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iii Manual de laboratório da OMS Exame e processamento do sêmen humano QUINTA EDIÇÃO iv Manual de laboratório da OMS para o exame e processamento do sêmen humano - 5ª ed. Publicado pela Organização Mundial de Saúde em 2010 sob o título “ WHO laboratory manual for the examination and processing of human sêmen - 5th ed.” A Organização Mundial da Saúde concedeu direitos de tradução e publicação de uma edição em português para o Programa Nacional de Controle de Qualidade, que é o único responsável pela qualidade e fidelidade da versão em português. No caso de qualquer inconsistência entre as versões em inglês e português, a versão original em inglês será a versão obrigatória e autêntica. © Programa Nacional de Controle de Qualidade – 2018 Programa Nacional de Controle de Qualidade - 2018. Tradução: Global Translation Revisão técnica: Assessor Dr. Orildo dos Santos Pereira Revisão ortográfica e visualização: Superintendente: Dr. Francisco Edison Pacifici Guimarães Diretor de Administração: Dr. José Abol Corrêa v CONTEÚDO Agradecimentos xiv Siglas e abreviaturas usadas neste manual vi Capítulo 1 Antecedentes 1 1.1 Introdução 1 1.2 A quinta edição 1 1.3 Alcance do manual 3 PARTE I. ANÁLISE DO SÊMEN Capítulo 2 Procedimentos padrão 5 2.1 Introdução 5 2.2 Coleta da amostra 8 2.2.1 Preparação 8 2.2.2 Coleta de sêmen para fins de diagnóstico ou pesquisa 9 2.2.3 Coleta estéril de sêmen para reprodução assistida 9 2.2.4 Coleta estéril de sêmen para análise microbiológica 9 2.2.5 Coleta de sêmen em casa 10 2.2.6 Coleta de sêmen com preservativo 10 2.2.7 Manipulação segura de amostras 11 2.3 Exame macroscópico inicial 11 2.3.1 Liquefação 11 2.3.2 Viscosidade do sêmen 12 2.3.3 Aparência do ejaculado 13 2.3.4 Volume do sêmen 13 2.3.5 pH do sêmen 14 2.4 Investigação microscópica inicial 15 2.4.1 Mistura completa e amostragem representativa do sêmen 15 2.4.2 Fazendo uma preparação úmida 15 2.4.3 Agregação de espermatozoides 16 2.4.4 Aglutinação de espermatozoides 17 2.4.5 Elementos celulares que não sejam espermatozoides 18 2.5 Motilidade espermática 19 2.5.1 Categorias de movimento de esperma 19 2.5.2 Preparando e avaliando uma amostra para motilidade 20 2.5.3 Exemplos práticos 22 2.5.4 Limite inferior de referência 23 2.6 Vitalidade do esperma 23 2.6.1 Teste de vitalidade usando eosina-nigrosina 24 2.6.2 Teste de vitalidade usando apenas eosina 26 2.6.3 Teste de vitalidade usando inchaço hipo-osmótico 27 2.7 Número de espermatozoides 29 2.7.1 Tipos de câmara de contagem 30 2.7.2 O hemocitômetro de Neubauer melhorado 31 2.7.3 Usando a grade do hemocitômetro 32 2.7.4 Cuidado da câmara de contagem 32 2.7.5 Fixador para diluir o sêmen 33 vi 2.7.6 A importância de contar suficientes espermatozoides 33 2.8 Procedimento de contagem de rotina 34 2.8.1 Determinar a diluição necessária 34 2.8.2 Preparar as diluições e carregar as câmaras do hemocitômetro 36 2.8.3 Avaliação do número de espermatozoides nas câmaras de contagem 37 2.8.4 Cálculo da concentração de espermatozoides no sêmen 39 2.8.5 Exemplos práticos 39 2.8.6 Limite inferior de referência para a concentração de espermatozoides 40 2.8.7 Cálculo do número total de espermatozoides no ejaculado 40 2.8.8 Limite inferior de referência para o número total de espermatozoides 40 2.9 Números espermáticos baixos: criptozoospermia e suspeita de azoospermia 40 2.10 Quando uma avaliação precisa de um baixo número de espermatozoides não é necessária 41 2.10.1 Não realizar nenhuma ação 41 2.10.2 Exame de amostras centrifugadas para detectar espermatozoides 41 2.10.3 Exame de amostras não centrifugadas para detectar espermatozoides móveis 42 2.11 Quando uma avaliação precisa de um baixo número de espermatozoides é necessária 43 2.11.1 Avaliação do baixo número de espermatozoides em toda a câmara melhorada de Neubauer (microscopia de fase com contraste) 44 2.11.2 Avaliação do baixo número de espermatozoides em lâminas descartáveis de grande volume (microscopia de fluorescência) 48 2.12 Contagem de células não espermáticas 53 2.12.1 Cálculo da concentração de células redondas no sêmen 53 2.12.2 Sensibilidade do método 53 2.12.3 Exemplos práticos 53 2.13 Morfologia espermática 55 2.13.1 O conceito de espermatozoides normais 55 2.13.2 Preparação de esfregaços de sêmen 56 2.14 Métodos de coloração 60 2.14.1 Fixação tradicional e coloração sequencial 60 2.14.2 Procedimento de coloração de Papanicolaou para morfologia espermática 61 2.14.3 Procedimento de coloração Shorr para morfologia espermática 63 2.14.4 Procedimento de coloração rápida para morfologia espermática 64 2.15 Examinando a preparação corada 65 2.15.1 Classificação da morfologia normal dos espermatozoides 65 2.15.2 Classificação da morfologia anormal dos espermatozoides 66 2.16 Placas morfológicas 1–14 70 2.17 Analisando a morfologia do esperma 108 2.17.1 Avaliação da morfologia dos espermatozoides normais 108 2.17.2 Exemplos práticos 109 2.17.3 Limite inferior de referência 109 2.17.4 Avaliação da morfologia dos espermatozoides anormais 109 2.17.5 Exemplo prático 110 2.17.6 Avaliação dos defeitos espermáticos específicos 110 2.18 Avaliação de leucócitos no sêmen 111 2.18.1 Coloração de peroxidase celular usando orto-toluidina 111 2.19 Avaliação de células germinativas imaturas no sêmen 116 2.20 Teste para revestimento de anticorpos para espermatozoides 116 2.20.1 O teste de reação mista de antiglobulina 117 2.20.2 Teste direto immunobead (imunoesferas) 119 2.20.3 Teste indireto immunobead (imunoesferas) 122 vii Capítulo 3 Procedimentos Opcionais 124 3.1 Índices de múltiplos defeitos espermáticos 124 3.1.1 Cálculo de índices de múltiplos defeitos morfológicos 124 3.1.2. Exemplo prático 125 3.2 Coloração imunocitoquímica de pan-leucócitos (CD45) 126 3.2.1 Princípio 126 3.2.2 Reagentes 126 3.2.3 Procedimento 127 3.3 Interação entre espermatozoides e muco cervical 130 3.3.1 Teste in vivo (pós-coital) 130 3.3.2 Testes in vitro 133 3.3.3 Teste de lâmina simplificado in vitro 134 3.3.4 Teste de tubo capilar 135 3.4 Ensaios bioquímicos para a função dos órgãos sexuais acessórios 138 3.4.1 Medição de zinco no plasma seminal 139 3.4.2 Medição de frutose no plasma seminal 140 3.4.3 Medição de α-glucosidase neutra no plasma seminal 142 3.5 Análise de esperma assistida por computador (CASA) 145 3.5.1 Introdução 145 3.5.2 Uso de CASA para avaliar a motilidade dos espermatozoides 146 3.5.3 Uso de CASA para estimar a concentração de espermatozoides 149 3.5.4 Avaliação morfométrica espermática auxiliada por computador 149 Capítulo 4 Procedimentos de pesquisa 151 4.1 Espécies que reagem ao oxigênio 151 4.1.1 Introdução 151 4.1.2 Medição de espécies reativas de oxigênio geradas por suspensões de espermatozoides 152 4.2 Testes de interação espermatozoide-oócito humano 156 4.3 Testes de ligação da zona pelúcida humana 156 4.4 Avaliação da reação acrossômica 156 4.4.1 Procedimento para a avaliação da fluorescência do estado acrossomal157 4.4.2 Ensaio de reação acrossômica induzida 159 4.5 Teste de penetração de oócitos de hamster sem zona 161 4.5.1 Protocolo 162 4.6 Avaliação da cromatina espermática 167 PARTE II. PREPARAÇÃO DO ESPERMA Capítulo 5 Técnicas de preparação de esperma 169 5.1 Introdução 169 5.1.1 Separação dos espermatozoides do plasma seminal 169 5.1.2 Escolha do método 169 5.1.3 Eficiência da separação de espermatozóides do plasma seminal e organismos contagiosos 170 5.2 Princípios gerais 170 5.3 Lavagem simples 171 5.3.1 Reagentes 171 5.3.2 Procedimento 171 5.4 “Swim-up” (Capacitação Espermática) direto 172 5.4.1 Reagentes 172 5.4.2 Procedimento 172 viii 5.5 Gradientes de densidade descontínua 173 5.5.1 Reagentes 173 5.5.2 Procedimento 174 5.6 Preparando amostras de sêmen infectadas comHIV 174 5.7 Preparando espermatozoides testiculares e epididimários 175 5.7.1 Método enzimático 175 5.7.2 Método mecânico 175 5.7.3 Processando suspensões espermáticas para injeção intracitoplasmática de espermatozoides 176 5.8 Preparando amostras de ejaculação retrógrada 176 5.9 Preparando amostras de ejaculação assistida 177 Capítulo 6 Criopreservação de espermatozoides 178 6.1 Introdução 178 6.2 Protocolos de criopreservação de sêmen 182 6.2.1 Procedimento padrão 182 6.2.2 Protocolos de congelamento modificados para amostras oligozoospermáticas e espermatozoides recuperados cirurgicamente 185 6.2.3 Rotulagem de lâminas e frascos 186 PARTE III. GARANTIA DA QUALIDADE Capítulo 7 Garantia de qualidade e controle de qualidade 188 7.1 Controle de qualidade no laboratório de andrologia 188 7.2 A natureza dos erros na análise do sêmen 188 7.3 Minimizando o erro de amostragem estatístico 189 7.4 O programa de garantia de qualidade 191 7.5 Manual de procedimentos laboratoriais 192 7.6 Controle de qualidade interno 192 7.6.1 Amostras comerciais de Controle de Qualidade Interno 193 7.6.2 Amostras de Controle de Qualidade Interno produzidas no laboratório193 7.6.3 Amostras de Controle Interno armazenadas (comerciais ou produzidas no laboratório) 193 7.6.4 Amostras de Controle de Qualidade Interno frescas (produzidas em laboratório) 