Relatório Bioq T e pH pronto

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QUI1769 – LABORATÓRIO DE BIOQUIMICA
PRÁTICA:
Cinética Enzimática: Efeitos da Temperatura e do pH na Atividade Enzimática
1) Objetivo
Observar o efeito de diferentes temperaturas e diferentes pH do meio reacional sobre a atividade enzimática da enzima invertase. Analisar e discutir sobre a temperatura ótima da reação, pH ótimo da enzima, temperatura e pH de maior estabilidade.
2) Resultados e Discussões
Efeito da temperatura na atividade enzimática
	Tubo
	Temperatura (°C)
	Abs
(540 nm)
	Fator (µmol/mL)
	Produto (µmol/mL)
	Tempo (min)
	Velocidade (µmol/mL.min)
	1
	0,0
	0,1240
	7,984
	0,9900
	5
	0,1980
	2
	22,0
	0,501
	7,984
	4,0000
	5
	0,8000
	3
	55,0
	0,942
	7,984
	7,5209
	5
	1,5042
	4
	100,0
	0,032
	7,984
	0,2555
	5
	0,0511
Tabela 1: Dados experimentais do efeito da temperatura em meio reacional de pH = 4,6.
	Tubo
	Temperatura (°C)
	Abs
(540 nm)
	Fator (µmol/mL)
	Produto (µmol/mL)
	Tempo (min)
	Velocidade (µmol/mL.min)
	1
	0,0
	0,1759
	9,25
	1,6271
	5
	0,3254
	2
	22,0
	0,3427
	9,25
	3,1700
	5
	0,6340
	3
	55,0
	0,5728
	9,25
	5,2984
	5
	1,0597
	4
	100,0
	1,5675
	9,25
	14,4994
	5
	2,8999
Tabela 2: Dados experimentais do efeito da temperatura em meio reacional de pH = 2,6. 
Através das tabelas acima, foi possível o construir o seguinte gráfico:
Gráfico 1: Efeito da temperatura na atividade enzimática em meio reacional de pH = 4,6 e pH = 2,6.
Inicialmente, o aumento da temperatura aumenta a velocidade de reação. No entanto, a partir de um determinado valor de temperatura a proteína enzimática começa a desnaturar, diminuindo a sua atividade enzimática. Logo, é verificado que existe uma temperatura ótima para qual a reação apresenta velocidade máxima (pico do gráfico) e corresponde a região entre a temperatura que favorece a reação e a temperatura de desnaturação da enzima.
Analisando o gráfico 1 acima, foi possível observar que com o aumento da temperatura, houve o aumento da atividade enzimática em ambos os valores de pH. Porém, enquanto para o pH 2,6 o crescimento da atividade enzimática se manteve contínuo, para o pH 4,6 esse crescimento se deu até a temperatura de 55°C e depois começou a decair até a temperatura de 100°C, na qual sua atividade é quase nula. Um dos fatores que influenciam na desnaturação enzimática é a temperatura. Esse processo pode ocasionar a perda, reversível ou não, de sua atividade. Sendo assim, podemos concluir que a enzima invertase em pH 4,6 a 100°C desnaturou, possuindo um valor de absorbância de 0,032 e uma velocidade de 0,0511, muito próxima de zero. Ainda analisando o gráfico 1, observou-se que a temperatura ótima para a reação em pH 4,6 é de 55°C e para a reação em pH 2,6 é de 100°C, pois nessas temperaturas a enzima apresenta maior velocidade.
Efeito da temperatura na estabilidade da enzima
	Tubo
	Temperatura (°C)
	Abs
(540 nm)
	Fator (µmol/mL)
	Produto (µmol/mL)
	Tempo (min)
	Velocidade (µmol/mL.min)
	1
	55,0
	0,608
	8,7
	5,2896
	15
	1,0579
	2
	55,0
	0,556
	8,7
	4,8372
	10
	0,9674
	3
	55,0
	0,593
	8,7
	5,1591
	5
	1,0318
	4
	55,0
	0,627
	8,7
	5,4549
	1
	1,0910
Tabela 3: Dados experimentais do efeito da temperatura (55°C) na estabilidade da enzima em pH = 4,6.
	Tubo
	Temperatura (°C)
	Abs
(540 nm)
	Fator (µmol/mL)
	Produto (µmol/mL)
	Tempo (min)
	Velocidade (µmol/mL.min)
	1
	100,0
	0,008
	9,69
	0,0775
	15
	0,0155
	2
	100,0
	0,008
	9,69
	0,0775
	10
	0,0155
	3
	100,0
	0,008
	9,69
	0,0775
	5
	0,0155
	4
	100,0
	0,008
	9,69
	0,0775
	1
	0,0155
Tabela 4: Dados experimentais do efeito da temperatura (100°C) na estabilidade da enzima em pH = 4,6. 
Através das tabelas acima, foi possível o construir o seguinte gráfico:
Gráfico 2: Efeito da temperatura (55°C e 100°C) na estabilidade da enzima em pH = 4,6.
Analisando o gráfico 2, é possível observar que a enzima apresentou maior estabilidade na temperatura de 55°C, pois foi a temperatura em que a atividade se mante constante. O resultado obtido do comportamento da enzima para a temperatura de 100°C ocorreu como o esperado. Como visto anteriormente, a enzima invertase em pH 4,6 a 100°C, sofre desnaturação. Assim, possui valores de absorbância e de velocidade muito próximos de zero.
Efeito do pH sobre a atividade enzimática:
	Tubo
	pH
	Abs
(540 nm)
	Fator (µmol/mL)
	Produto (µmol/mL)
	Tempo (min)
	Velocidade (µmol/mL.min)
	
