Relatório de bioquimica - quantificação de proteínas

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Universidade Federal de Itajubá 
Ciências Biológicas 
Prática de Bioquímica 
 
 
 
 
 
 
 
Relatório de aula prática 
 
Quantificação de proteínas solúveis: 
Método de Bradford (1976) 
 
 
 
 
 
 
 
 
Giovana Cabral 
Giulia Camerini 
Isadora Magalhães 
 
 
Professor Marcelo C. Matsudo 
Itajubá 2018 
 
I. Introdução 
 O método de Brandford consiste na utilização do corante “Coomassie brilliant 
blue” (BG-250) que ocasiona uma mudança de coloração na solução ao interagir com 
proteínas. Essa coloração varia de acordo com a concentração da proteína encontrada. 
 A interação ocorre quando a proteína tem estrutura macromolecular a partir de 
oito ligações peptídicas. Portanto, o peso molecular dessa molécula será alto suficiente 
para interação do corante causar um deslocamento de equilíbrio aniônico. Neste 
momento, a absorbância atinge o máximo comprimento de onda de 595nm. 
 De acordo Lei de Beer-Lambert, quando uma faixa de luz monocromática 
atravessa uma solução colorida, a quantidade de luz absorvida é diretamente 
proporcional à concentração da solução colorida e à espessura da camada atravessada. 
Utilizando o valor de absorbância obtido pode ser convertido em uma curva de 
calibração, o que resultará na concentração de proteínas presentes na amostra. 
 
II. Objetivo 
Determinar a concentração de proteína em uma amostra biológica (suco de soja) 
através do método de Bradford 
III. Material 
 Coomassie Brillant Blue G-250 
 Etanol 95% 
 Ácido fosfórico 85% 
 Albumina de soro bovino (1mg/mL) 
 Amostra: suco a base de soja 
 Espectrofotômetro 
 Tubos de ensaio 
 
IV. Procedimento 
 Enumerou-se os tubos de 1 a 7 para identificação. 
 No tubo 1, com a pipeta automática, foram adicionados 100 µL de H2O e 2,5 
mL de Comassie blue, agitou-se o tubo de ensaio, esperou-se cerca de 2 minutos 
e a solução foi colocada no espectrofotômetro, obtendo a absorbância de 0nm já 
que não houve a adição de albumina. 
 No tubo 2, com a pipeta automática, foram adicionados 10 µL de Albumina, 90 
µL de H2O e 2,5 mL de Comassie blue, agitou-se o tubo de ensaio, esperou-se 
cerca de 2 minutos e a solução foi colocada no espectrofotômetro, obtendo a 
absorbância de 0.240 nm e a concentração de 0,1g/L de Albumina. 
 No tubo 3, com a pipeta automática, foram adicionados 20 µL de Albumina, 80 
µL de H2O e 2,5 mL de Comassie blue, agitou-se o tubo de ensaio, esperou-se 
cerca de 2 minutos e a solução foi colocada no espectrofotômetro, obtendo a 
absorbância de 0. 374 nm e a concentração de 0,2g/L de Albumina. 
 No tubo 4, com a pipeta automática, foram adicionados 40 µL de Albumina, 60 
µL de H2O e 2,5 mL de Comassie blue, agitou-se o tubo de ensaio, esperou-se 
cerca de 2 minutos e a solução foi colocada no espectrofotômetro, obtendo a 
absorbância de 0. 548 nm e a concentração de 0,4g/L de Albumina. 
 No tubo 5, com a pipeta automática, foram adicionados 60 µL de Albumina, 40 
µL de H2O e 2,5 mL de Comassie blue, agitou-se o tubo de ensaio, esperou-se 
cerca de 2 minutos e a solução foi colocada no espectrofotômetro, obtendo a 
absorbância de 0. 906 nm e a concentração de 0,6g/L de Albumina. 
 No tubo 6, com a pipeta automática, foram adicionados 80 µL de Albumina, 20 
µL de H2O e 2,5 mL de Comassie blue, agitou-se o tubo de ensaio, esperou-se 
cerca de 2 minutos e a solução foi colocada no espectrofotômetro, obtendo a 
absorbância de 1.125 nm e a concentração de 0,8g/L de Albumina. 
 No tubo 7, com a pipeta automática, foram adicionados 100 µL de Albumina, 0 
µL de H2O e 2,5 mL de Comassie blue, agitou-se o tubo de ensaio, esperou-se 
cerca de 2 minutos e a solução foi colocada no espectofotômetro, obtendo a 
absorbância de 1.459 nm e a concentração de 1,0g/L de Albumina. 
 
V. Resultados e discussões 
Após a elaboração da tabela, foi feito um gráfico resultante dos dados encontrados 
realizando o experimento. 
Tubo Albumina 
(µL) 
 
(µL) 
Fator de 
diluição 
Comassie 
blue 
(mL) 
Albumina 
(g/L) 
Absorbância 
595nm 
1 0 100 - 2,5 0 0nm 
2 10 90 10x 2,5 0,1g/L 0.240nm 
3 20 80 5x 2,5 0,2g/L 0.374nm 
4 40 60 2,5x 2,5 0,4g/L 0.548nm 
5 60 40 1,66x 2,5 0,6g/L 0.906nm 
6 80 20 1,25x 2,5 0,8g/L 1.125nm 
7 100 0 1x 2,5 1g/L 1.459nm 
Tabela 1- Absorbância em relação à concentração de albumina em diferentes tubos. 
 
 
 
 
 
Gráfico 1 - Absorbância por concentração de albumina. 
Segundo o gráfico obtido, a equação da concentração de proteína (no caso do 
experimento, albumina) por absorbância é igual a y= 0,7157x – 0,0328. Substituindo o 
valor x por 0.664nm - valor obtido através da amostra de suco disponibilizada – temos, 
aproximadamente, 0,4424g/L de proteína. 
Como a amostra foi diluída 10x, temos 0,4424 x 10 = 4,424 g/L de proteína. 
1,2 g/L ------ 0.2 L 
X --------------- 1 = 6 g/L 
Segundo o rótulo da amostra fornecida, há 6 g/L de proteína no suco, porém , 
segundo o experimento, foi calculado o valor de 4,424 g/L. 
Os diferentes valores demonstram uma possível falha nas etapas do 
procedimento desse experimento, como a dosagem em pipetas, marcações erradas. Ou 
um erro do próprio fabricante ao apontar a quantidade de proteína por litro no suco. 
Por fim, foi visto que o valor de R² = 0,9921 é próximo ao valor ideal de 1. 
VI. Conclusão 
Durante o preparo das soluções-padrão, a dissolução da albumina bovina em 
tampão salino se mostrou uma estratégia eficiente para eliminar a necessidade de 
agitação excessiva e aquecimento, sendo assim possível determinar a concentração 
de Albumina e a absorbância nas soluções. 
VII. Referência Bibliográfica 
 
Bradford, M. Analytical Biochemistry. 72, 248-254, 1976 
Elaboração de curva de calibração para a quantificação de proteínas pelo método de 
Bradford. USP Digital, 2012.