Resumo P1 - Genétia II

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Estrutura e Função do DNA•
História e Experimentos realizados sobre o DNA•
Problemas da Teoria da Tripla Hélice•
Dogma Central da Biologia Molecular•
Renaturação do DNA•
Modelo de replicação do DNA (Semiconservação)•
O porquê da diferença no peso do nitrogênio no experimento•
Bases Nitrogenadas•
Mutações do tipo Transições e Transversões•
Mutações de Nível Somático e Germinativo•
Composição da Fita de DNA•
Temperatura de Melt(Gráfico)•
Características da Estrutura do DNA•
Formas do DNA e suas Funções/Estabilidade•
Código Genético Degenerado•
Mutação sinônima e não-sinônima •
Pontos Principais da aula:
Experimento de Griffith1928-
 Tipo de bactérias infectadas nos ratos: Reação dos 
ratos:
Tipos de bactérias 
recuperadas:
1 IIIS (virulentas) morrem IIIS (virulentas)
2 IIR (não virulentas) vivem nenhuma
3 IIIS mortas por aquecimento (virulentas) vivem nenhuma
4 IIR (não virulentas) + IIIS mortas por aquecimento 
(virulentas)
morrem IIIS e IIR
Resumo do experimento: Aquecida, a linhagem com capsula fica atenuada e não mata, porém ao 
misturar atenuada com não-virulenta, através de transições, gera-se novas gerações de bactérias com 
características virulentas.
Experimento de Avery (Probabilidade de que DNA contém informações genéticas)1944-
Resumo do experimento: Usando 5 tipos de enzimas, dividiu-se em diferentes linhagens não-virulentas, 
posteriormente misturadas a extratos de bactérias virulentas. Cada uma dessas 5 soluções foram 
tratadas com 1 tipo de enzima. Ao final apenas a linhagem que não demonstrou virulência foi a tratada 
com DNAse, provando que o DNA carrega o material genético.
Experimento Hershey-Chase1951-
Situação A - o enxofre das proteínas dos bacteriófagos foi marcado radioativamente e os bacteriófagos 
foram infectar bactérias. Observou-se que a radioatividade permanecia no exterior das células;
Situação B - o fósforo do DNA dos bacteriófagos foi marcado radioativamente e os bacteriófagos foram 
infectar bactérias. Observou-se que a radioatividade estava no interior das células.
O bacteriófago agarrou-se à membrana bacteriana através de fibras proteicas da sua cauda e injetou 
Estrutura e Função do DNA
quarta-feira, 14 de agosto de 2013 17:32
 Página 1 de Genética II 
O bacteriófago agarrou-se à membrana bacteriana através de fibras proteicas da sua cauda e injetou 
para o citoplasma o DNA que se localiza na sua cabeça. Esse ácido nucleico comandou, a partir do 
citoplasma bacteriano, a produção de mais vírus. A parte proteica do vírus nunca penetrou na bactéria.
 Assim pode-se concluir que o DNA é o responsável pela informação que conduz á formação de 
novos vírus. Estes novos vírus adquirem cápsula, pois são utilizados os aminoácidos que a bactéria 
possui.
Teoria da tripla Hélice foi descartada pois quando fosse necessário passar informações genéticas 
seria problemático.
•
A Renaturação do DNA ocorre através das Pontes de Hidrogênio•
Informações Gerais-
Modelo de Replicação Semi-Conservativa-
A Diferença de peso na geração 1 ocorre porque o DNA é composto por nitrogênio 
pesado e leve
•
Nas gerações seguintes a quantidade de moléculas com fitas de nitrogênio mais pesado 
fica cada vez menor
•
Bases nitrogenadas-
Purinas x Purinas ou Pirimidinas x Pirimidinas = Mutação de Transição▪
Purina x Pirimidinas = Mutação de Transversão▪
Devido a possuir cadeias similares, a frequência da mutação de transição é mais comum▪
Incorporação de base sempre ocorre na posição 3''▪
Esquema da
Conservação
Semiconservativa
As pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas possui importância na desnaturação do DNA
Regiões ricas em ligações triplas precisam de uma temperatura maior para romper (motivo pelo 
qual a temperatura de melting varia)

Cada base nitrogenada possui um ponto de ligação com a pentose do nucleotídeo, sendo nas 
purinas sempre o carbono 9 e nas pirimidinas no carbono 1.