194 7.7 Procedimentos estatísticos para analisar e informar erros sistemáticos entre técnicos 195 7.7.1 O gráfico Xbar 195 7.7.2 O gráfico S 197 7.8 QC para percentagens 199 7.9 Avaliando os gráficos Xbar e S 199 7.9.1 Como reconhecer valores fora de controle 200 7.9.2 Causas de valores fora de controle 200 7.9.3 Respostas a valores fora de controle 201 7.10 Procedimentos estatísticos para analisar e informar a variabilidade do técnico 201 7.10.1 Comparando os resultados de dois ou mais técnicos 201 7.10.2 Monitorando médias mensais 203 7.11 Controle de qualidade externo e garantia de qualidade 204 7.11.1 Avaliação dos resultados do Controle de Qualidade Externo 206 7.11.2 Respostas a resultados fora de controle 207 7.12 Frequência e prioridade do controle de qualidade 207 7.13 Treinamento 208 ix 7.13.1 Dicas práticas ao experimentar dificuldades em avaliar a concentração de espermatozoides 208 7.13.2 Dicas práticas ao experimentar dificuldades em avaliar a morfologia dos espermatozoides 211 7.13.3 Dicas práticas ao experimentar dificuldades em avaliar a motilidade dos espermatozoides 212 7.13.4 Dicas práticas ao experimentar dificuldades em avaliar a vitalidade dos espermatozoides 213 REFERÊNCIAS APÊNDICES Apêndice 1 Valores de referência e nomenclatura do sêmen 231 A1.1 Valores de referência 231 A1.2 Nomenclatura 233 Apêndice 2 Equipamento e segurança 235 A2.1 Suprimentos básicos necessários em um laboratório de andrologia 235 A2.2 Potenciais riscos biológicos em um laboratório de andrologia 237 A2.3 Procedimentos de segurança para pessoal de laboratório 237 A2.4 Procedimentos de segurança para equipamentos de laboratório 240 A2.5 Precauções de segurança ao manusear nitrogênio líquido 240 Apêndice 3 Microscopia 242 A3.1 Montando a amostra 242 A3.2 Ajustando as oculares 244 A3.3 Focando a imagem 244 A3.4 Focando as oculares 244 A3.5 Focando o condensador de luz 244 A3.6. Centrando o condensador 245 A3.7 Ajustando os anéis de fase 245 A3.8 Microscopia de fluorescência 245 Apêndice 4 Soluções padrão 246 A4.1 Biggers, Whitten e Whittingham 246 A4.2 Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 246 A4.3 Meio de Earle 247 A4.4 Meio F-10 de Ham 247 A4.5 Solução salina equilibrada de Hanks 247 A4.6 Fluido tubário humano 247 A4.7 Meio de Krebs-Ringer 248 A4.8 Solução salina Tris-tamponada 248 A4.9 Solução de Tyrode 249 A4.10 Coloração de Papanicolaou 249 Apêndice 5 Muco cervical 252 A5.1 Introdução 252 A5.2 Coleta e preservação do muco cervical 253 A5.3 Avaliação do muco cervical 254 x Apêndice 6 Formulários de registro para análises de sêmen e muco cervical 258 A6.1 Modelo para um formulário de registro de análise de sêmen 258 A6.2 Modelo para um formulário de registro de muco cervical 260 Apêndice 7 Erros de amostragem e controle de qualidade 261 A7.1 Erros na medição da concentração de espermatozoides 261 A7.2 A importância de entender erros de amostragem 263 A7.3 Erros na medição de porcentagens 264 A7.4 Produção de amostras de sêmen para controle de qualidade 268 A7.5 Preparação de uma gravação de vídeo para controle de qualidade interno de análise de motilidade espermática 268 A7.6 Preparação de sêmen diluído para controle interno da qualidade na determinação da concentração espermática 272 A7.7 Preparação de lâminas para controle de qualidade interno de avaliação da morfologia espermática 276 A7.8 Calibração de equipamentos 278 Apêndice 8 Programas nacionais de controle de qualidade externa para análise de sêmen 280 FIGURAS Fig 2.1 Variação do número total de espermatozoides e concentração espermática durante um período de um ano e meio 7 Fig 2.2 Agregação não específica de espermatozoides no sêmen 16 Fig 2.3 Diagrama esquemático de diferentes extensões de aglutinação de espermatozoides 18 Fig 2.4 Dicas para avaliar a motilidade dos espermatozoides 21 Fig 2.5 Esfregaço de eosina-nigrosina observado em óptica de campo claro 25 Fig 2.6 Representação esquemática de alterações morfológicas típicas em espermatozoides humanos submetidos a estresse hipoosmótico 29 Fig 2.7 O hemocitômetro de Neubauer melhorado 31 Fig 2.8 Quais espermatozoides contar nos quadrados da grade 32 Fig 2.9 Exame de toda a lamínula para procura de espermatozoides móveis 42 Fig 2.10 Espermatozoides morfologicamente "normais" 53 Fig 2.11 Métodos de esfregaço de sêmen para morfologia espermática 54 Fig 2.12 Preparando um esfregaço de sêmen normal 55 Fig 2.13 Desenhos esquemáticos de algumas formas anormais de espermatozoides humanos 64 Fig 2.14 Células positivas e negativas para peroxidase no sêmen humano 102 Fig 3.1 Leucócitos no sêmen 118 Fig 3.2 O medidor de penetração de espermatozoides de Kremer 125 Fig 3.3 Terminologia padrão para variáveis medidas pelos sistemas CASA 136 Fig 4.1 Quimioluminescência gerada em resposta ao tratamento com zimosano opsonizado 143 Fig 4.2 Contribuições relativas feitas por subpopulações de leucócitos e espermatozoides para a capacidade de geração de oxigênio reativo da suspensão celular 144 Fig 4.3 Coloração de espermatozoides humanos com aglutinina Pisum sativum fluorescente (PSA) 148 Fig 4.4 Micrografia de contraste de fase de um oócito de hamster sem zona contendo espermatozoides humanos 155 xi Fig 7.1 Um gráfico Xbar para concentração de espermatozoides 185 Fig 7.2 Um gráfico S para concentração de espermatozoides 186 Fig 7.3 Um gráfico Bland–Altman de estimativas manuais e do sistema CASA da porcentagem de motilidade espermática progressiva 190 Fig 7.4 Gráfico de estimativas de Youden da concentração de espermatozoides 190 Fig A2.1 Nomograma para determinar a força centrífuga relativa (RCF) a partir do raio do rotor e a velocidade de rotação 225 Fig A5.1 Exemplos de formação de “figuras de samambaia” no muco cervical seco ao ar em uma lâmina de vidro 240 Fig A7.1 Diferenças aceitáveis entre duas contagens replicadas em função do número total de espermatozoides avaliados 249 Fig A7.2 As diferenças aceitáveis entre duas avaliações de porcentagem replicadas em função da porcentagem real e do número total de espermatozoides avaliados 253 Fig A7.3 Dicas para avaliar a motilidade dos espermatozoides 258 Fig A7.4 Visualização através de uma ocular com retículo (grade vermelha) 258 Fig A7.5 Visualização da imagem gravada em vídeo do micrômetro da platina no monitor e no acetato desenhado; veja o texto para explicação 259 QUADROS Quadro 2.1 Conformidade da compatibilidade dos recipientes de coleta de sêmen 9 Quadro 2.2 Preparação de bromelaína 12 Quadro2.3 Mistura completa de sêmen 15 Quadro 2.4 Profundidade das preparações úmidas 16 Quadro 2.5 Erros na estimativa de porcentagens 21 Quadro 2.6 Comparação de porcentagens replicadas 22 Quadro 2.7 Erros na estimativa de números 33 Quadro 2.8 Atingir 200 espermatozoides por réplica nas três grades centrais da câmara melhorada de Neubauer 34 Quadro 2.9 Volume observado por campo de alta potência de uma preparação úmida com 20 µm de profundidade 35 Quadro 2.10 Comparação de contagens replicadas 38 Quadro 2.11 Atingir 200 espermatozoides por réplica em todas as nove grades centrais da câmara melhorada de Neubauer 44 Quadro 2.12 Atingir 200 espermatozoides por réplica em uma câmara descartável de grande volume com 100 μm de profundidade 47 Quadro 2.13 Volume observado por campo de alta potência em uma câmara descartável de grande volume com 100 µm de profundidade 49 Quadro 2.14 Meios de montagem 58 Quadro 3.1 Preparação da mistura de cera com vaselina 121 Quadro 3.2 Volume observado por campo de alta potência em uma preparação de muco com 100 µm de profundidade 121 Quadro 4.1 Indução da ovulação em hamsters 153 Quadro 4.2 Preparação de pipetas de vidro 154 Quadro 6.1 Razões para a criopreservação de espermatozoides 168 Quadro 6.2 Avaliação de risco da criopreservação e o armazenamento de sêmen humano 169 Quadro 7.1 Terminologia em garantia de qualidade e controle de qualidade 178 Quadro 7.2 Determinando os valores para os limites de aviso e controle de ação de um gráfico Xbar 184 Quadro 7.3 Método alternativo para calcular os limites de controle Xbar a partir do 184 xii desvio padrão combinado Quadro 7.4 Determinando os valores para os limites de aviso e controle de ação de um gráfico S 186 Quadro 7.5 Regras de controle básicas para gráficos de controle de qualidade 188 Quadro 7.6 Avaliando diferenças sistemáticas entre técnicos 193 Quadro 7.7 Principais características dos procedimentos em Controle de Qualidade Interno 194 Quadro 7.8 Cronograma para controle de qualidade 195 Quadro 7.9 Resumo dos testes de Controle de Qualidade 196 Quadro A2.1 Calculando forças centrífugas 224 Quadro A3.1 Lente objetiva 230 Quadro A5.1 Determinando o volume de muco coletado 241 Quadro A5.2 Volume observado por campo de alta potência em uma preparação de muco com 100 µm de profundidade 243 TABELAS Tabela 2.1 Diferenças aceitáveis entre duas percentagens para uma média dada, determinadas a partir de contagens replicadas de 200 espermatozoides (total de 400 contados) 22 Tabela 2.2 Erros de amostragem arredondados (%) de acordo com o número total de espermatozoides 33 Tabela 2.3 Diluições