Aula 20 - Metabolismo do RNA (transcriç¦o)

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Metabolismo do RNA
	O RNA tem função de armazenar e transmitir informações, além de função catalítica na forma de RNA ribossomal (ribozimas). Conhecem-se há muito tempo as moléculas de RNA mensageiro, RNA ribossomal e RNA transportador. Porém, atualmente descobriram-se novas moléculas de RNA que não se encaixam em nenhuma das supracitadas. Acredita-se que essas moléculas tenham a função de regulação da expressão gênica. 
	A transcrição é um processo em que, a partir de um molde de DNA, é feita uma molécula de RNA. Existem, também, algumas enzimas que são capazes de sintetizar RNA a partir de outras moléculas de RNA ou que são capazes de sintetizar DNA a partir de RNA. Porém, o foco da aula será o processo de transcrição.
	A replicação duplica o DNA inteiro de uma célula. Já a transcrição é um processo mais específico, seletivo: apenas trechos (genes) importantes para a célula são transcritos. A transcrição precisa de um molde, o DNA. Ela, também, possui a mesma direção que a replicação: 5’ – 3’. Outra semelhança entre a transcrição e a replicação é a divisão em iniciação, elongação e terminação e a semelhança entre processos transcritivos em eucariotos e procariotos. 
RNA POLIMERASE
A enzima responsável pela transcrição é a RNA polimerase. Ela precisa de um molde de DNA para funcionar e polimeriza na direção 5’ – 3’, mas possui uma grande diferença em relação à DNA polimerase: ela não precisa de um primer para começar a copiar o molde como a DNA polimerase precisa. Ela possui várias subunidades distintas: as subunidades Σ são responsáveis pelo reconhecimento do trecho promotor do DNA, a subunidade β’ é responsável pela ligação ao DNA, a subunidade β está envolvida na elongação e no início da cadeia e a subunidade α está envolvida com o início da transcrição e, também, com a interação com proteínas regulatórias que controlam os processos transcritivos. 
Em procariotos percebeu-se que, geralmente, havia subunidades σ ligadas às subunidades α, β e β’ com tamanhos diferentes. Assim, a RNA polimerase passou a ser estudada separando-se as diversas regiões desta. As subunidades catalíticas (α, β e β’) passaram a ser chamadas de “núcleo da RNA polimerase”. E as subunidades σ que não têm função catalítica, mas sim de reconhecimento do DNA, passaram a ser estudadas como subunidades separadas. 
Dessa forma, tendo somente as subunidades catalíticas (núcleo), não é possível iniciar a transcrição, já que estas subunidades são incapazes de reconhecer os trechos promotores. Assim, faz-se essencial a presença das subunidades σ. Com o estudo das subunidades σ, percebeu-se que elas tinham tamanhos diferentes e, conseqüentemente, reconheciam seqüências de DNA diferentes. Ou seja, cada subunidade σ é específica para reconhecimento de um certo tipo de gene. 
GENES
	O gene é uma seqüência específica de nucleotídeos de DNA que poderá ser transcrita em RNA e, após esse processo, poderá ser sintetizada em proteína e, finalmente, desempenhar determinada função ou controlar determinada característica. Na sua cadeia, o gene possui uma região chamada de região codificadora de proteínas, que serão os nucleotídeos que propriamente darão origem ao RNA através de transcrição e conseqüentemente às proteínas. Também possui uma região, na sua extremidade 5’ (início), chamada região promotora e uma seqüência, na sua extremidade 3’ (fim), chamada seqüência de terminação. Entre as regiões codificadoras de proteínas e as extremidades 5’ e 3’ (promotora e terminadora) pode haver seqüências que não serão transcritas: estão ali apenas para efeitos regulatórios. 
