1: Separação de Parabenos
• Fase Estacionária: C18.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
• Fase Móvel: Misturas Acetonitrila:Água.
Caso 1: Separação de Parabenos
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
FM: Acetonitrila:Água
80:20
Caso 1: Separação de Parabenos
CromatografiaLíquida de Alta Eficiência (CLAE) 
FM: Acetonitrila:Água
60:4060:40
Caso 1: Separação de Parabenos
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
FM: Acetonitrila:Água
40:60
Boa resolução, mas tempo de análise alto!
Caso 1: Separação de Parabenos
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
FM: Acetonitrila:Água - 40:60 até 6 min
Após: 60:40
Boa resolução e menor tempo com gradiente!
Formas de Eluição
• Isocrática: Mesma composição de fase móvel
durante toda a análise.
• Gradiente: Composição da fase móvel varia ao
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
• Gradiente: Composição da fase móvel varia ao
longo da análise pela mistura de solventes com
polaridades distintas.
Análise Quantitativa
• Curva de calibração construída pela análise de
soluções de concentração conhecida e variada.
• A área do pico cromatográfico é proporcional à
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
• A área do pico cromatográfico é proporcional à
concentração do analito.
Análise Quantitativa
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Altura do pico
Não é recomendado o uso da altura do pico pois os
picos podem não ser simétricos.
Área do pico
Análise Quantitativa
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Análise Quantitativa
• Normalização de áreas:
• Padronização Interna.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
ATENÇÃO: DISCUTIDOS NO QUADRO PARA 
OS ALUNOS ACORDAREM!
Equipamento – Instrumentação Básica
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Sistema de Injeção - Injetores
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
“Loop”
Sistema de Injeção – Injetores
O loop apresenta volume fixo, sendo responsável pelo controle 
do volume injetado possibilitando as análises quantitativas.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Sistema de Injeção – Injetores
O volume injetado é da ordem de µL. São encontrados 
loops de 20, 50, 100 µL etc. Para amostras muito diluídas é 
injetado um volume maior.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
injetado um volume maior.
Detectores
Um detector ideal em CLAE deve ter as seguintes
características:
• Ser capaz de diferenciar por alguma propriedade físico-
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
• Ser capaz de diferenciar por alguma propriedade físico-
química o analito da fase móvel.
• Alta sensibilidade.
• Resposta rápida.
• Baixa influência da temperatura e da vazão da fase móvel.
• Responder linearmente à concentração do analito.
• Fornecer informação qualitativa em relação ao analito.
Detectores
Os principais detectores são:
• Índice de Refração (IR).
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
• Ultravioleta e Visível (UV/Vis).
• UV/Visível com Diod Array Detector (DAD)
• Espectrômetro de Massas (MS) – Considerado
técnica acoplada e não um simples detector!
Detector de Índice de Refração (IR)
Detecta a diferença de índice de refração entre a
fase móvel e a amostra.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Detector de Índice de Refração (IR)
Principais características:
• Universal.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
• Muito sensível à temperatura.
• Não permite eluição por gradiente. Por quê?
Detector de Ultravioleta e Visível (UV/Vis)
Mede a absorbância do analito em comprimento de
onda definido, dentro da faixa de UV e Visível.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Detector de Ultravioleta e Visível (UV/Vis)
Principais Características:
• Seletivo – Apenas algumas classes de substâncias
absorvem no UV/Vis.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
absorvem no UV/Vis.
• Baixa sensibilidade à temperatura.
• Possibilita gradiente, pois as fases móveis não
costumam absorver no UV/Vis.
Detector de Ultravioleta e Visível (UV/Vis)
Detector com Redes de Diodos (Diod array
detector) – DAD:
• Detector que permite a varredura em toda a faixa de
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
• Detector que permite a varredura em toda a faixa de
comprimento de onda do UV-Vis em tempo muito curto.
• A obtensão do espectro completo permite informações
qualitativas da amostra, sendo esta uma grande vantagem
em relação aos detectores de UV-Vis comum.
