Mapeamento Genético

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MAPEAMENTO GENÉTICO 
INTRODUÇÃO 
O mapa genético de uma espécie é um modelo abstrato do arranjo linear de um grupo de genes 
ou marcadores (veja o exemplo do mapa genético do cacaueiro). Para a construção de um mapa de 
ligação é necessário que os genes ou marcadores sejam de herança simples. As seguintes etapas devem 
ser seguidas para a construção de um mapa de ligação ou mapa genético: 
 Fazer teste de segregação de cada marca, constatando que as proporções estão dentro de 
valores esperados para a população de trabalho; 
 Estimar a frequência de recombinação entre pares de marcadores; 
 Agrupar os marcadores em diferentes grupos de ligação; 
 Definir a ordem dos marcadores em cada grupo de ligação; 
 Estimar a frequência de recombinação multiponto entre marcadores adjacentes. 
 MAPA FÍSICO 
 Mapas físicos podem ser obtidos a partir das técnicas de bandeamento cromossômico e 
hibridização in-situ (mapa citogenético); pelo ordenamento de fragmentos de restrição (mapa de 
restrição) ou pelo sequenciamento do genoma. 
RELAÇÃO ENTRE MAPA GENÉTICO E MAPA FÍSICO 
 Tanto o mapa genético pode ser utilizado para aumentar a resolução de mapas físicos, como 
mapas físicos podem ser utilizados para aumentar a resolução de mapas genéticos. Quando 
comparados, ambos devem refletir a mesma estrutura genômica, ou seja, a ordem dos marcadores deve 
ser a mesma (embora a distância possa variar de um mapa para outro). A informação combinada dos 
dois tipos de mapa é a chave para a clonagem de genes. Considerando um gene flanqueado por dois 
marcadores moleculares, para se chegar a sequência do gene partindo dos marcadores, centenas de 
milhares de pb deverão ser sequenciadas até se chegar ao gene. Se por outro lado for feito o 
mapeamento físico da região flanqueada pelos marcadores moleculares, é possível identificar os clones 
que contém partes do gene (pela distância estimada entre os marcadores e o gene) e sequenciar apenas 
estes clones. 
POPULAÇÕES DE MAPEAMENTO 
Para o mapeamento genético de plantas, diversos tipos de populações podem ser utilizados, cada 
uma com características próprias, apresentando vantagens e desvantagens que devem ser levadas em 
consideração pelo pesquisador no memento da escolha. A escolha da população deve levar em conta 
os objetivos a que se propõe o pesquisador, além do tempo disponível para a execução do trabalho, e 
dos recursos disponíveis. As populações de mapeamento com o maior conteúdo de informação são 
aquelas obtidas a partir do cruzamento entre dois indivíduos homozigotos contrastantes. Nas plantas 
F1 obtidas, o desequilíbrio de ligação é máximo, e as populações derivadas a partir destas plantas 
F1 procuram explorar este desequilíbrio. 
- Populações F2: obtidas por autofecundação das plantas F1 obtidas do cruzamento entre 
parentais endogâmicos. Nestas populações, os marcadores co-dominantes segregam na proporção 
1:2:1, e os marcadores dominantes segregam na proporção 3:1. Populações híbridas, oriundas do 
cruzamento entre parentais heterozigotos também podem ser analisadas com F2, desde que os 
marcadores segreguem na proporção esperada. 
- Populações derivadas por autofecundação a partir da geração F2. Em programas de 
melhoramento genético de plantas, são comuns populações derivadas por autofecundação, a partir da 
geração F2 (tais como F3, F4, etc...). Se um mesmo número de plantas F3 é obtido de cada planta F2, ou 
um mesmo número de plantas F4 é obtida de cada planta F3, e assim por diante, estas populações podem 
ser utilizadas para mapeamento genético. 
- Linhagens Endogâmicas Recombinantes (Recombinant Imbreed Lines - RILs): são também 
populações derivadas por autofecundação a partir de uma população F2, porém as populações são 
avançadas até atingirem um elevado grau de homozigose, pelo método da descendência de uma única 
semente (SSD). Desta forma, cada planta F2 gera uma planta F3, que por sua vez gera uma planta F4 e 
assim por diante. Quando a população atinge a geração F6 ou F7, abrem-se linhas, que são as RILs. 