	Os genes não são todos transcritos ou expressos de uma vez só. Trata-se de um processo seletivo e que precisa de muita regulação para que cada gene seja expresso no momento em que for necessário. Ou seja, sob determinadas condições fisiológicas, as regiões regulatórias vão favorecer ou inibir a expressão de certos genes. 
	Os genes são divididos de acordo com suas funções e seu grau de expressão. Cada tipo de gene é reconhecido, como visto acima, por uma subunidade Σ diferente. São os principais tipos de genes:
Housekeeping genes → são aqueles genes essenciais à vida do organismo, ou seja, são expressos SEMPRE, sob quaisquer condições.
Genes regulados pela disponibilidade de nitrogênio
Genes expressos em altas temperaturas
Genes expressos na fase estacionária
Genes expressos para síntese de flagelo (bactérias)
Genes expressos durante choque térmico e stress oxidativo
Genes expressos quando a bactéria (no caso) cresce em presença de Fe2+.
Como o próprio nome já diz, esses genes serão expressos quando sua função for requerida (com exceção dos housekeeping genes). Por exemplo: se uma bactéria está vivendo em um meio sem Fe2+, não tem por que seus genes de proteínas relacionadas ao metabolismo de ferro continuarem a ser expressos.
Porém, como fazer com que as bactérias, no caso, expressassem seus genes somente nos momentos adequados? Através das subunidades σ específicas para cada gene. Por exemplo, a subunidade σ que reconhece os promotores dos housekeeping genes são as subunidades σ 70. As subunidades σ que reconhecem os promotores dos genes expressos em altas temperaturas são as subunidades σ 32. Assim, a σ 32 só vai estar funcionando (não inibida) quando houver condições de temperatura extremas. Sob temperaturas normais, essa subunidade σ 32 não estará presente, conseqüentemente não vai detectar a região promotora dos genes para temperaturas extremas e, finalmente, não haverá transcrição desses genes sem que haja a necessidade. A σ 70, por outro lado, jamais será inibido, já que a expressão dos genes cujos promotores ele identifica é essencial. Porém, da mesma forma, a subunidade σ 70 não será capaz de identificar os promotores específicos para alta temperatura, por exemplo. Dessa forma, através da regulação das subunidades σ, que reconhecem os promotores dos genes, é possível regular a expressão gênica. 
Além das subunidades σ da RNA polimerase, participam da expressão gênica proteínas ativadoras de transcrição e proteínas repressoras de transcrição. A atividade dessas proteínas está citada na aula 23, sobre regulação da expressão gênica.
Convencionou-se que a primeira base de um gene a ser transcrita, na extremidade 5’, possui um sinal +. Todas as bases acima desta primeira possuem um sinal -. Por exemplo, a região promotora dos genes reconhecidos pela subunidade σ 70 é -10,-25. Ou seja, a subunidade σ 70 liga-se nas posições -10 e -25 do gene. Para identificar se uma subunidade σ é ou não capaz de reconhecer determinado promotor de um gene, utiliza-se o conceito de seqüências consenso. Esse conceito parte da percepção de que as regiões promotoras identificadas pelas mesmas subunidades σ nem sempre são as mesmas. Algumas bases nesse processo podem ser diferentes. Mas há a chamada seqüência consenso, porcentagem do número de bases que aparece em todos os promotores de genes de uma mesma subunidade σ. Diferença nas seqüências consenso, assim, indicariam uma diferença na subunidade σ que reconheceria a região promotora dos dois diferentes genes. Analogamente, uma seqüência consenso parecida indicaria uma mesma unidade σ para reconhecer a região promotora de dois genes diferentes. 
