viabilidade espermatica de semen ovino

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Efeito de diferentes diluentes sobre a viabilidade espermática do sêmen 
ovino mantido a 5°C por até 72 horas. 
Heydt, D. R.; Cesca, S.; Tomasini, L.; Bragança, J. F. R.; Bennemann, P. E. 
Universidade Do Oeste De Santa Catarina – UNOESC - Xanxerê-SC 
 
RESUMO 
A ovinocultura é uma importante fonte de subsistência, através do leite e da 
carne para o consumo, de lã e pele para os vestuários. Desta forma, algumas técnicas 
estão sendo desenvolvidas para aumentar os índices produtivos e reprodutivos, dentre 
elas, esta a inseminação artificial (IA). Para que isso ocorra existe a necessidade de um 
sêmen de boa qualidade e que esteja viável no momento da inseminação. Este estudo 
utilizou dois tipos de diluentes, o Dilutris (T1) e Tris Salomon (T2) para conservação a 
5°C por até 72 horas. Foi observado que T1 teve uma motilidade espermática e 
integridade da membrana superior ao T2 nas 72 horas de armazenamento a 5°C. 
 
INTRODUÇÃO 
A ovinocultura sempre foi para a humanidade uma importante fonte de 
subsistência, no fornecimento de leite e carne para a alimentação e de lã e pele para o 
vestuário. 
No Brasil, a ovinocultura está presente em todas as regiões e em grande difusão, 
sendo que para isso, o manejo reprodutivo é importante para o bom desenvolvimento 
dessa atividade. 
Algumas biotecnologias vem sendo desenvolvidas visando o aumento dos 
índices produtivos e reprodutivos da espécie ovina e, consequentemente, a sua 
rentabilidade. Dentre estas podemos citar a criopreservação de sêmen e a inseminação 
artificial (IA) (SIMPLICIO et al., 2007). 
O uso de sêmen congelado na ovinocultura ainda apresenta resultados 
insatisfatórios, tendo como principal agravante a dificuldade de transpor a cérvix devido 
a sua anatomia. Dessa forma, é necessário o uso de laparoscopia para a deposição do 
sêmen no interior do útero, tornando o procedimento laborioso (BICUDO et al. 2005). 
Para simplificar o processo de IA, o método mais difundido é através da utilização do 
sêmen fresco diluído. Atualmente a manutenção do gameta masculino em estado 
refrigerado a 5º C surge como uma opção para a difusão da biotécnica da IA. 
O sêmen refrigerado a 5ºC apresenta fertilidade mais elevada após a IA em 
comparação ao sêmen congelado, pois mantém a viabilidade espermática por mais 
tempo, sem que aconteça uma redução na capacidade fertilizante dos espermatozoides 
devido às crioinjúrias. 
Segundo Roca et. al. (2000), o uso do sêmen resfriado para IA, depende da 
habilidade do diluidor em promover um ambiente propício para o espermatozoide 
durante sua conservação, para que a viabilidade espermática seja prolongada. Isso 
mostra a importância do uso de diluentes como suporte energético e proteção contra o 
resfriamento. Para que isso ocorra, estes devem conter substâncias tamponantes como o 
Fosfato de Sódio, Citrato de Sódio e TRIS (Tris-hidroximetil-aminometano), uma fonte 
energética como glicose ou frutose, bem como crioprotetores internos e externos, 
podendo ser glicerol e gema de ovo respectivamente (SILVA, 2001). 
Diante deste contexto surge a necessidade do aperfeiçoamento dos processos de 
tecnologia do sêmen, principalmente, quanto ao uso de diluentes, assim como avaliar as 
alterações espermáticas após a diluição e a refrigeração. Por estes motivos, esta pesquisa 
tem como objetivo avaliar a viabilidade do sêmen ovino refrigerado a 5º C, diluído em 
TRIS-Gema e um diluente comercial por um período de até 72 horas. 
 