de sêmen necessárias, como fazê-las, quais câmaras usar e áreas potenciais para avaliar 35 Tabela 2.4 Diferenças aceitáveis entre duas contagens replicadas para uma determinada soma 38 Tabela 2.5 Diferenças aceitáveis entre duas contagens para uma soma dada: baixas concentrações 45 Tabela 2.6 Explicações usadas nos comentários das Placas (1–14) 67 Tabela 2.7 Quantidade de sêmen a ser utilizado para um teste com imunoesferas 109 Tabela 3.1 Cálculo de índices de múltiplos defeitos espermáticos 114 Tabela 3.2 Índice de defeitos espermáticos para homens de casais férteis e inférteis 115 Tabela 3.3 Ordem de classificação da densidade de penetração de espermatozoides 126 Tabela 3.4 Classificação dos resultados dos testes de tubos capilares 127 Tabela 7.1 Fatores para determinar os limites de controle para gráficos Xbar e gráficos S baseados no desvio padrão médio (Sbar) 183 Tabela 7.2 Fontes de variação (erro) na avaliação da concentração espermática e soluções propostas 197 Tabela 7.3 Fontes de variação (erro) na avaliação da morfologia dos espermatozoides e soluções propostas 198 Tabela 7.4 Fontes de variação (erro) na avaliação da motilidade dos espermatozoides e soluções propostas 199 Tabela 7.5 Fontes de variação (erro) na avaliação da vitalidade dos espermatozoides e soluções propostas 200 Tabela A1.1 Limites de referência mais baixos (5º percentis e seus intervalos de confiança de 95%) para as características do sêmen 219 Tabela A1.2 Distribuição de valores dos parâmetros do sêmen de homens cujas parceiras engravidaram no prazo de 12 meses após a interrupção do uso de contraceptivos 219 Tabela A1.3 Nomenclatura relacionada à qualidade do sêmen 221 xiii Tabela A7.1 Diferenças aceitáveis entre duas contagens replicadas para uma determinada soma 249 Tabela A7.2 Diferenças aceitáveis entre duas percentagens para uma média dada, determinadas a partir de contagens replicadas de 100 espermatozoides (total de 200 contados) 254 Tabela A7.3 Diferenças aceitáveis entre duas percentagens para uma média dada, determinadas a partir de contagens replicadas de 200 espermatozoides (total de 400 contados) 254 Tabela A7.4 Diferenças aceitáveis entre duas percentagens para uma média dada, determinadas a partir de contagens replicadas de 400 espermatozoides (total de 800 contados) 254 xiv Agradecimentos Esta publicação foi produzida pelo Programa Especial do PNUD / UNFPA / OMS / o Programa Especial para a Pesquisa do Banco Mundial, Desenvolvimento e Treinamento em Pesquisa da Reprodução Humana (HRP), Departamento de Saúde Reprodutiva e Pesquisa da OMS (RHR). A participação dos seguintes indivíduos na preparação e edição deste manual é reconhecida com gratidão: Editor chefe Dr Trevor G Cooper Centro de Medicina Reprodutiva e Andrologia da Universidade, Münster, Alemanha (Centro Colaborador da OMS para Pesquisa em Reprodução Masculina) Equipe Editorial Dr John Aitken Faculdade de Ciências Biológicas da Vida e Ciências Ambientais, University Drive Callaghan, New South Wales, Austrália Dr Jacques Auger Serviço de Biologia da Reprodução Pavillon Cassini Hôpital Cochin Paris, França Dr HW Gordon Baker Universidade de Melbourne, Departamento de Obstetrícia e Ginecologia Royal Women’s Hospital Carlton, Victoria, Austrália Dr Chris LR Barratt Divisão de Ciências da Saúde Materna e Infantil Faculdade de Medicina Ninewells Hospital Dundee, Escócia Dr Hermann M Behre Centro de Medicina Reprodutiva e Andrologia Universidade Martin Luther de Halle- Wittenberg Halle, Alemanha Dr Lars Björndahl Centro de Andrologia, Universidade Karolinska, Hospital e Instituto, Estocolmo, Suécia Charlene Brazil Centro de Saúde e Meio Ambiente Universidade da Califórnia Davis, CA, EUA Dr Christopher De Jonge Universidade de Minnesota Centro de Medicina Reprodutiva Minneapolis, MN, EUA Dr Gustavo F Doncel CONRAD Departamento de Obstetrícia e Ginecologia de Virgínia Oriental Escola de Medicina Norfolk, VA, EUA Dr Daniel Franken Departamento de Obstetrícia e Ginecologia Hospital Tygerberg Tygerberg, África do Sul Dr Trine B Haugen Faculdade de Ciências da Saúde Escola Superior de Oslo Oslo, Noruega Dr Aucky Hinting Unidade de Andrologia, Departamento de Biomedicina Faculdade de Medicina Universidade de Airlangga, Surabaya, Indonésia Godwin E Imade Departamento de Obstetrícia e Ginecologia Faculdade de Ciências Médicas da Universidade de Jos Jos, Nigéria Dr Thinus F Kruger Unidade de Biologia Reprodutiva Universidade de Stellenbosch xv Tygerberg, África do Sul Dr Hesbon O Odongo Departamento de Zoologia Universidade de Nairobi Nairobi, Quênia Elizabeth Noonan Centro de Pesquisa em Câncer Fred Hutchinson Centro Estatístico para Pesquisa e Prevenção do HIV/AIDS Seattle, WA, EUA Dr Steven M Schrader Instituto Nacional de Segurança e Saúde Ocupacional Centros de Controle e Prevenção de Doenças Cincinnati, OH, EUA Dr Christina CL Wang Centro Médico Harbor-UCLA Torrance, CA, EUA Dr William Shu-Biu Yeung Departamento de Obstetrícia e Ginecologia Universidade de Hong Kong Hong Kong SAR, China Secretaria da OMS, Departamento de Saúde Reprodutiva e Pesquisa Dr Kirsten M Vogelsong Cientista Gerentede Área de Pesquisa Dr Sigrid von Eckardstein Ex-Gerente de Área de Pesquisa em Ação Dr Michael T Mbizvo Diretor ad interim Maud Keizer Secretária Agradecimentos adicionais para: Cathy Treece, Charlene Tollner e o professor Jim Overstreet (Universidade da Califórnia, Davis, CA, EUA) pela produção de micrografias morfológicas e verificação da mídia; Dr. Rune Eliasson (Hospital Sophia hemmet, Estocolmo, Suécia) por ajudar na definição de células não-espermáticas; Dr. Timothy Farley (Organização Mundial da Saúde, Genebra, Suíça) pela revisão das seções sobre controle de qualidade; e o Dr. Gary N Clarke (Royal Women's Hospital, Carlton, Austrália), o Dr. Roelof Menkveld (Hospital Acadêmico Tygerberg e Universidade de Stellenbosch, Tygerberg, África do Sul) e o Professor Pieter Wranz (Universidade de Stellenbosch, Tygerberg, África do Sul) por fornecer informações adicionais usadas na compilação do manual. O apoio financeiro da Sociedade Internacional de Andrologia é reconhecido com gratidão. Esta edição do manual é dedicada à memória do falecido Geoffrey Waites (1928–2005), ex- gerente da Força Tarefa da OMS sobre Métodos para a Regulamentação da Fertilidade Masculina e coeditor da segunda, terceira e quarta edições deste manual de laboratório. A devoção do comitê editorial à sua tarefa foi impulsionada pela sua apreciação da honestidade, justiça e preocupação de Geoff pelos desprivilegiados. O PNCQ agradece aos seguintes profissionais de Análises Clínicas que ajudaram a revisar o documento traduzido: 1. Dr. Orildo dos Santos Pereira 2. Dr. Francisco Edison Pacifici Guimarâes 3. Dr. José Abol Corrêa vi Siglas e abreviaturas usadas neste manual Ac Anticorpo AI Inseminação artificial AID Inseminação artificial com sêmen de doador AIH Inseminação artificial com sêmen do marido ALH Amplitude de deslocamento da cabeça lateral ANOVA Análise de variância APAAP Complexo de fosfatase alcalina-fosfatase antialcalina AR Acrossoma reagido ART Tecnologia reprodutiva assistida ASA Anticorpo antiesperma BAEE Éster etílico da N-benzoil-L-arginina BCF Frequência de batimento de cauda (Hz) BSA Albumina de soro bovino BWW Biggers, Whitten e Whittingham CASA Análise de esperma assistida por computador CASMA Avaliação morfométrica espermática auxiliada por computador CBAVD Ausência bilateral congênita do ducto deferente CD Disco compacto CD Gota citoplasmática CD45 Cluster de determinação 45 (marcador pan-leucócito) CD46 Cluster de determinação 46 (antígeno acrossomal) IC Intervalo de confiança LC Limites de confiança CO Dióxido de carbono DMSO Sulfóxido de dimetilo DNA Ácido desoxirribonucleico DPBS Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco DVD Disco versátil digital EDTA Ácido etilenodiaminotetracético EQA Garantia de qualidade externa EQC Controle de qualidade externo ERC Citoplasma residual em excesso FITC Isotiocianato de fluoresceína FMLP Formil-metionil-leucil-fenilalanina GIFT Transferência intrafalopiana de gametas GPC Glicerofosfocolina H2O2 Peróxido de hidrogênio HBSS Solução salina equilibrada de Hanks HBV Vírus da hepatite B hCG Gonadotrofina coriônica humana HCV Vírus da hepatite C HIV Vírus da imunodeficiência humana HOP Penetração de oócitos de hamster HOS Inchaço hipoosmótico HPF Campo de alta potência HRP Peroxidase de rábano HSA Albumina de soro humano HTF Fluido tubário humano IB Immunobead IBT Teste immunobead ICSI Injeção intracitoplasmática de espermatozoides Ig Imunoglobulina IM Imobilidade vii IQC Controle de qualidade interno IU Unidade internacional IUI Inseminação intrauterina IVF Fertilização in vitro KRM Meio de Krebs-Ringer LIN Índice de progressão LLQ Limite inferior de quantificação LPF Campo de baixa potência MAD Deslocamento angular médio MAI Índice de anomalias múltiplas MAR Reação mista de antiglobulina NA Abertura numérica NP Não progressiva (motilidade) PBS Solução salina tamponada com fosfato PDCA Planejar, fazer, checar, atuar PMA Forbol 12-miristato 13-acetato PMSG