	
TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS
	1 – Iniciação
	O processo de reconhecimento de uma zona promotora pela subunidade σ da RNA polimerase e de ligação do núcleo da RNA polimerase nessa região é a chamada iniciação da transcrição. A RNA polimerase completa (com núcleo + subunidades σ) é chamada de holoenzima para. Com a ligação dessa holoenzima para com o DNA, tem-se a formação do chamado complexo fechado, em que há um complexo entre o promotor do gene e a subunidade σ da RNA polimerase. A RNA polimerase, a partir de então, é capaz de desenrolar o DNA e partir para uma estrutura chamada de complexo aberto. Depois da formação do complexo aberto, a subunidade σ solta-se do núcleo da RNA polimerase, que fará a transcriçãopropriamente dita. A subunidade σ participa, assim, do reconhecimento do promotor, da formação do complexo fechado e da formação do complexo aberto, mas não participa da elongação da transcrição. Quando molécula de RNA estiver, de fato, sendo gerada, a subunidade σ já terá deixado a estrutura da holoenzima para, sendo o núcleo da RNA polimerase o responsável pela elongação. 
	2 – Elongação
	O processo de elongação catalisado pela RNA polimerase é muito parecido com o processo de elongação catalisado pela DNA polimerase: o núcleo da RNA polimerase vai ligar o fosfato 5’ no OH 3’. Com isso, a fita de RNA vai aumentar no sentido 5’ – 3’. Não se sabe se a RNA polimerase possui atividade revisora, mas sabe-se que a RNA polimerase é capaz de corrigir nucleotídeos colocados na seqüência de uma maneira errada.
	3- Terminação
	Também é guiada por uma seqüência de nucleotídeos específica no DNA. Existem dois modos de fazer a terminação da transcrição do RNA: ρ-independente e ρ-dependente. No modo ρ-independente, acontece o aparecimento de uma seqüência no DNA rica em determinadas bases, como adenina por exemplo. Essas bases permitem que ocorra a formação de um loop no RNA que está sendo transcrito. Esse loop vai alterar a estrutura do complexo RNA – RNA polimerase – DNA, fazendo com que a RNA polimerase se solte do DNA e do RNA que está sendo sintetizado. Com isso, a transcrição foi feita (terminada). A terminação baseada na proteína ρ (ρ-dependente) é diferente. Muitas vezes, enquanto a RNA polimerase vai transcrevendo o RNA, esse RNA já vai sendo traduzido por cromossomos dentro da célula. A proteína ρ é capaz de ligar em sítios do RNA onde não há ribossomos traduzindo. Quando a proteína ρ se liga nessa seqüência não-codificadora do RNA, chamada de RNA blue, ela se enrola nesse RNA e desloca esse RNA que está sendo transcrito pela RNA polimerase para fora da enzima, soltando-o desta e soltando a RNA polimerase do DNA também. 
	 
TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS
	Assim como a transcrição nos procariotos, a transcrição nos eucariotos também tem iniciação, elongação e terminação. A enzima responsável pela transcrição é, também, uma RNA polimerase, com várias características em comum com a RNA polimerase de procariotos. Porém, a RNA polimerase de eucariotos precisa de auxílio de outras proteínas (fatores de transcrição) que a RNA polimerase de procariotos não precisa. Outra diferença entre procariotos e eucariotos é a estrutura dos genes. Os genes eucarióticos também têm regiões promotoras, regiões de transcrição, regiões terminadoras e regiões nas extremidades que não codificam para proteínas. Porém, nas regiões codificadoras de proteínas, os eucariotos têm íntrons e éxons e a RNA polimerase de eucariotos não possui subunidades σ para reconhecimento da zona promotora dos genes!
	Substituindo a região central do gene dos procariotos que codifica para proteínas, os genes dos eucariotos possuem íntrons e éxons. Quando o gene procariótico é transcrito, a molécula de RNA gerada nessa transcrição já é considerada o RNA mensageiro, ou seja, produto final. Entretanto, em genes eucarióticos, a primeira molécula de RNA transcrita não é o produto final (RNA mensageiro), mas sim uma molécula de RNA transcrito-primário. Para que o RNA transcrito-primário seja transformado em RNA mensageiro, ele deve passar por um processo chamado de processamento do RNA. Durante o processamento do RNA, haverá revestimento da ponta 5’, adenilação da ponta 3’ e remoção dos íntrons. 