MATERIAL E MÉTODOS 
Como doadores de sêmen, foram utilizados 5 carneiros da raça Texel, com idade 
de 1 a 3 anos, submetidos previamente a um exame andrológico. Os animais estavam no 
Setor de Ovinocultura da Universidade do Oeste de Santa Catarina – Campus Xanxerê, 
localizada no Município de Xanxerê (SC). Os cinco carneiros foram avaliados em 
processados em split sample em pool de sêmen, sendo este fracionado em dois 
tratamentos. O Sêmen diluído em diluente comercial Dilutris (Minitub) (T1) e Sêmen 
diluído em diluente TRIS-Salomon (T2). 
Os carneiros foram mantidos em um regime de uma coleta semanal, sendo 
realizadas 10 coletas de cada carneiro. Foi utilizados somente ejaculados que atenderem 
a um padrão mínimo de volume de 0,7 ml, 70% de motilidade, vigor 3, turbilhão 3 e 
80% de espermatozoides normais. 
O sêmen foi obtido através da técnica de colheita com vagina artificial. Os 
ejaculados ovinos foram avaliados individualmente quanto ao turbilhão, motilidade, 
vigor e morfologia espermática, sendo após processados em pool de sêmen (3 
carneiros). Os carneiros foram submetidos a um regime de uma coleta semanal. 
Imediatamente após a colheita as amostras foram colocadas em banho-maria a 
34°C e avaliadas conforme os critérios: 
 Volume: O volume foi mensurado através de um copo de coleta 
graduado. 
 Turbilhão: Uma gota de sêmen puro foi colocada, por meio de uma 
pipeta Pasteur, sobre lâmina aquecida a 34°C e observada em microscopia de campo 
claro a 40 aumentos. Os resultados foram expressos de acordo com a escala de 
valorização de 0 a 5, segundo EVANS e MAXWELL (1987). 
 Motilidade espermática: Em um frasco eppendorf foi adicionada uma 
amostra de 50 microlitros de sêmen puro. Nesta amostra foi adicionado 500 microlitros 
de solução salina previamente aquecida a 34
0
C. A seguir uma gota deste 
homogeneizado foi colocada entre lâmina e lamínula aquecidas a 34°C, para avaliação 
em microscopia de campo claro em 100 aumentos. Foram avaliados três campos, sendo 
o resultado expresso em percentual de espermatozoides móveis. 
 Vigor: Simultaneamente à determinação da motilidade foi avaliado o 
vigor espermático, sendo o resultado expresso em escala de 0 a 5 conforme 
CHEMINEAU e COGNIÉ (1991). 
 Concentração espermática: Do pool de sêmen puro foi retirada uma 
alíquota de 20 microlitros que foi adicionada a um frasco eppendorf contendo 7.980 
microlitros de solução de formol citrato 2,94%, perfazendo uma diluição de 1:400. Após 
homogeneização, uma alíquota de 30 microlitros foi depositada em cada lado da 
Câmara de Neubauer (hemocitométrica) sendo realizada a determinação da 
concentração espermática através da contagem dos espermatozoides em microscópio de 
campo claro. 
 Morfologia espermática: Imediatamente após a homogeneização dos 
ejaculados, foi colhida uma alíquota de 50 microlitros que foi depositado em um frasco 
eppendorf contendo 500 microlitros de solução de formol citrato 2,9% previamente 
aquecido a 34
o
C. Para a preparação das lâminas foi colocada uma gota do sêmen 
conservado na solução formol-citrato entre lâmina e lamínula e foram contadas 200 
células por lâmina em microscópio de contraste de fase (1000 X). 
Imediatamente após a homogeneização dos ejaculados realizou-se a coloração 
supra vital onde que foi colhida uma alíquota de 20 microlitros que foi depositado em 
um frasco eppendorf. A esta amostra de sêmen in natura foi adicionado 20 microlitros 
do corante Eosina Amarela 2%, sendo a amostra homogeneizada por 30 segundos. Após 
este período foi adicionado ao frasco ependorff 20 microlitros de Negrosina 10% e 
aguardado o período de 30 segundos. Foi realizado um esfregaço em lâmina de vidro 
para avaliação em microscopia de campo claro em 1.000 aumentos. Foram contados 200 
espermatozoides, os quais forma classificados em vivos (não corados) e mortos 
(corados). O resultado foi expresso em percentual de espermatozoides vivos. 
Foram testados os diluentes TRIS-Salomon e DILUTRIS. Os diluentes foram 
preparados 30 minutos antes do início das coletas, sendo mantidos em banho-maria a 
34°C até o momento da diluição. 
Após a avaliação seminal começou-se o processo de refrigeração do sêmen, 
onde, foi realizado o poolde sêmen e diluição do mesmo. Foi colocado em tubos de 
ensaio tampados e logo após em um recipiente, contendo água a 34°C. Este conjunto foi 
levado ao refrigerador, sendo acompanhado a queda da temperatura por um dataloger 
até a temperatura de 5°C. A refrigeração para atingir 5°C foi feita gradualmente em 2 
horas, correspondendo à diminuição progressiva de 0,3 a 0,5 °C/min. 
A motilidade e vigor espermático foram avaliadas após a diluição, após o 
resfriamento a 5°C, 12, 24, 36, 48,60 e 72 horas de armazenamento a 5°C. A morfologia 
espermática e a coloração Supra Vital foi realizada nos tempos zero (sêmen puro), 24, 
48 e 72 horas de armazenamento a 5°C. 
O pool de sêmen foi utilizado como unidade experimental. Dessa forma o efeito 
variação de machos foi controlado. Foram realizadas análises de medidas repetidas 
comparando o efeito do diluente sobre os parâmetros de qualidade espermática. As 
variáveis motilidade, morfologia espermática e percentual de espermatozoides vivos 
foram avaliadas através da análise de variância, sendo as médias comparadas pelo teste 
de Tukey-Kramer do pacote estatístico SAS. A variável vigor espermático foi 
comparada através do teste de chi-quadrado. 
 