Desta forma, cada planta F2 é representada por uma linha endogâmica homozigota. Assim, toda a 
variabilidade existente na população F2 original estará representada pelas RILs, desde que um tamanho 
de população adequado seja utilizado. Como todos os locos estão em homozigose, a variância de uma 
população composta por RILs é geralmente o dobro da variância na geração F2. 
- Duplo Haplóides: obtidas pela duplicação do número de cromossomos de grãos de pólen. Todos 
os indivíduos são homozigotos e representam a variabilidade genética encontrada no indivíduo parental 
que produziu os grãos de pólen. 
- Retrocruzamento: são obtidas pelo cruzamento de plantas F1 com um dos progenitores. Apenas 
dois genótipos são obtidos (heterozigotos: Aa; e homozigotos para o progenitor recorrente: aa). 
 MARCADORES MOLECULARES 
Para analisar corretamente os dados moleculares, é necessário ter conhecimento de como esses 
dados são obtidos. Por este motivo, vamos listar as características dos marcadores moleculares 
atualmente mais utilizados em mapeamento genético (RFLP, RAPD, Microssatélites e AFLP). 
Marcadores RFLP (Restriction Fragment Lenght Polimorphism) 
Consiste na digestão (corte) do DNA com enzimas de restrição e hibridização com sondas de DNA. 
O DNA digerido é submetido a eletroforese em gel de agarose. O produto deste gel é um "arraste" de 
DNA, pois são gerados muitos fragmentos de diferentes tamanhos. O DNA é transferido do gel para uma 
membrana de nitrocelulose, onde também é colocada uma sonda (fragmento de DNA) marcada, 
geralmente com radioatividade (também pode ser por fluorescência). A revelação é feita em filme de raio 
X, e apenas os fragmentos que hibridizarem com a sonda produzirão uma impressão (banda) no filme. 
É uma técnica relativamente complexa, que requer grande quantidade de DNA em sua execução. Possui 
herança co-dominante (os três genótipos de um loco podem ser identificados), mas requer conhecimento 
prévio do genoma para o desenvolvimento das sondas. Por ser uma técnica altamente reprodutível, e 
por usar sondas de DNA, permite o mapeamento comparativo. As sondas geralmente são partes de 
genes, e portanto esta técnica analisa regiões codificadoras do genoma. 
A técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction) 
Esta técnica consiste na síntese in vitro de fragmentos de DNA. São colocados em uma reação, 
juntamente com o DNA genômico, um par de "primers", os oligonucleotídios (ATP, TTP, CTP e GTP), a 
enzima DNA polimerase, e os co-fatores necessários para a síntese de DNA. "Primers" são pequenos 
fragmentos de DNA, com tamanhos que podem variar de menos de 10 até mais de 20pb, dependendo 
do objetivo da análise. A utilização da enzima DNA polimerase obtida da bactéria 
Thermophilus aquaticus (Taq DNA polimerase), que é resistente a altas temperaturas, a técnica de PCR 
pode ser automatizada. Para a amplificação de um fragmento de DNA são necessárias três etapas: 
desnaturação, anelamento e síntese. Vários ciclos contendo estas três etapas são realizados na técnica 
de PCR. 
Marcadores moleculares derivados de PCR. 
RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) 
 Utiliza apenas um "primer" de seqüência aleatória, com 10 bases. Teoricamente é possível 
sintetizar 5.040 "primers", combinando os quatro em seqüências aleatórias de 10. Algumas 
combinações no entanto não podem ser utilizadas. Um "primer" deve conter algumas características 
especiais, tais como: 
 Não possuir extremidades coesivas, para não anelar-se consigo mesmo; 
 Possuir mais de 50% de GC em sua composição, para que a ligação com o DNA molde seja 
mais estável (G e C são ligados por três pontes de hidrogênio, enquanto A e T são ligados por duas);Possuir G ou C na extremidade 5', para que a ligação seja mais estável no local de início da 
síntese da nova fita; 
 Nem todos os "primers" disponíveis obedecem a estas regras. 
Considerando que a seqüência do genoma de uma espécie seja aleatória, um "primer" com 10 
bases deve encontrar um sítios de anelamento a cada 410 pb. Para que uma região seja amplificável é 
necessário que o "primer" encontre dois sítios em sentido oposto em um intervalo máximo de 5000 pb. 