Gonadotropina sérica de égua grávida PNPG Glucopiranósido de p-nitrofenol PR Progressiva (motilidade) PSA Aglutinina de Pisum sativum QA Garantia da qualidade QC Controle de qualidade RCF Força centrífuga relativa RI Índice de refração RNA Ácido ribonucleico ROS Espécies que reagem ao oxigênio r.p.m. Rotações por minuto SD Desvio padrão SDI Índice de deformidade espermática SDS Dodecil sulfato de sódio SE Erro padrão SOP Procedimento operacional padrão STR Linearidade (VSL/VAP) TBS Solução salina Tris-tamponada TGG Glicose glicerol de Tyrode TZI Índice de teratozoospermia VAP Velocidade média na trajetória VCL Velocidade curvilínea VSL Velocidade progressiva (retilínea) OMS Organização Mundial da Saúde WOB Oscilação (VAP/VCL) 1 CAPÍTULO 1 Antecedentes 1.1 Introdução O manual de laboratório da OMS para o exame da interação sêmen humano e muco-cervical foi publicado pela primeira vez em 1980, em resposta a uma crescente necessidade de padronização de procedimentos para o exame do sêmen humano. Desde então, foi atualizado três vezes e traduzido em várias línguas. Nos últimos 30 anos, o manual foi reconhecido por fornecer padrões globais e tem sido amplamente utilizado por laboratórios de pesquisa e de clínicas no mundo todo. Apesar desse sucesso, tornou-se evidente que algumas recomendações de edições anteriores do manual precisavam ser revisadas à luz de novas evidências e que alguns conceitos precisavam de mais explicações e evidências de apoio. Solicitada por estas considerações, a OMS estabeleceu um comitê editorial para revisar todos os métodos descritos no manual, com o objetivo de endossá-los, modificá-los ou atualizá-los. Em muitos casos, isso se mostrou difícil, pois dados insuficientes haviam sido obtidos usando os métodos descritos no manual. Em alguns casos, laboratórios individuais e bem credenciados obtinham resultados consistentes, mas estes não haviam sido confirmados por outros. Para essas situações, o comitê editorial desenvolveu uma posição de consenso após avaliar a literatura pertinente. Recomendações adicionais foram recebidas de técnicos e cientistas em quanto à necessidade de mais detalhes para muitos dos métodos descritos. A falta de detalhes nas edições anteriores levou a que alguns laboratórios preferiram usar métodos descritos em outros lugares, ou desenvolveram suas próprias versões de métodos, enquanto ainda afirmam realizar análises de sêmen de acordo com o manual da OMS. A fim de facilitar comparações globais, esta edição do manual, portanto, inclui muito mais detalhes e a justificativa é explicada quando métodos alternativos de análise são apresentados. Recomenda-se que, ao relatar resultados em artigos publicados, os laboratórios indiquem qual método específico foi usado quando se referirem a este manual. 1.2 A quinta edição A quinta edição compreende três partes: análise de sêmen (Capítulos 2–4), preparação do esperma (Capítulos 5 e 6) e garantia de qualidade (Capítulo 7). A parte I, que trata da análise do sêmen, assemelha-se à das edições anteriores, mas é dividida em três capítulos: métodos padrão, que são procedimentos rotineiros robustos para determinar a qualidade do sêmen; testes opcionais, que podem ser utilizados em determinadas situações ou por escolha do laboratório; e testes de pesquisa, que atualmente não são considerados rotineiros. Como a cultura do sêmen não é normalmente realizada em um laboratório de andrologia, isso é mencionado apenas na seção sobre coleta estéril de sêmen. A seção sobre a preparação dos esperma estende-se além do ejaculado para incluir os espermatozoides obtidos dos testículos e epidídimos. Intercaladas com instruções metodológicas com marcadores estão as Notas (explicações da metodologia), Comentários (interpretação dos resultados) e Caixas (contendo material explicativo adicional). As principaiscaracterísticas desta quinta edição estão descritas abaixo. x Os capítulos sobre análise de sêmen incluem detalhes de todas as soluções de trabalho, procedimentos, cálculos e interpretação, de modo que qualquer metodologia dada está essencialmente completa com mínima referência cruzada para outras partes do manual. x A seção sobre a preparação de espermatozoides foi ampliada e um capítulo sobre criopreservação de espermatozoides foi adicionado. Procedimentos relacionados à análise do muco cervical foram divididos entre o capítulo sobre procedimentos opcionais e um apêndice sobre características do muco. x Há menos apêndices do que nas edições anteriores e estão restritos a informações especializadas ou raramente necessárias. x Avaliação do número de espermatozoides. As diluições de sêmen e as áreas da câmara de contagem usadas para avaliar o número de espermatozoides em uma amostra de sêmen foram alteradas para permitir a contagem de 200 espermatozoides por alíquota utilizada. A importância dos erros de amostragem e a certeza dos resultados numéricos obtidos são enfatizadas. O comitê editorial considerou que o número total de espermatozoides por ejaculado fornece uma avaliação mais precisa da função testicular do que a concentração de espermatozoides, mas para isso o volume de sêmen tem que ser medido com precisão. x Avaliação de azoospermia. Embora superficialmente simples, o diagnóstico de azoospermia é confundido por muitos fatores, incluindo grandes erros associados com a contagem de poucos espermatozoides, o grande número de campos microscópicos a serem analisados e as dificuldades em examinar aglomerações de esperma carregadas de detritos. As mudanças recomendadas incluem o exame de amostras fixadas, amostras não- centrifugadas e a sensibilidade dos métodos de contagem empregados. No entanto, também estão incluídos os métodos de centrifugação necessários para acumular um número suficiente de células para procedimentos terapêuticos e os métodos para a detecção de espermatozoides móveis em amostras não- fixadas para avaliação de sêmen pós-vasectomia. x Avaliação de motilidade. Uma grande mudança respeito às edições anteriores está na categorização da motilidade dos espermatozoides. Recomenda-se agora que os espermatozoides sejam categorizados como progressivamente móveis não progressivamente móveis e imóveis (em vez das notas a, b, c ou d). x Avaliação da morfologia dos espermatozoides. Alguns laboratórios avaliam apenas formas normais, enquanto outros consideram o tipo, localização e extensão da anormalidade como mais importantes. Se essas avaliações, ou diferenciais, ou semiquantitativas, aumentam o valor da análise do sêmen, permanece controverso. Evidências que apoiam a relação entre a porcentagem de formas normais (como definido pela categorização estrita ou avaliação auxiliada por computador da morfologia) e taxas de fertilização in vivo justificam a tentativa de determinar uma subpopulação morfologicamente distinta de espermatozoides dentro do sêmen. Nesta edição são incluídas mais micrografias, e de melhor qualidade, de espermatozoides considerados normais e limítrofes, acompanhadas de explicações de por que cada espermatozoide foi classificado dessa maneira. Isso deve ajudar na formação de técnicos especializados em categorizar os espermatozoides de forma fidedigna. Dados recentes de uma população fértil forneceram dados de valores de referência para a porcentagem de formas morfologicamente normais. x Controle de qualidade. Este capítulo foi completamente reescrito. É necessária uma garantia de qualidade rigorosa para a análise do sêmen para que os métodos analíticos sejam robustos. Dicas e sugestões são dadas sobre como melhorar o desempenho do laboratório quando os resultados do controle de qualidade são insatisfatórios. x Intervalos de referência e limites de referência. Os dados que caracterizam a qualidade do sêmen em homens férteis, cujas parceiras tiveram um tempo de gravidez de 12 meses ou menos, forneceram as faixas de referência para este manual. Dados brutos entre 400 e 1900 amostras de sêmen, de pais recentes em oito países de três continentes, foram usados para gerar os intervalos de referência. A tradição estatística convencional consiste em considerar o percentil 2.5 de um intervalo de referência bilateral como o limiar abaixo do qual os valores podem ser considerados provenientes de uma população diferente. No entanto, um intervalo de referência unilateral foi considerado mais apropriado para o sêmen, uma vez que valores altos de qualquer parâmetro não são prejudiciais à fertilidade. O 5º percentil é dado como o limite de referência inferior e a distribuição completa para cada parâmetro de sêmen também é dada no Apêndice 1. 