Detector de Ultravioleta e Visível (UV/Vis)
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Detecção por Espectrometria de Massas
A espectrometria de massas é uma técnica
espectrométrica de análise qualitativa e quantitativa. Dessa
forma, o espectrômetro de massas não é apenas um
detector, mas sim uma técnica de análise específica e
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
detector, mas sim uma técnica de análise específica e
complexa.
Neste caso, dizemos que a cromatografia líquida está
acoplada à espectrometria de massas e usamos a sigla das
duas técnicas (CLAE-EM ou HPLC-MS).
Fundamentos da Espectrometria de Massas
A análise de massas envolve as seguintes etapas:
• Formação de íons (ionização) – Geralmente íons de carga
positiva unitária. Pode haver fragmentação gerando os
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
positiva unitária. Pode haver fragmentação gerando os
chamados íons fragmentos.
• Separação dos íons formados em função de sua razão
carga/massa (m/z).
• Contagem do número de íons formados de cada tipo,
Fundamentos da Espectrometria de Massas
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Fundamentos da Espectrometria de Massas
Espectro de Massas:
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Fundamentos da Espectrometria de 
Massas
Principais Fontes de íons:
• Impacto por elétrons (IE):
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
▫ Ionização sob pressão reduzida.
▫ Mais utilizada quando acoplada a Cromatografia Gasosa.
▫ Gera grande fragmentação.
▫ Principal mecanismo: captura de elétrons.
Fundamentos da Espectrometria de Massas
Principais Fontes de íons:
Electronspray (ESI):
▫ Ionização a pressão atmosférica. Mais adequada para acoplar
à cromatografia líquida.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
à cromatografia líquida.
▫ Pouca fragmentação.
▫ Adequada para moléculas polares em solventes polares (CL
em fase reversa).
▫ Principal mecanismo: Protonação
Ionização Por Electronspray
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Ionização Por Electronspray
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Ionização Por Electronspray
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Fundamentos da Espectrometria de Massas
Analisadores de Massa:
• Setor Magnético
▫ Funcionamento de mais fácil compreensão.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
• Quadrupolo
▫ Mais utilizado!
• Armadilha de íons
• Tempo de voo.
Fundamentos da Espectrometria de Massas
Setor Magnético
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
rB
22
v
zm rB
.2
.
/
22

Fundamentos da Espectrometria de Massas
Setor Magnético
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Fundamentos da Espectrometria de Massas
Quadrupolo
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Acoplamento LC-MS
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
Cromatograma de Íons Totais
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
• A varredura e formação do espectro de massas é rápida.
Logo, é possível registrar 1 espectro de massas por
segundo, na maioria dos analisadores.
• O cromatograma é então formado pelo somatório do sinal
de todos os picos de massas do espectro em cada intervalo
de tempo.
Cromatograma deÍons Totais
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
HPLC-MS – Informações Qualitativas
• Espectro de massa – Característico de cada molécula.
• Baixa fragmentação por electronspray – Informações
qualitativas pobres. Apenas massa atômica.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
• Mesmo sendo pobres as informações qualitativas podem
ser muito úteis, dependendo do propósito.
• Tecnicas de ionização que geram fragmento são de difícil
acoplamento à HPLC. Geralmente utilizadas para CG.
Detector por Espectrometria de Massas
Principais Características:
• Universal.
• Sensibilidade muito maior que os anteriores.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
• Sensibilidade muito maior que os anteriores.
• Fornece informações qualitativas dos analitos.
• Possibilita eluição por gradiente.
Aspectos Principais
• A fase estacionária costuma ser um gel, por isso a
técnica é muito conhecida Cromatografia de
Permeação em Gel (Gel permeation Chromatography
– GPC).
Cromatografia Por Exclusão de Tamanho
– GPC).
• Separa as moléculas por diferentes tamanhos (ou
volumes).
• Costuma ser utilizada para determinar a massa molar
de macromoléculas e polímeros.
• Pode utilizar mesmos detectores da CLAE por
partição.