Características da estrutura do DNA-
O DNA possui 2 polinucleotídeos•
As Bases Nitrogenadas estão localizadas no interior da hélice•
Bases Nitrogenadas interagem através de P.H•
Cada giro da hélice contém 10 bases•
Os dois polinucleotídeos têm sentido inverso ou antiparalelo•
O DNA possui 2 sulcos diferentes•
 Página 2 de Genética II 
O DNA possui 2 sulcos diferentes•
O DNA possui giro para direita•
Existem 3 variações: A, B e Z•
Inatividade Normal e mais estável DNA Ativo
 Página 3 de Genética II 
Origem da Vida•
Contexto Histórico(Quase a mesma coisa da aula 1)•
Enzimas de Restrição e suas Características•
Região UTR(Região não traduzia)•
DNA Ligase•
Enzimas Modificadoras de DNA•
DNA Recombinante (Tecnologia envolvida)•
Vetores de clonagem•
Pontos Principais da aula:
Enzima de Restrição-
São proteínas encontradas em bactérias que reconhecem uma curta sequência de DNA específica e 
clivam a dupla fita em um ponto específico.
As enzimas reconhecem 4, 6 ou 8 pares de base•
A maioria das enzimas são especificas para sítios únicos de restrição•
Sítios são reconhecidos independentes de fonte de origem•
São conhecidas como Endonuclease, ou seja, uma enzima que cliva nucleotídeos internos a uma 
sequência de DNA. As exonucleases clivam o DNA a partir de uma extremidade livre.
•
Funcionamento de uma enzima de restrição
DNA Ligase-
A ligase do DNA (ou DNA ligase) é uma enzima que promove a ligação entre os nucleótidos de duas 
moléculas de DNA.
Antes de iniciar a reação de ligação, é importante determinar a quantidade de inserto e vetor que serão 
usados na reação.
-Enzimas Modificadores de DNA
Nucleases, polimerases, enzimas que modificam o terminal do DNA
DNA Recombinante e Vetores-
Ex.: Plasmídeos, Cosmídios, Fagos e BAC (Bactéria Artificial). 
Vetores são moléculas de DNA que são usadas para ''transportar'' sequências de DNA de interesse para 
os hospedeiros biológicos e para o tubo na bancada do laboratório
Contam com marcador genético para seleção•
Habilidade de promover replicação autônoma•
Contém sítios de restrição•
Únicos para facilitar a clonagem do inserto de DNA•
Apresentam uma quantidade mínima de DNA não-essencial para otimizar a clonagem•
Os vetores lambda e cosmídeo proporcionam um meio eficiente de clonar fragmentos de DNA, de 
comprimento moderado em células bacterianas
•
Características :
Vetores Plasmídiais
Quanto maior o plasmídeo, menor é sua eficiência na replicação (Devido a fragmentos menores 
migrarem com maior facilidade)
•
Vetor viral
Tecnologia do DNA Recombinante
segunda-feira, 16 de setembro de 2013 15:50
 Página 4 de Genética II 
Transposóns-
É uma sequência de ácido desoxirribonucleico capaz de se movimentar de uma região para outra em um 
genoma de uma célula
 Página 5 de Genética II 
Características dos ácidos nucleicos•
Proporção de bases em DNA e de vários organismos•
Padrão de difração de raio X do DNA•
Replicação acurada do DNA•
Desnaturação e Renaturação do DNA•
Temperatura de fusão (Tm) e fatores que a alteram•
Utilidade das hibridizações dos ácidos nucleicos•
Clonagem gênica•
Vetor de clonagem•
Biblioteca genômica ou de DNA•
Como identificar o clone de interesse numa biblioteca genômica•
Princípio da Hibridização •
Hibridização de colônia•
Blotting•
Como identificar expressão gênica•
Construção de Microarranjos•
Marcação de sondas•
Pontos Principais da aula:
Características dos ácidos nucleicos-
Purina + Pirimidina: Melhor combinação para fotografar de raio x•
Cadeias polinucleotidicas são antiparalelas•
Desnaturação (ou melting): Em altas temperaturas ou pH•
Antigamente checava-se a % de homologia entre 2 organismos a partir da quantidade de DNA que 
foram hibridizados
•
Desnaturação○
Desnaturação do DNA pode ser acompanhada pelo aumento da densidade ótica.•
Tm é a temperatura em quemetade das fitas então desnaturadas.•
Conteúdo de G-C○
Comprimento da cadeia de DNA○
Imperfeições no pareamento○
Efeito do pH○
Fatores que alteram o Tm:•
Para calcular Tm : Tm= 69.5 + (O.41 x %GC) (Por isso quanto mais a quantidade de ligações GC 
maior o Tm)
•
Tm varia pouco entre pH 5 e 8, e acima de 13 o DNA desnatura.•
Blotting e Biblioteca de DNA-
Uma biblioteca genômica é uma coleção de fragmentos de DNA de uma determinada espécie de 
organismo, obtidos a partir da ação de endonucleases de restrição, ligados aos vetores apropriados e 
clonados após terem sido inseridos em um hospedeiro.