1.3 Alcance do manual Os métodos descritos aqui servem como diretrizes para melhorar a qualidade da análise do sêmen e a comparabilidade dos resultados. Eles não devem necessariamente ser tomados como obrigatórios pelos organismos locais, nacionais ou globais de acreditação de laboratórios. A análise de sêmen pode ser útil em ambientes clínicos e de pesquisa, para investigar o estado de fertilidade masculina, bem como monitorar a espermatogênese durante e após a regulação da fertilidade masculina. PARTE I. Análise do sêmen 5 CAPÍTULO 2 Procedimentos padrão 2.1 Introdução Durante a ejaculação, o sêmen é produzido a partir de uma suspensão concentrada de espermatozoides, armazenados nos dois epidídimos, misturados com, e diluídos por secreções líquidas dos órgãos sexuais acessórios. É emitido em vários bolos. A comparação dos volumes de sêmen pré e pós-vasectomia revela que cerca de 90% do volume de sêmen é constituído por secreções dos órgãos acessórios (Weiske, 1994), principalmente a próstata e as vesículas seminais, com contribuições menores das glândulas bulbouretrais (Cowper) e dos epidídimos. O sêmen tem dois principais atributos quantificáveis: x O número total de espermatozoides: isso reflete a produção de espermatozoides pelos testículos e a patência do sistema de ductos pós- testiculares; x O volume total de fluidos fornecidos pelas várias glândulas acessórias: isso reflete a atividade secretora das glândulas. A natureza dos espermatozoides (sua vitalidade, motilidade e morfologia) e a composição do fluido seminal também são importantes para a função espermática. Durante a relação sexual, a fração prostática inicial e rica em espermatozoides do sêmen ejaculado pode entrar em contato com o muco cervical que se estende para a vagina (Sobrero & MacLeod, 1962), com o restante do fluido permanecendo como um reservatório na vagina. Em contraste, no ambiente de laboratório, todo o ejaculado é coletado em um recipiente, onde os espermatozoides ficam presos em um coágulo desenvolvido a partir de proteínas de origem vesicular seminal. Esse coágulo é subsequentemente liquefeito pela ação de proteases prostáticas, durante as quais sua osmolalidade aumenta (Björndahl & Kvist, 2003; Cooper et al., 2005). Há alguma evidência de que a qualidade das amostras de sêmen varia dependendo de como o ejaculado é produzido. Os ejaculados produzidos pela masturbação e coletados em recipientes em uma sala próxima ao laboratório podem ser de qualidade inferior àqueles recuperados de preservativos não espermicidas usados durante a relação sexual em casa (Zavos & Goodpasture, 1989). Essa diferença pode refletir uma forma diferente de excitação sexual, já que o tempo gasto produzindo uma amostra pela masturbação - refletindo a extensão da emissão seminal antes da ejaculação - também influencia a qualidade do sêmen (Pound et al., 2002). Em determinadas condições de coleta, a qualidade do sêmen depende de fatores que normalmente não podem ser modificados, como a produção de espermatozoides pelos testículos, secreções de órgãos acessórios e doenças recentes(particularmente febris), além de outros fatores, como o tempo de abstenção, que devem ser registrados e levados em conta na interpretação dos resultados. 6 Os resultados das medições laboratoriais da qualidade do sêmen dependerão de: x Se uma amostra completa é coletada. Durante a ejaculação, as primeiras frações de sêmen descartadas são principalmente fluidos prostáticos ricos em espermatozoides enquanto as frações posteriores são dominadas pelo fluido vesicular seminal (Björndahl & Kvist, 2003). Portanto, perder a primeira porção (rica em espermatozoides) do ejaculado tem mais influência sobre os resultados da análise do sêmen do que perder a última porção. x A atividade das glândulas sexuais acessórias, cujos fluidos diluem os espermatozoides epididimários concentrados na ejaculação (Eliasson, 2003). A concentração de espermatozoides não é uma medida direta da produção espermática dos testículos, pois é influenciada pelo funcionamento de outros órgãos reprodutivos; no entanto, o número total de espermatozoides ejaculados é (concentração de espermatozoides multiplicada pelo volume de sêmen). Por exemplo, as concentrações espermáticas no sêmen de homens jovens e idosos podem ser as mesmas, mas o número total de espermatozoides pode diferir, já que tanto o volume de fluido seminal quanto o total de espermatozoides diminuem com a idade, pelo menos em algumas populações (Ng et al., 2004). x O tempo desde a última atividade sexual. Na ausência de ejaculação, os espermatozoides se acumulam nos epidídimos, depois transbordam para a uretra e são liberados na urina (Cooper et al., 1993; De Jonge et al., 2004). A vitalidade espermática e a cromatina não são afetadas pelo aumento do tempo de abstinência (Tyler et al., 1982b; De Jonge et al., 2004), a menos que a função epididimária seja perturbada (Correa-Perez et al., 2004). x O penúltimo período de abstinência. Como os epidídimos não são completamente esvaziados por uma ejaculação (Cooper et al., 1993), alguns espermatozoides permanecem do tempo da ejaculação anterior. Isso influencia a faixa etária e a qualidade dos espermatozoides no ejaculado (Tyler et al., 1982a). A extensão dessa influência é difícil de determinar e raramente é levada em conta. x O tamanho do testículo, que influencia o número total de espermatozoides por ejaculado (Handelsman et al., 1984; OMS, 1987; Behre et al., 2000; Andersen et al., 2000). O tamanho testicular reflete o nível de atividade espermatogênica, que também afeta a morfologia espermática (Holstein et al., 2003). Comentário: A grande variação biológica na qualidade do sêmen (Castilla et al., 2006) reflete os muitos fatores listados acima e requer que todas as medidas no sêmen sejam precisas. Esses fatores variáveis e amplamente incontroláveis explicam a conhecida variação intraindividual da composição do sêmen (Baker & Kovacs, 1985; Alvarez et al., 2003). A Fig. 2.1 mostra as variações ao longo do tempo na composição do sêmen, avaliadas pelos métodos recomendados pela OMS, de cinco jovens voluntários saudáveis que participaram no grupo placebo de um estudo de contracepção hormonal masculina. Tal variabilidade tem consequências para a interpretação das análises do sêmen: 7 x É impossível caracterizar a qualidade do sêmen de um homem a partir da avaliação de uma única amostra de sêmen. x É útil examinar duas ou três amostras para obter dados de linha de base (Poland et al., 1985; Berman et al., 1996; Carlsen et al., 2004; Castilla et al., 2006; Keel, 2006). Enquanto as medições feitas em toda a população de espermatozoides ejaculados não podem definir a capacidade de fertilização dos poucos que chegam ao local de fertilização, a análise do sêmen, no entanto, fornece informações essenciais sobre o estado clínico de um indivíduo. Todos os aspectos da coleta e análise de sêmen devem ser feitos através de procedimentos adequadamente padronizados, para que os resultados forneçam informações úteis e válidas. Os testes descritos neste capítulo são procedimentos aceitos que constituem as etapas essenciais na avaliação do sêmen. Fig. 2.1 Variação do número total de espermatozoides e concentração espermática durante um período de um ano e meio Total number (106) Número total (106) Concentration (106 per ml) Concentração (106/ml) Day Dia Dados cortesia de Schering Plough e Bayer Schering Pharma AG. A análise do sêmen envolve as seguintes etapas (descritas em detalhe nas seções subsequentes). 8 Nos primeiros 5 minutos: x Colocar o recipiente de amostra na bancada ou em uma incubadora (37 °C) para liquefação. Entre 30 e 60 minutos: x Avaliação da liquefação e aparência do sêmen. x Medição do volume do sêmen. x Medição do pH do sêmen (se necessário). x Realização de uma preparação úmida para avaliar a aparência microscópica, a motilidade dos espermatozoides e a diluição necessária para avaliar o número de espermatozoides. x Avaliação da vitalidade dos espermatozoides (se a porcentagem de células móveis é baixa). x Realização de esfregaços de sêmen para avaliar a morfologia espermática. x Realização de diluições de sêmen para avaliar a concentração de espermatozoides. x Avaliação do número de espermatozoides. x Realização do teste de reação mista de antiglobulina (MAR) (se necessário). x Avaliação das células positivas para peroxidase (se células redondas estiverem presentes). x Preparação dos espermatozoides para o teste da imunoglobulina (se necessário). x Centrifugação do sêmen (se os marcadores bioquímicos forem analisados). Dentro das primeiras 3 horas: x Envio de amostras para o laboratório de microbiologia (se necessário). Após 4 horas: x Fixação, coloração e avaliação de esfregaços para morfologia espermática. Mais tarde no mesmo dia (ou num dia subsequente se as amostras estiverem congeladas): x Análise de marcadores de glândulas acessórias (se necessário). x Realização do teste immunobead indireto (se necessário). 2.2 Coleta da amostra 2.2.1 Preparação x A amostra deve ser coletada em uma sala privada próxima ao laboratório, a fim de limitar a exposição do sêmen às flutuações de temperatura e controlar o tempo entre a coleta e a análise (ver Seções 2.2.5 e 2.2.6 para exceções). 