Aspectos Principais
A coluna consiste em material poroso, com muitas
cavidades. Dessa forma as moléculas maiores
passam mais rapidamente que as menores, que
Cromatografia Por Exclusão de Tamanho
passam mais rapidamente que as menores, que
conseguem penetrar nos poros do recheio da
coluna.
Aspectos Principais
Cromatografia Por Exclusão de Tamanho
Características Gerais
• Utiliza colunas preenchidas com suporte sólido
ligado a grupos funcionais iônicos. Dessa forma a
coluna é capaz de interagir com espécies de cargas
Cromatografia de Troca Iônica
opostas.
• A separação é baseada nas diferentes interações
dos íons pela coluna.
• Íons de maior carga e menor tamanho ficam mais
retidos.
• Utiliza detectores de Condutividade Elétrolítica.
Colunas Trocadoras de Cátions
Em colunas trocadoras de cátions costumam ser
utilizadas como fase estacionária resinas de
poli(estireno-divinilbenzeno) ligadas a grupo
Cromatografia de Troca Iônica
poli(estireno-divinilbenzeno) ligadas a grupo
sulfônico.
SO3
-
H
+
Colunas Trocadoras de Cátions
A resina apresenta um cátion em equilíbrio com o
cátion H+, o chamado cátion trocável. Em contato
com os cátions da amostra, estes podem substituir
Cromatografia de Troca Iônica
com os cátions da amostra, estes podem substituir
o H+, e interagir com a coluna.
SO3
-
A
+
SO3
-
H
+
+ A
+
+ H
+
Colunas Trocadoras de Cátions
Fase Móvel:
Em colunas trocadoras de cátions, em geral a
Cromatografia de Troca Iônica
Em colunas trocadoras de cátions, em geral a
fase móvel é constituída de solução diluída de HCl,
para manter o cátion H+ na coluna.
Colunas Trocadoras de Ânions
Em colunas trocadoras de ânions costumam ser
utilizadas como fase estacionária resinas ligadas à
sais de aminas.
Cromatografia de Troca Iônica
sais de aminas.
(CH3)3N
+ HCO3
-
Cromatografia de Troca Iônica
Colunas Trocadoras de Ânions
Os ânions presentes na amostras estarão em
equilíbrio com o ânion trocável da coluna.
(CH3)3N
+ HCO3
- + A
-
(CH3)3N
+ HCO3
-
A
- +
Colunas Trocadoras de Ânions
Fase Móvel:
Em colunas trocadoras de ânios, em geral a
Cromatografia de Troca Iônica
Em colunas trocadoras de ânios, em geral a
fase móvel é constituída de solução diluída de
HCO3-/CO3
-2. Neste caso os íons trocáveis são
estes utilizados a fase móvel.
Exemplo de Separação
Cromatografia de Troca Iônica
Cuidados Especiais em CLAE
Pré-coluna:
Ao longo do uso foi percebido que as colunas
sofriam mais danos como entupimentos, contaminação e
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
sofriam mais danos como entupimentos, contaminação e
degradação da fase estacionária mais acentuadas no início
da coluna, por ser a parte que tem o primeiro contato com a
fase móvel.
Para evitar que toda a coluna tenha que ser trocada
com frequência, é o comum o uso de pré-colunas.
Cuidados Especiais em CLAE
Pré-coluna:
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Cuidados Especiais em CLAE
Filtração da fase móvel:
Impurezas como poeiras e materiais
particulados em geral provocam entupimento da
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particulados em geral provocam entupimento da
coluna aumentando a pressão do sistema e
prejudicando a passagem de fase móvel pela
coluna.
A fase móvel costuma ser filtrada pela
passagem por membranas de 0,45 µm.
Cuidados Especiais em CLAE
Filtração da fase móvel:
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Cuidados Especiais em CLAE
Filtração das amostras:
As amostras devem ser filtradas pelos
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mesmos motivos da filtração da fase móvel. Em
geral, também com filtros de 0,45 µm.
Cuidados Especiais em CLAE
Filtração das amostras:
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