É suposto que uma biblioteca genômica seja representativa de todos os genes do organismo, sendo 
muito útil quando se pretende isolar um gene específico. Assim, torna-se claro que quando se quer 
clonar um determinado gene ou o cDNA (DNA complementar) das mensagens por ele codificadas 
(mRNA) é necessário a construção de coleções de genes recombinantes.
Tamanho da Biblioteca : 
 
 
 
 
 
 
N=clones requeridos
a=tamanho médio do fragmento de DNA a ser clonado
b=tamanho do genoma
Quanto maior a concentração de enzima, menor o tamanho dos fragmentos de DNA gerados
Biblioteca de cDNA: Um conjunto de clones que representam os mRNAs expressos por determinado tipo 
de célula em determinado período de desenvolvimento
A abundância de determinado clone na biblioteca irá depender da abundância do mesmo na célula
Quanto maior abundância de determinado mRNA, maior a facilidade para seu isolamento.
Procedimentos para criação da Biblioteca de cDNA:
1° Método de Isolamento do mRNA
2° Síntese do cDNA ( Há dois métodos principais: a) a partir da cauda poliA e b) síntese cDNA a 
partir da 2° fita primed oligo (d6)
Blotting○
Southern Blotting(DNA) e Northern Blotting(RNA na membrana ) dizem respeito a dois métodos muito 
sensíveis para detecção duma sequência particular de DNA ou RNA, por combinação de separação por 
eletroforese, hibridização com sondas marcadas radioactivamente e autorradiografia.
Em Microarranjos, cada ponto corresponde a um gene hibridizado
A marcação pode ser durante a síntese do DNA, extremidades dos DNA.
Questão: A desnaturação e a reassociação hibridização das fitas de DNA é usada como um instrumento 
para análise genética.
A)Cite e explique 2 exemplos de metodologias em Biologia Molecular que utilizam estes recursos
b)Qual é a aplicação de cada uma delas?