RESULTADOS 
O volume médio do pool de ejaculados foi de 2,94±0,13 ml, o turbilhão foi 
4,35±0,11, o vigor médio foi de 4,4±0,11. 
No sêmen diluído a média da motilidade espermática ao longo do período de 72 
horas foi 73,68%±1,21 (média ± erro padrão) para o T1 e 64,37±1,21 para T2. 
Os dados de motilidade e viabilidade espermática no sêmen ovino armazenado 
por até 72 horas são apresentados na tabela 1. 
 
Tabela 1. Motilidade e viabilidade espermática no sêmen ovino armazenado a 
temperatura de 5°C por um período de até 72 horas de acordo com o tratamento 
aplicado. 
T1- diluente Dilutris, T2- diluente TRIS Salomon. Média±Desvio Padrão. Letras 
diferentes no mesmo tempo de armazenamento diferem para um nível de significância 
de 5%. 
Nos valores de motilidade observou-se diferença significativa a partir de 24 
horas de armazenamento. A analise dos dados obtidos com a coloração supravital 
mostrou que a integridade da membrana do espermatozoide foi semelhante ao 
percentual de espermatozoides moveis. 
O vigor espermático e o percentual de células anormais armazenados á 5°C por 
72 horas estão apresentados na tabela 2. 
Tabela 2. Vigor espermático e percentual de células anormais no sêmen ovino 
armazenado a temperatura de 5°C por um período de até 72 horas de acordo com o 
tratamento aplicado. 
Tratamento Tempo (h) Vigor (n±DP) Morfologia (%±DP) 
1 0 4,00 12,46±1,23ª 
2 3,95±0,12 14,00±1,24ª 
1 24 3,55±0,11 16,00±2,19ª 
2 3,25±0,12 11,60±1,72
b
 
1 48 3,15±0,08
a
 18,53±1,99ª 
2 2,85±0,11
b
 11,20±1,26
b
 
1 72 2,90±0,07
a
 16,86±2,52ª 
2 2,55±0,15
b
 11,80±1,28ª 
T1- diluente Dilutris, T2- diluente TRIS Salomon. Média±Desvio Padrão. Letras 
diferentes no mesmo tempo de armazenamento diferem para um nível de significância 
de 5%. 
Quando avaliado o vigor espermático, foi observada diferença significativa a 
partir de 48 horas armazenamento entre os dois tratamentos, sendo favorável ao T1 
(P<0,05). 
Tratamento Tempo (h) Motilidade (%±DP) Supravital (%±DP) 
1 0 83,25±0,75
a
 76,86±1,38 
2 79,75±0,93
a
 73,87±2,11 
1 24 76,25±1,01
a
 71,87±1,77 
2 69,00±1,87
b
 67,33±1,72 
1 48 71,75±1,78
a
 65,33±1,97 
2 58,25±2,30
b
 62,00±2,00 
1 72 63,50±1,92
a
 61,20±2,52 
2 50,50±2,92
b
 56,60±2,91 
A morfologia espermática não diferiu entre os tratamentos nos períodos 0 e 72 
horas. Porém quando avaliado o período 24 e 48 horas foi observada diferença entre os 
tratamentos (P<0,05). 
 
DISCUSSÃO 
De acordo com McKINNON (1996), quando as células espermáticas são 
mantidas a 5ºC ocorre uma redução no metabolismo para valores de até 10%, quando 
comparado com o das células mantidas à temperatura de 37ºC. Em consequência, a 
peroxidação será mais lenta e a produção de catabólitos são menores, de modo que o 
desgaste da célula não ocorra tão rápido. Porém, essas diferenças não se limitaram 
apenas à curva de resfriamento, mas também ao diluente utilizado. 
Observou-se os espermatozoides com maior vigor e motilidade no período 0, 24, 
48 e 72 horas diluídos no T1 (Dilutris) comparado com o T2 (Tris-Salomon), 
demonstrando que a composição dos mesmos pode ter interferido na manutenção da 
motilidade e vigor espermáticos. 
De acordo com Moscardini et al. (2014), a motilidade espermática apresentou 
valores inferiores a 40% quando o sêmen foi armazenado a 5°C por até 72 horas. Este 
dado difere dos resultados encontrados no presente estudo onde, no T1 foi observada 
uma motilidade de 63,5% até 72 horas de armazenamento. Da mesma forma Milczewski 
et al. (2000) avaliando o sêmen de ovino após 8 horas de armazenamento a 5°C 
observou uma motilidade espermática de 42,17%. Este fato demonstra que o T1 foi 
capaz de manter a viabilidade espermática por um período superior ao relatado pela 
literatura, uma vez que este manteve uma motilidade espermática de 63,5% e 
integridade de membrana de 61,2%. 
Quando os dados são comparados até o período de 48 horas a motilidade e o 
vigor espermático foram semelhantes aos observados por Sousa et al. (2010) o qual 
obsevou uma motilidade de 68,33% e o vigor de 3,3. 
 
CONCLUSÃO 
Nas condições em que foi realizado o presente estudo, é possível concluir que o 
sêmen ovino diluído em Dilutris
®
 e armazenado a 5°C mantém os parâmetros mínimos 
de motilidade espermática, vigor e integridade de membrana por até 72 horas. 
 
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