9 x A amostra deve ser coletada após um mínimo de 2 dias e um máximo de 7 dias de abstinência sexual. Se amostras adicionais forem necessárias, o número de dias de abstinência sexual deve ser o mais constante possível em cada coleta. x O homem deve receber instruções claras, orais ou escritas, sobre a coleta da amostra de sêmen. Devem enfatizar que a amostra de sêmen precisa estar completa e que o homem deve relatar qualquer perda de qualquer fração da amostra. x As seguintes informações devem ser registradas no formulário (ver Apêndice 6, seção A6.1): nome, data de nascimento e número de código pessoal, o período de abstinência, a data e hora da coleta, a integridade da amostra, quaisquer dificuldades na produção da amostra e o intervalo entre a coleta e o início da análise do sêmen. 2.2.2 Coleta de sêmen para fins de diagnóstico ou pesquisa x A amostra deve ser obtida por meio de masturbação e ejaculada em um recipiente limpo, de boca larga, feito de vidro ou plástico, de um lote que tenha sido confirmado como não tóxico para os espermatozoides (ver Quadro 2.1). x O recipiente para amostras deve ser mantido à temperatura ambiente, entre 20 °C e 37 °C, para evitar grandes mudanças de temperatura que possam afetar os espermatozoides depois de serem ejaculados nele. Deve ser etiquetado com o nome, número de identificação e a data e hora da coleta. x O recipiente da amostra é colocado na bancada ou em uma incubadora (37 °C) enquanto o sêmen se liquefaz. x Anotar no relatório se a amostra está incompleta, especialmente se a primeira fração rica em espermatozoidespode estar faltando. Se a amostra estiver incompleta, uma segunda amostra deve ser coletada, novamente, após um período de abstinência de 2 a 7 dias. Quadro 2.1 Conformidade da compatibilidade dos recipientes de coleta de sêmen Selecionar várias amostras de sêmen com alta concentração de espermatozoides e boa motilidade espermática. Colocar metade de cada amostra em um recipiente que não seja tóxico (controle) e a outra metade no recipiente que está sendo testado. Avaliar a motilidade dos espermatozoides (ver Seção 2.5) em intervalos de uma hora por repetição à temperatura ambiente ou a 37 °C por 4 horas. Se não houver diferenças em cada ponto de tempo entre as avaliações de controle e teste (P> 0,05 em um teste t pareado), os recipientes do teste podem ser considerados não tóxicos para os espermatozoides e para atender aos requisitos de coleta de sêmen. 2.2.3 Coleta estéril de sêmen para reprodução assistida Isto é feito para a coleta de diagnóstico (veja a Seção 2.2.2), mas os recipientes de amostra, pontas de pipeta e pipetas para mistura devem estar estéreis. 2.2.4 Coleta estéril de sêmen para análise microbiológica Nesta situação, a contaminação microbiológica de fontes sem sêmen (por exemplo, organismos comensais da pele) deve ser evitada. Os recipientes de amostras, pontas de pipeta e pipetas para mistura devem estar estéreis. 10 O homem deve: x Urinar antes da coleta. x Lavar as mãos e o pênis com sabão, para reduzir o risco de contaminação da amostra com organismos comensais da pele. x Enxaguar o sabão. x Secar as mãos e o pênis com uma toalha descartável. x Ejacular em um recipiente estéril. Nota: O tempo entre a coleta da amostra de sêmen e o início da investigação pelo laboratório de microbiologia não deve exceder 3 horas. 2.2.5 Coleta de sêmen em casa x Uma amostra pode ser coletada em casa em circunstâncias excepcionais, como a incapacidade demonstrada de produzir uma amostra por masturbação na clínica ou a falta de instalações adequadas perto do laboratório. x O homem deve receber instruções claras, orais ou por escrito e faladas, sobre a coleta e o transporte da amostra de sêmen. As instruções devem enfatizar que a amostra de sêmen precisa ser completa, ou seja, que todo o ejaculado deve ser coletado, incluindo a primeira porção, rica em espermatozoides, e que o homem deve relatar qualquer perda de qualquer fração da amostra. Deve ser anotado no relatório se a amostra estiver incompleta. x O homem deve receber um recipiente pré-identificado, etiquetado com o seu nome e seu número de identificação. x O homem deve registrar o tempo de produção de sêmen e entregar a amostra ao laboratório dentro de 1 hora após a coleta. x Durante o transporte para o laboratório, a amostra deve ser mantida entre 20 °C e 37 °C. x O relatório deve mencionar que a amostra foi coletada em casa ou em outro local fora do laboratório. 2.2.6 Coleta de sêmen com preservativo x Uma amostra pode ser coletada em um preservativo durante a relação sexual somente em circunstâncias excepcionais, como a incapacidade demonstrada de produzir uma amostra por meio da masturbação. x Somente preservativos especiais não-tóxicos projetados para coleta de sêmen devem ser usados; tais preservativos estão disponíveis comercialmente. x O homem deve receber informações do fabricante sobre como usar o preservativo, fechá-lo e enviá-lo ou transportá-lo para o laboratório. x O homem deve registrar o tempo de produção de sêmen e entregar a amostra ao laboratório dentro de 1 hora após a coleta. 11 x Durante o transporte para o laboratório, a amostra deve ser mantida entre 20 °C e 37 °C. x O relatório deve mencionar que a amostra foi coletada por meio de um preservativo especial durante a relação sexual em casa ou em outro local fora do laboratório. Nota: Preservativos de látex comuns não devem ser usados para coleta de sêmen, pois contêm agentes que interferem na motilidade dos espermatozoides (Jones et al., 1986). Comentário 1: O coito interrompido não é um meio confiável de coleta de sêmen, pois a primeira porção do ejaculado, que contém o maior número de espermatozoides, pode ser perdida. Além disso, pode haver contaminação celular e bacteriológica da amostra e o baixo pH do fluido vaginal pode afetar adversamente a motilidade dos espermatozoides. Comentário 2: Se um homem não puder fornecer uma amostra de sêmen, o teste pós-coito (ver Seção 3.3.1) pode fornecer algumas informações sobre seus espermatozoides. 2.2.7 Manipulação segura de amostras As amostras de sêmen podem conter agentes infecciosos perigosos (por exemplo, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite ou vírus herpes simplex) e devem, portanto, ser tratadas como um risco biológico. Se a amostra for processada para estudo, inseminação intrauterina (IUI), fertilização in vitro (FIV) ou injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) (ver Seção 5.1) ou se a cultura de sêmen for realizada (ver Seção 2.2.4), materiais e técnicas estéreis devem ser usadas. As diretrizes de segurança, conforme descrito no Apêndice 2, devem ser estritamente seguidas; boas práticas de laboratório são fundamentais para a segurança laboratorial (OMS, 2004). 2.3 Exame macroscópico inicial A análise do sêmen deve começar com uma simples inspeção logo após a liquefação, preferencialmente em 30 minutos, mas não mais do que 1 hora após a ejaculação, para evitar que a desidratação ou mudanças na temperatura afetem a qualidade do sêmen. 2.3.1 Liquefação Imediatamente após a ejaculação no recipiente de coleta, o sêmen é tipicamente uma massa coagulada semissólida. Dentro de alguns minutos à temperatura ambiente, o sêmen geralmente começa a se liquefazer (tornar-se mais fino), momento em que uma mistura heterogênea de grumos será vista no fluido. À medida que a liquefação continua, o sêmen se torna mais homogêneo e bastante aguado e nos estágios finais apenas pequenas áreas de coagulação permanecem. A amostra faz, geralmente, liquefação completa em 15 minutos à temperatura ambiente, embora raramente possa levar até 60 minutos ou mais. Se a liquefação completa não ocorrer dentro de 60 minutos, deve ser registrado. Amostras de sêmen coletadas em casa, ou por preservativo, normalmente estarão liquefeitas quando chegarem ao laboratório. As amostras normais de sêmen liquefeito podem conter grânulos tipo gelatina (corpos gelatinosos) que não se liquefazem; estes não parecem ter qualquer significado clínico. A presença de cadeias de muco, no entanto, pode interferir na análise do sêmen. 12 Nota 1: A liquefação pode ser reconhecida macroscopicamente, conforme descrito acima, e microscopicamente. Os espermatozoides imobilizados ganham a capacidade de se mover à medida que o sêmen se liquefaz. Se os espermatozoides imobilizados são observados no exame microscópico, deve ser dado mais tempo para que o processo de liquefação seja concluído. Nota 2: Durante a liquefação, uma mistura suave e contínua ou a rotação do recipiente da amostra em um agitador bidimensional, seja à temperatura ambiente ou em uma incubadora ajustada a 37 °C, pode ajudar a produzir uma amostra homogênea. Nota 3: Se o sêmen não se liquefazer dentro de 30 minutos, não prossiga com a análise, aguarde mais 30 minutos. Se a liquefação não ocorreu dentro de 60 minutos, proceda como descrito na Seção 2.3.1.1. 2.3.1.1 Liquefação retardada Ocasionalmente, as amostras podem não se liquefazer, dificultando a avaliação do sêmen. Nesses casos, pode ser necessário tratamento adicional, mistura mecânica ou digestão enzimática. 1. Algumas amostras podem ser induzidas a liquefazer pela adição de um volume igual de meio fisiológico (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (Dulbecco); consulte o Apêndice 4, seção A4.2), seguido de pipetagem repetida. 