A probabilidade de que isto ocorra é: 
(5.000 / 410) x (1/410) = 4,5 x 10-9 
O número de bandas esperado para cada "primer" RAPD é 4,5 x 10-9 x G, onde G é o tamanho do 
genoma haplóide, em pb. Por exemplo, o genoma da soja possui 1,8x109 pb, e cada "primer" deve 
produzir em média 8,1 bandas. 
Por utilizar "primers" aleatórios, o RAPD mapeia todo o genoma, e não requer conhecimento prévio 
do genoma (o mesmo conjunto de "primers" pode ser utilizado para diferentes espécies). Como o DNA 
é amplificado muitas vezes, requer quantidades mínimas de DNA. Além de ser derivada de PCR, a 
separação dos fragmentos é feita em gel de agarose, o que torna a técnica relativamente simples e de 
custo reduzido, além de poder ser automatizada. Não utiliza radiatividade, e os fragmentos são corados 
com Brometo de Etídio e visualizados sob luz ultra-violeta. 
As desvantagens do RAPD é que a técnica nem sempre é reprodutível, a presença de uma banda 
na mesma posição em dois indivíduos diferentes não é garantia de que são os mesmos alelos (podem 
ser fragmentos do mesmo tamanho amplificadosem locos diferentes), a ausência de uma determinada 
banda em dois indivíduos não significa que seja o mesmo alelo (apenas que ambos possuem alelo 
diferente daquele que é amplificado). Além disso, a técnica é dominante, ou seja, o heterozigoto possui 
o mesmo padrão de um dos homozigotos. 
MICROSSATÉLITES (SSR - Single Sequence Repeat) 
Microssatélites são regiões do genoma que contém sequências curtas (de 2 a 5 pb) repetidas 
várias vezes. As sequências que flanqueiam estas regiões são conservadas dentro da mesma espécie, 
o que permite que se construam " primers " que amplifiquem, via PCR, o mesmo loco, em todos os 
indivíduos da espécie. Diferentemente do RAPD, para amplificar locos de microssatélites utiliza-se um 
par de "primers", cada um com sítio de anelamento localizado em um dos lados da região repetitiva. O 
polimorfismo encontrado é de tamanho de fragmentos, e é devido ao número diferente de cópias 
das sequencias repetitivas. 
AFLP (Amplified Fragment Lenght Polimorphism) 
Esta técnica reúne a especificidade das enzimas de restrição com a praticidade do PCR. Após a 
digestão do DNA genômico com enzimas de restrição, são ligados adaptadores nas extremidades dos 
fragmentos gerados. Os adaptadores podem ser ligados, pois o corte com as enzimas de restrição produz 
extremidades desencontradas que são utilizadas para ligar os adaptadores. São utilizadas duas enzimas 
de restrição, uma de corte frequente (o sítio de restrição possui 4 pb) e uma de corte raro (sítio de 
restrição com 6 pb). São gerados 3 tipos de fragmentos: a) com ambas as extremidades cortadas pela 
enzima de corte frequente, b) com ambas as extremidades cortadas pela enzima de corte raro, e c) com 
uma extremidade cortada com cada enzima. Estes últimos são amplificados para aumentar 
sua frequência na amostra de DNA a ser avaliada. " primers " complementares aos adaptadores, e com 
diferenças nas 3 últimas bases da extremidade 3' são utilizados para amplificar os fragmentos de AFLP. 
Os " primers " possuem cerca de 20 bases, o que garante especificidade e reprodutibilidade aos 
resultados. Como o polimorfismo é dado pela presença ou ausência do sítio de anelamento do " primers", 
o resultado é observado como presença ou ausência de banda, sendo o AFLP também um marcador 
dominante, como o RAPD. É uma técnica sofisticada, e que envolve muitas etapas. O sítio 
de anelamento do "primer" é constituído das três bases da extremidade3' do "primer" (o restante do 
"primer" anela no adaptador), e portanto muitas bandas são amplificadas por cada combinação de " 
primers ". Géis de sequenciamento devem ser utilizados na separação dos fragmentos amplificados. 
Utiliza radioatividade ou fluorescência para a visualização dos fragmentos.