	
	
	
	
	
	
	1
	2,6
	0,233
	9,2000
	2,1436
	5
	0,4287
	2
	3,6
	0,29
	9,2000
	2,6680
	5
	0,5336
	3
	4,6
	0,33
	9,2000
	3,0360
	5
	0,6072
	4
	5,6
	0,42
	9,2000
	3,8640
	5
	0,7728
	5
	7,0
	0,098
	9,2000
	0,9016
	5
	0,1803
Tabela 5: Dados experimentais do efeito do pH sobre a atividade enzimática em T =26°C
	Tubo
	pH
	Abs
(540 nm)
	Fator (µmol/mL)
	Produto (µmol/mL)
	Tempo (min)
	Velocidade (µmol/mL.min)
	
	
	
	
	
	
	
	1
	2,6
	0,1941
	8,5733
	1,6641
	5
	0,3328
	2
	3,6
	0,5757
	8,5733
	4,9356
	5
	0,9871
	3
	4,6
	0,509
	8,5733
	4,3638
	5
	0,8728
	4
	5,6
	0,2394
	8,5733
	2,0524
	5
	0,4105
	5
	7,0
	0,0579
	8,5733
	0,4964
	5
	0,0993
Tabela 6: Dados experimentais do efeito do pH sobre a atividade enzimática em T =55°C
A partir dos dados obtidos experimentalmente foi possível construir o gráfico velocidade versus pH nas temperaturas 26°C e 55°C.
Gráfico 3: Efeito do pH na atividade enzimática nas temperaturas 26°C e 55°C
O pH é um fator que influencia diretamente a reação enzimática. Logo, valores de ph extremos modificam irreversivelmente a estrutura da enzima, desnaturando-a. A mudança de pH pode também influenciar modificando ligações e também o estado de ionização dos substratos e dos aminoácidos
O valor de pH correspondente à maior atividade é chamado de ph ótimo. Valores afastados do ph ótimo podem modificar a estrutura da enzima indicando a desnaturação. A partir do gráfico 3 acima, foi encontrado para a enzima invertase o valor de ph ótimo aproximadamente 3,6 na temperatura de 55°C e o valor de pH ótimo aproximadamente 5,6 para a temperatura de 26°C.
Estabilidade do pH:
	Tubo
	pH
	Abs (540nm)
	Fator
	Produto (µmol/ml)
	Tempo (min)
	Velocidade (µmol/mL.min)
	
	
	
	
	
	
	
	1
	4,6
	0,2303
	8,19
	1,8862
	20
	0,3772
	2
	4,6
	0,1977
	8,19
	1,6192
	15
	0,3238
	3
	4,6
	0,2542
	8,19
	2,0819
	10
	0,4164
	4
	4,6
	0,2871
	8,19
	2,3513
	5
	0,4703
	5
	4,6
	0,334
	8,19
	2,7355
	1
	0,5471
Tabela 7: Dados experimentais da estabilidade do ph com tampão 4,6 em T=27°C
	Tubo
	pH
	Abs (540nm)
	Fator
	Produto (µmol/ml)
	Tempo (min)
	Velocidade (µmol/ml.min)
	
	
	
	
	
	
	
	1
	2,6
	0,11
	10,72
	1,1792
	20
	0,2358
	2
	2,6
	0,194
	10,72
	2,0797
	15
	0,4159
	3
	2,6
	0,19
	10,72
	2,0368
	10
	0,4074
	4
	2,6
	0,176
	10,72
	1,8867
	5
	0,3773
	5
	2,6
	0,312
	10,72
	3,3446
	1
	0,6689
Tabela 8: Dados experimentais da estabilidade do ph com tampão 2,6 em T=27°C
A partir dos dados obtidos nas tabelas 7 e 8 foi possível construir os gráficos velocidade versus tempo.
Gráfico 4: Estabilidade do pH na atividade enzimática nos ph 4,6 e 2,6
A estabilidade ao pH é um parâmetro essencial, pois é fundamental que as enzimas apresentem a habilidade de manter sua capacidade catalítica e também a sua conformação estrutural em diferentes condições de reação ao longo do tempo. A partir do gráfico 4, foi identificado que a enzima invertase apresenta maior estabilidade em ph 4,6, pois neste pH a variação da atividade enzimática apresentou-se menor em relação ao pH 2,6.
3) Conclusão
A velocidade da reação enzimática é condicionada por diversos fatores, entre os quais o ph e a temperatura do meio onde ocorre a reação. Através da prática realizada, observou-se que as enzimas podem sofrer modificações tanto estruturais quanto iônicas em decorrênciada variação do ph e temperatura do meio aonde se encontram. Logo, a partir dos gráficos obtidos foi possível observar a temperatura ótima e o ph ótimo da invertase nas condições analisadas, ou seja, a região aonde a atividade enzimática apresentou-se máxima. A temperatura ótima para a reação em pH 4,6 é de 55°C e para a reação em pH 2,6 é de 100°C. Em T=26°C foi identificado o ph ótimo de aproximadamente 3,6 e para T=55°C foi encontrado o ph ótimo de 5,6. A estabilidade da temperatura e do ph também foram analisados. A temperatura onde a invertase apresentou-se mais estável foi de 55°C e o ph de 4,6. É importante considerar que em valores afastados do ph e temperatura ótimos podem levar a desnaturação da enzima, pois longe destes valores a atividade enzimática é menor, podendo ser nula.