	Em eucariotos, são encontradas três RNA polimerase principais: a RNA polimerase I, envolvida na síntese de RNA ribossomal, a RNA polimerase II, envolvida na síntese de RNA mensageiro (transcrito-primário) e a RNA polimerase III, envolvida na síntese do RNA transportador e de RNAs ribossomais especiais. Essas RNA polimerase vão reconhecer promotores de genes da mesma forma, porém, a RNA polimerase de eucariotos necessita da presença de diversas proteínas acessórias. Essa característica é válida para todas as RNA polimerase supracitadas (I, II e III). Essas proteínas acessórias podem ser os fatores de transcrição. Os fatores de transcrição para a RNA polimerase I são os TF-I e os fatores de transcrição para a RNA polimerase III são os TF-III.
	A RNA polimerase de eucariotos mais estudada é a RNA polimerase II, pois ela é a responsável pela formação do transcrito primário. Conforme já dito, para funcionamento dessa proteína há necessidade de fatores de transcrição, os TF-II. Sem a presença dos TF-II, a RNA polimerase II não consegue se ligar ao DNA, não consegue formar o complexo fechado e não há formação do complexo aberto e transcrição do RNA. 
	O processo de transcrição catalisado pela RNA polimerase II começa pela proteína TDP. Logo depois dela vem a TFB. Ambas se ligam no DNA. Após essa ligação, a proteína TF-IIf traz consigo a RNA polimerase II para o sistema. Depois disso, ligam-se ao sistema TF-IIe e TF-IIh, formando o complexo fechado. Depois da formação do complexo aberto, a elongação só será possível se a RNA polimerase II for fosforilada. A fosforilação dessa enzima na porção C terminal vai fazer com que ocorra a liberação do complexo de elongação. Resumidamente: saem o TF-IIe e o TF-IIh e entram no complexo os fatores de elongação. Esses fatores de elongação, juntamente com o a RNA polimerase-II vão fazer com que haja início o processo de elongação. Quando ocorre a terminação do RNA transcrito-primário, ocorre também a desfosforilação da RNA polimerase-II. A desfosforilação dessa enzima vai fazer com que ela se solte do DNA e libere o transcrito primário. 
PROCESSAMENTO DO RNA EM EUCARIOTOS
PROCESSAMENTO DE RNA NÃO CAI NA PROVA! SÓ DESCOBRI DEPOIS DE OUVIR O ÁUDIO INTEIRO! -.-
Durante o processamento do RNA, a ponta 5’ vai receber um revestimento chamado de cap e a ponta 3’ vai receber uma cauda adenilada poli A (AAA)n. Depois, por uma série de processos, o RNA vai perder seus íntrons e, somente com os éxons e a cauda poli A, o RNA tornar-se-á maduro. A poliadenilação na ponta 3’ e o cap na ponta 3’ acontece para estabilização do RNA mensageiro, protegendo-o de degradação e tornando-o muito mais estável que o RNA dos procariotos, visto que a molécula de RNA em si, sem nenhum processamento, é muito instável. Além disso, o cap e a cauda poli A estão relacionados com o reconhecimento correto do RNA no momento da tradução e também estão relacionados com processos de regulação da expressão gênica. 
POLIADENILAÇÃO DA EXTREMIDADE 3’
	A cauda poli A fica na porção 3’ da molécula de RNA mensageiro. Além da importância fisiológica, essa cauda permite aos pesquisadores uma fácil separação do RNA mensageiro dos demais tipos de RNA, visto que a cauda poli A permite a ligação do RNA numa coluna T (que liga caudas poli A), separando o RNA mensageiro do transcrito-primário e do RNA ribossomal. 