2. A falta de homogeneidadepode ser reduzida pela passagem suave repetida (6–10 vezes) através de uma agulha de calibre 18 (diâmetro interno 0,84 mm) ou um cateter 19 (diâmetro interno 0,69 mm) ligado a uma seringa. 3. A digestão por bromelaína, uma enzima proteolítica de especificidade ampla (EC 3.4.22.32), pode ajudar a promover a liquefação (ver Quadro 2.2). Quadro 2.2 Preparação de bromelaína Preparar 10 UI/ml de bromelaína em solução salina tamponada com fosfato (Dulbecco) (ver apêndice 4, seção A4.2); é difícil dissolver, mas ao misturar a maioria deve dissolver-se dentro de 15 a 20 minutos. Diluir o sêmen 1 + 1 (1: 2) com 10 UI/ml de bromelaína, agitar com a ponta da pipeta e incubar a 37 °C por 10 minutos. Misturar bem a amostra antes de uma análise posterior. Comentário: Esses tratamentos podem afetar a bioquímica do plasma seminal, a motilidade dos espermatozoides e a morfologia espermática e seu uso deve ser registrado. A diluição 1 + 1 (1: 2) do sêmen com bromelaína deve ser contabilizada no cálculo da concentração de espermatozoides. 2.3.2 Viscosidade do sêmen Após a liquefação, a viscosidade da amostra pode ser estimada aspirando-a suavemente em uma pipeta descartável de plástico de diâmetro largo (aproximadamente 1,5 mm de diâmetro), permitindo que o sêmen caia pela gravidade e observando o comprimento de qualquer fio. Uma amostra normal deixa a pipeta em pequenas gotas discretas. Se a viscosidade for anormal, a queda formará um fio com mais de 2 cm de comprimento. 13 Alternativamente, a viscosidade pode ser avaliada introduzindo uma vareta de vidro na amostra e observando o comprimento do fio que se forma após a retirada da vareta. A viscosidade deve ser registrada como anormal quando o fio exceder 2 cm. Em contraste com uma amostra parcialmente não liquefeita, uma amostra de sêmen viscoso exibe aderência homogênea e sua consistência não irá mudar com o tempo. A alta viscosidade pode ser reconhecida pelas propriedades elásticas da amostra, que adere fortemente a si mesma quando são feitas tentativas para pipetá-la. Os métodos para reduzir a viscosidade são os mesmos que os da liquefação retardada (ver Seção 2.3.1.1). Comentário: A alta viscosidade pode interferir na determinação da motilidade dos espermatozoides, na concentração de espermatozoides, na detecção de espermatozoides revestidos com anticorpos e na medição de marcadores bioquímicos. 2.3.3 Aparência do ejaculado Uma amostra normal de sêmen liquefeito tem uma aparência homogênea, cinza e opalescente. Pode parecer menos opaco se a concentração de espermatozoides for muito baixa; a cor também pode ser diferente, isto é, marrom-avermelhada quando as células vermelhas do sangue estão presentes (hematospermia), ou amarela em um homem com icterícia ou tomando certas vitaminas ou drogas. 2.3.4 Volume do sêmen O volume do ejaculado é fornecido, principalmente, pelas vesículas seminais e a próstata, com uma pequena quantidade das glândulas bulbouretrais e epidídimos. A medição precisa do volume é essencial em qualquer avaliação do sêmen, pois permite calcular o número total de espermatozoides e células não espermáticas no ejaculado. O volume é medido de uma maneira mais precisa pela pesagem da amostra no recipiente em que é coletada. x Coletar a amostra em um recipiente descartável, limpo e pré-pesado. x Pesar o recipiente com sêmen nele. x Subtrair o peso do recipiente. x Calcular o volume a partir do peso da amostra, assumindo que a densidade do sêmen seja de 1 g/ml (Auger et al., 1995). A densidade do sêmen varia entre 1,043 e 1,102 g/ml (Huggins et al., 1942; Brazil et al., 2004a; Cooper et al., 2007). Nota: Recipientes de amostras vazios podem ter pesos diferentes, portanto cada recipiente deve ser previamente pesado individualmente. O peso pode ser registrado no recipiente antes de ser entregue ao cliente. Use uma caneta permanente no próprio recipiente ou em uma etiqueta. Se for usada uma etiqueta para registrar o peso, ela deve ser anexada antes que o recipiente vazio seja pesado. Alternativamente, o volume pode ser medido diretamente. x Coletar a amostra diretamente em um cilindro de medição de vidro graduado e modificado com uma boca larga. Estes podem ser obtidos comercialmente. 14 x Ler o volume diretamente das graduações (precisão de 0,1 ml). Nota: Medir o volume aspirando a amostra do recipiente em uma pipeta, ou seringa, ou decantando-a em um cilindro de medição, não é recomendado, porque nem toda a amostra será recuperada e, portanto, o volume será subestimado. O volume perdido pode ser entre 0,3 e 0,9 ml (Brazil et al., 2004a; Iwamoto et al., 2006; Cooper et al., 2007). Comentário 1: O baixo volume de sêmen é característico da obstrução do ducto ejaculatório ou da ausência congênita bilateral do ducto deferente (de la Taille et al., 1998; Daudin et al., 2000; Von Eckardstein et al., 2000; Weiske e cols., 2000), uma condição na qual as vesículas seminais também são pouco desenvolvidas. Comentário 2: O baixo volume de sêmen também pode ser o resultado de problemas de coleta (perda de uma fração do ejaculado), ejaculação retrógrada parcial ou deficiência androgênica. Comentário 3: O alto volume de sêmen pode refletir a exsudação ativa em casos de inflamação ativa dos órgãos acessórios. 2.3.4.1 Limite inferior de referência O limite inferior de referência para o volume de sêmen é de 1,5 ml (5º percentil, intervalo de confiança de 95% (IC) 1,4–1,7). 2.3.5 pH do sêmen O pH do sêmen reflete o balanço entre os valores de pH das diferentes secreções das glândulas acessórias, principalmente a secreção vesicular seminal alcalina e a secreção prostática ácida. O pH deve ser medido após a liquefação em um tempo uniforme, preferencialmente após 30 minutos, mas em qualquer caso dentro de 1 hora após a ejaculação, uma vez que é influenciado pela perda de CO2 que ocorre após a produção. Para amostras normais, deve ser utilizado papel de pH no intervalo de 6,0 a 10,0. x Misturar bem a amostra de sêmen (ver Quadro 2.3). x Espalhar uma gota de sêmen uniformemente sobre o papel de pH. x Aguardar que a cor da zona impregnada se torne uniforme (<30 segundos). x Comparar a cor com a faixa de calibração para ler o pH. Nota: A precisão do papel de pH deve ser verificada em relação aos padrões conhecidos. Para amostras viscosas, o pH de uma pequena alíquota de sêmen pode ser medido usando um medidor de pH usado para a medição de soluções viscosas. (Haugen & Grotmol, 1998). 2.3.5.1 Valores de referência Atualmente existem poucos valores de referência para o pH do sêmen de homens férteis. Na pendência de mais dados, este manual retém o valor de consenso de 7,2 como um valor limite mais baixo. Comentário 1: Se o pH for inferior a 7,0 em uma amostra de sêmen com baixo volume e baixo número de espermatozoides, pode haver obstrução do ducto ejaculatório ou ausência bilateral congênita do ducto deferente (de la Taille et al., 1998; Daudin e col., 2000; Von Eckardstein et al., 2000; Weiske e cols., 2000), uma condição na qual as vesículas seminais também são pouco desenvolvidas. 15 Comentário 2: O pH do sêmen aumenta com o tempo, à medida que o tamponamento natural diminui, então valores de pH altos fornecem pouca informação clinicamente útil. 2.4 Investigação microscópica inicial Um microscópio de contraste de fase é recomendado para todos os exames de preparações sem corante de sêmen fresco (consulte o Apêndice 3 para saber como configurar o microscópio). Um exame microscópico inicial da amostra envolve a varredura da preparação com uma ampliação total de 100 × (ou seja, uma combinação de uma lente objetiva × 10 com uma lente ocular 10 ×). Isso fornece uma visão geral da amostra, para revelar: x Formação de cordões mucosos; x Agregação ou aglutinação de espermatozoides; x A presença de células que não sejam espermatozoides,ex. células epiteliais, “células redondas” (leucócitos e células germinais imaturas) e cabeças ou caudas de esperma tosoides isolados. A preparação deve então ser observada com uma ampliação total de × 200 ou × 400 (ou seja, uma combinação de uma objetiva de × 20 ou de × 40 com uma ocular de × 10). Isso permite: x A avaliação da motilidade dos espermatozoides (ver Seção 2.5); x A determinação da diluição necessária para uma avaliação precisa do número de espermatozoides (ver Seção 2.8). 2.4.1 Mistura completa e amostragem representativa do sêmen A natureza do ejaculado liquefeito torna a tomada de uma amostra representativa de sêmen problemática para a análise. Se a amostra não estiver bem misturada, a análise de duas alíquotas separadas pode mostrar diferenças marcantes na motilidade, vitalidade, concentração e morfologia dos espermatozoides. Para ter certeza de obter dados reprodutíveis, a amostra deve ser cuidadosamente misturada antes que as alíquotas sejam tomadas para avaliação (ver Quadro 2.3) e os resultados para alíquotas replicadas devem concordar antes que os valores sejam aceitos. A concordância entre réplicas é determinada para os números de espermatozoides pela distribuição de Poisson (ver Quadros 2.7 e 2.10 e Tabelas 2.4 e 2.5) e para porcentagens pela distribuição binomial (ver Quadros 2.5 e 2.6 e Tabela 2.1). Quadro 2.3 Mistura completa de sêmen Antes de remover uma alíquota de sêmen para avaliação, misturar bem a amostra no recipiente original, mas não tão vigorosamente que sejam criadas bolhas de ar. Isto pode ser conseguido aspirando a amostra 10 vezes com uma pipeta descartável de diâmetro largo (aproximadamente 1,5 mm de diâmetro, estéril quando necessário). Não misturar com um misturador de vórtice em alta velocidade, pois isso danificará os espermatozoides. 