Southern Blotting, DNA/RNA > diagnóstico
a) e b) Northern Blotting, sonda de RNA para saber se um gene se expressa
Ensaios de Hibridização de ácidos nucléicos
segunda-feira, 16 de setembro de 2013 17:17
 Página 6 de Genética II 
Sequenciamento de DNA•
Genoma Humano•
Biologia Sintética e seus objetivos•
Circuito gênico sintético•
Pontos Principais da aula:
Sequenciamento de DNA-
1° - Desnaturação do DNA
2° - Ligamento de um oligonucluotideo sintético
Passos:
-Biologia Sintética
A expressão biologia sintética tem sido utilizada para descrever uma abordagem da biologia que 
tenta integrar diferentes áreas similares de pesquisa. Mais recentemente, o termo tem sido 
utilizado de uma forma diferente, assinalando uma nova área de pesquisa que combina biologia e 
engenharia para projetar e construir novas funções e sistemas biológicos
Desenvolver e construir novas partes biológicas e sistomas
Aprender a vida através da sua construção
Gerar um sistema programável
Construir máquinas que operem dentro da célula
Objetivos○
Biologia Sintética Aplicada a Saúde Humana
terça-feira, 17 de setembro de 2013 20:13
 Página 7 de Genética II 
Relação com o dogma central•
• Estrutura dos genes eucariotos
Principais diferenças entre a expressão gênica de eucariotos 
e procariotos
•
• Variações do dogma central
• Transcrição de procariotos
• Operon
Transcrição de Eucariotos•
• Tipos de RNA polimerase
• Elementos reforçadores (enhancers)
• Elementos silenciadores
• Elementos de fronteira(isolados)
• Elementos de resposta
• Elementos Cis e Trans atuantes
• Processamento do RNA
• Importância da cauda poliA
• Remoção dos Intróns
• Restrição Espacial da Expressão Gênica
• Genes de manutenção (Housekeeping)
Restrição temporal•
Pontos Principais da aula:Em geral, a expressão da informação genética é o sistema de uma vida. O DNA especifica a síntese do 
RNA e o RNA especifica a síntese dos polipeptídios que sequentemente forma as proteínas
Dogma Central > Fluxo da informação gênica
-Estrutura dos genes eucariotos
• Ausência de Intróns
• Necessidade de núcleo
Diferenças em relação ao procarioto:
Variações do dogma Central
Transcrição de procariotos-
Existe outra variação em que DNA gera 2 RNAs e estes geram 2 proteínas, as quais podem ter funções 
diferentes apesar de serem originadas do mesmo gene
Quantos maior número de éxons , maior número de isoformas
• Polimerase
Iniciação•
• Alongamento
• Término da transcrição
Etapas da transcrição:
Durante a iniciação, não deve-se alterar os sítios conservativos
Um gene pode estar representado em uma fita, e outro gene pode estar representando outro
- Operon
É uma unidade funcional de DNA genômico contendo cluster de genes sob o controle de um único sinal 
regulador ou promoter. (Em resumo é uma unidade genética de expressão coordenada)
- Tipos de RNA
RNA pol I presente em genes de RNAr
RNA pol II presente em genes de proteínas e maioria dos genes de snRNA
RNA pol III Alguns snRNAs, tRNAs e RNAr
Processamento do RNA (modificações na extremidade 3')
Deste transcrito primário têm que ser retirados os introns (Caso contrário partes que não são 
necessárias seriam traduzidas), o que é feito por um processo enzimático chamado “splicing”. Além 
disso o pré-RNAm ainda sofre outras alterações, como a adição de uma cauda poliA na extremidade 3´ e 
Num RNA a estrutura secundária é importante para exercer estabilidade
Regulação da Expressão Gênica
terça-feira, 17 de setembro de 2013 20:25
 Página 8 de Genética II 
disso o pré-RNAm ainda sofre outras alterações, como a adição de uma cauda poliA na extremidade 3´ e 
de um “cap" 7-metil-guanosina na extremidade 5´ antes de se tornar um RNAm e poder passar ao 
citoplasma, onde será traduzido. Esta última adição garante estabilidade para o RNAm dentro do núcleo.
-Tipos de Elementos alterantes
○ Potencialização da expressão gênica
Reforçadores (enhancers)•
○ Inibem expressão gênica
• Silenciadores
○ Controla os elementos reforçadores e silenciadores
• De Fronteira (isoladores)
○ Ativam genes em resposta a hormônios
• De Resposta
○ Seqüências reguladoras, região de ligação dos fatores trans-atuantes, estão na mesma 
molécula que o gene, ou transcrito de RNA, que está sendo regulado
• Cis e Trans Atuantes
- Genes de Manuntenção
Nem todos os genes de um organismo são transcritos numa mesma célula. As células especializam-se 
em função do repertório de proteínas associadas a cada tipo de metabolismo, e também em função do 
doseamento de cada uma; por isso, na regulação da transcrição dos genes (quais os que são transcritos 
e quanto das respectivas proteínas é produzido por cada tipo de célula) está uma chave fundamental da 
diferenciação celular. Não deixa de haver proteínas com funções gerais (metabolismo energético, 
citosqueleto, polipéptidos ribossomais, histonas, etc.), codificadas nos genes "que mantêm a casa" 
(housekeeping)
 Página 9 de Genética II