A cauda poli A é colocada no RNA por uma enzima chamada de poliadenilato polimerase, que vai gastar ATP para realizar sua função. A enzima endonuclease vai se ligar em porções AAU e AAA do RNA e vai retirar porções de RNA que foram sintetizadas a mais pela RNA polimerase. 
REVESTIMENTO CAP DA EXTREMIDADE 5’
O revestimento cap é uma base invertida do tipo metil-guanosina colocada na ponta 5’ do RNA, que vai proteger essa ponta. Além disso, pode ocorrer uma metilação das bases próximas ao cap. Um complexo enzimático é quem coloca a cap metil-guanosina na ponta 5’. Trata-se de um processo, como já dito, que deixa a molécula de RNA mais estável. 
Os processos de formação de cap, poliadenilação da cauda, retirada do RNA extra e, posteriormente, retirada dos íntrons, são esquematizados na figura abaixo:
RETIRADA DOS ÍNTRONS
A retirada dos íntrons vai completar o processamento do RNA. O processamento de íntrons pode ser dividido em vários tipos. Em cada um desses tipos podem ser utilizadas, para retirar os íntrons, somente moléculas de RNA ou moléculas de RNA com proteínas acessórias. No processamentode íntrons do grupo, ocorre a presença de dois éxons com um íntron no meio. Aí entra em ação uma guanosina que, funcionando como um nucleófilo, ataca a base A, que se ligava a um U do éxon. Dessa forma um dos pedaços do íntron está livre. Depois, o OH desse éxon que se desligou do íntron ataca a base do éxon ainda ligado no íntron, fazendo com que haja rompimento da ligação íntron-éxon e formação de ligação éxon-éxon, liberando o íntron para o meio e um RNA transcrito somente com éxons.
O processamento dos íntrons do grupo II também é baseado na saída do íntron do meio dos éxons. Porém, o ataque nucleófilo do processamento dos íntrons do grupo II acontece por uma base que está presente no próprio íntron. Então, o OH de um éxon faz um ataque nucleofílico no outro éxon e há a ligação entre eles, liberando o íntron indesejado para o meio e formando uma cadeia de RNA somente com éxons. 
Abaixo figura mostrando o processamento de íntrons do grupo I e grupo II:
Processamento de íntrons do grupo I 
Processamento de íntrons do grupo II
Tanto o processamento de íntrons do grupo I e do grupo II não necessita da formação do complexo protéico chamado spliceossomo. Nos íntrons do grupo III, por sua vez, acontece a formação de um spliceossomo para retirada dos íntrons. O spliceossomo é formado por várias proteínas que vão se ligar ao íntron e vão retirar o íntron do RNA. Esse íntron vai sair do meio dos éxons interagindo com algumas proteínas do spliceossomo. 
Assim como o processamento dos íntrons do grupo III, o processamento dos íntrons do grupo IV também necessita da presença de proteínas acessórias. 
MODIFICAÇÕES PARA FORMAÇÃO DO RNA TRANSPORTADOR
Para dar origem ao RNA transportador, o RNA transcrito originalmente pode sofrer várias modificações. Além de ocorrer um splice (retirada de uma grande porção do RNA original), as bases do RNA transportador também são modificadas. Assim, o RNA transportador pode ter bases diferenciadas derivadas das bases originais AUGC.
DIFERENTES PROCESSAMENTOS EM DIFERENTES TECIDOS
Dependendo do tecido onde os genes estão sendo expressos, eles podem sofrer processamento diferentes. Por exemplo, temos o gene da calcitonina. Quando esse gene é processado na tireóide ele vai ser processado de uma maneira, gerando a calcitonina. No cérebro, esse mesmo RNA é processado de uma maneira diferente, pois ele não vai codificar para a calcitonina, mas sim para uma outra proteína. Assim consegue-se ter duas proteínas um pouco diferente através de um transcrito primário igual que veio de um mesmo gene. Dessa forma percebe-se como esse processo é importante para economia de material genético.