2.4.2 Fazendo uma preparação úmida x Misturar bem a amostra de sêmen (ver Quadro 2.3). 16 x Remover uma alíquota de sêmen imediatamente após a mistura, não permitindo que os espermatozoides fiquem fora de suspensão. x Misturar novamente a amostra de sêmen antes de remover as alíquotas replicadas. O volume de sêmen e as dimensões da lamínula devem ser padronizados, para que as análises sejam realizadas em uma preparação de profundidade fixa de cerca de 20 µm (ver Quadro 2.4), que permite aos espermatozoides nadar livremente: x Colocar um volume padrão de sêmen, por ex. 10 µl, em uma lâmina de vidro limpo. x Cobrir com uma lamínula, por exemplo 22 mm × 22 mm para 10 µl, para fornecer uma câmara com aproximadamente 20 µm de profundidade (ver Caixa 2.4). O peso da lamela espalha a amostra. x Tomar cuidado para evitar a formação e aprisionamento de bolhas de ar entre a lamela e o escorregador. x Avaliar a preparação úmida, acabada de fazer, logo que o conteúdo já não esteja à deriva. Quadro 2.4 Profundidade das preparações úmidas A profundidade de uma preparação (D, µm) é obtida dividindo o volume da amostra (V, µl = mm3) pela área sobre a qual é espalhada (A, mm2): D = V/A. Assim, um volume de 10 µl de sêmen aplicado em um escorregador de vidro limpo e coberto com uma lamela de 22 mm x 22 mm (área 484 mm2) proporciona uma câmara com uma profundidade de 20,7 µm; uma amostra de 6,5 µl coberta com uma lamela de 18 mm × 18 mm (área 324 mm2) fornece uma profundidade de 20,1 µm; uma amostra de 11 µl coberta por uma lamela de 21 mm x 26 mm (área 546 mm2) fornece uma profundidade de 20,1 µm. Ocasionalmente, uma câmara mais profunda pode ser necessária: uma amostra de 40 µl coberta por uma lamela de 24 mm x 50 mm (área de 1200 mm2) fornece uma profundidade de 33,3 µm. Nota 1: Uma profundidade de câmara inferior a 20 µm restringe o movimento de rotação dos espermatozoides (Le Lannou et al., 1992; Kraemer et al., 1998). Nota 2: Se a câmara for muito profunda, será difícil avaliar os espermatozoides à medida que eles entram e saem do foco. Nota 3: Se o número de espermatozoides por campo visual varia consideravelmente, a amostra não é homogênea. Nestes casos, a amostra de sêmen deve ser novamente misturada (ver Caixa 2.3) e uma nova lâmina deve ser preparada. Nota 4: A falta de homogeneidade também pode resultar da consistência anormal, liquefação anormal (ver Seção 2.3.1), agregação de espermatozoides (ver Seção 2.4.3) ou aglutinação de espermatozoides (ver Seção 2.4.4). 2.4.3 Agregação de espermatozoides A aderência de espermatozoides imóveis entre si ou de espermatozoides móveis a cordões de muco, células não espermáticas ou detritos é considerada como agregação não específica (Fig. 2.2) e deve ser registrada como tal. Fig. 2.2 Agregação não específica de espermatozoides no sêmen Pontos de vista dos espermatozoides agregados com uma célula epitelial (a), detritos (b) ou espermatozoides (c, d). 17 Micrografias cortesia de C Brazil. 2.4.4 Aglutinação de espermatozoides A aglutinação refere-se especificamente a espermatozoides móveis colados uns aos outros, cabeça a cabeça, cauda a cauda ou de uma maneira mista. A motilidade é muitas vezes vigorosa com um movimento de agitação frenético, mas às vezes os espermatozoides estão tão aglutinados que seu movimento é limitado. Quaisquer espermatozoides móveis que se colem uns aos outros por suas cabeças, caudas ou peças intermediárias devem ser anotados. O tipo principal de aglutinação (refletindo o grau (graus 1-4) e o local do anexo (graus A – E) deve ser registrado (Rose et al., 1976) (ver Fig. 2.3): x Grau 1: isolado <10 espermatozoides por aglutinado, muitos livres x Grau 2: moderado 10–50 espermatozoides por aglutinado, livres x Grau 3: grande aglutinados de >50 espermatozoides, alguns ainda livres x Grau 4: grosso todos os espermatozoides aglutinados e grupos aglutinados interligados Nota: Os espermatozoides móveis presos às células, ou detritos, ou espermatozoides imóveis presos um ao outro (agregação) não devem ser classificados como aglutinação. 18 Fig. 2.3 Diagrama esquemático de diferentes extensões de aglutinação de espermatozoides Grau de aglutinação Partes envolvidas 1.Isolado (<10 espermatozoide s/grupo aglutinado, muitos espermatozoide s livres) 2.Moderado (10–50 espermatozoide s/grupo aglutinado, esperma livre) 3.Grande (> 50 espermatozoide s/grupo aglutinado, alguns espermatozoide s ainda estão livres) 4.Grosso (todos os espermatozoide s aglutinados e grupos aglutinados interligados) A. Cabeça a cabeça B. Cauda-a-cauda (cabeças são vistas livres e se movem sem aglutinar) C. Ponta da cauda à ponta da cauda D. Misturado (aglutinações cabeça-a-cabeça e cauda-a-cauda claras) E. Emaranhado (cabeças e caudas enredadas. As cabeças não estão livres de aglutinações, pois estão em aglutinação cauda-a-cauda) Reproduzido de Rose et al. (1976) com permissão de Wiley-Blackwell. Comentário 1: A presença de aglutinação não é evidência suficiente para deduzir uma causa imunológica de infertilidade, mas é sugestiva da presença de anticorpos antiespermatozoides; mais testes são necessários (ver Seção 2.20). Comentário 2: Aglutinação severa pode afetar a avaliação da motilidade e concentração espermática. 2.4.5 Elementos celulares não espermáticos 19 O ejaculado contém outras células além dos espermatozoides, algumas das quais podem ser clinicamente relevantes. Estes incluem células epiteliais do trato geniturinário, bem como leucócitos e células germinativas imaturas, as duas últimas coletivamente referidas como “células redondas” (Johanisson et al., 2000). Elas podem ser identificadas examinando um esfregaço corado em uma ampliação de × 1000 (consulte a Seção 2.12, as Placas 13 e 14 e a Seção 2.19). Essas células podem ser identificadas e quantificadas com maior precisão pela detecção da atividade da peroxidase (ver Seção 2.18) ou do antígeno CD45 (ver Seção 3.2). Sua concentraçãopode ser estimada utilizando-se da mesma técnica para a contagem dos espermatozoides, a partir de preparações úmidas (ver Seção 2.18.1.5) ou da razão entre essas células e o número de espermatozoides no esfregaço corado e na concentração espermática (ver Seção 2.12.1). 2.5 Motilidade espermática A extensão da motilidade espermática progressiva (ver Seção 2.5.1) está relacionada às taxas de gravidez (Jouannet et al., 1988; Larsen et al., 2000; Zinaman et al., 2000). Os métodos de avaliação da motilidade envolvendo análise de esperma assistida por computador (CASA) são descritos na Seção 3.5.2. A motilidade espermática no sêmen deve ser avaliada o mais rápido possível após a liquefação da amostra, preferencialmente aos 30 minutos, mas em qualquer caso dentro de 1 hora após a ejaculação, para limitar os efeitos deletérios da desidratação, pH ou mudanças de temperatura na motilidade. x Misturar bem a amostra de sêmen (ver Quadro 2.3). x Remover uma alíquota de sêmen imediatamente após a mistura, não permitindo que os espermatozoides fiquem fora de suspensão. x Misturar novamente a amostra de sêmen antes de remover a alíquota replicada. x Para cada réplica, preparar uma preparação úmida com aproximadamente 20 µm de profundidade (ver Seção 2.4.2). x Esperar a amostra parar de derivar (dentro de 60 segundos). x Examinar a lâmina com ótica de contraste de fase com ampliação de × 200 ou × 400. x Avaliar aproximadamente 200 espermatozoides por repetição para a porcentagem de diferentes categorias móveis. x Comparar os valores da réplica para verificar se eles estão bem próximos. Se assim for, continuar com os cálculos; se não, preparar novas amostras. Nota 1: O procedimento pode ser realizado à temperatura ambiente ou a 37 °C com um microscópio aquecido, mas deve ser padronizado para cada laboratório. Se a motilidade dos espermatozoides for avaliada a 37 °C, a amostra deve ser incubada a esta temperatura e a preparação feita com lâminas e lamínulas pré-aquecidas. Nota 2: Recomenda-se o uso de uma lente ocular com grade (ver Fig. 2.4a) para limitar a área visualizada. Isso permite que a mesma área da lâmina seja avaliada durante os dois estágios da pontuação. Avalie primeiro a motilidade progressiva, depois a motilidade e a imotilidade não progressivas (ver Seção 2.5.1). Limitar a área, e assim o número de espermatozoides avaliados, assegura que várias áreas da preparação sejam examinadas quanto à motilidade. 2.5.1 Categorias de movimento de esperma Recomenda-se um sistema simples de classificação da motilidade que distinga os espermatozoides com motilidade progressiva ou não progressiva daqueles que 20 são imóveis. A motilidade de cada espermatozoide é classificada da seguinte forma: x Motilidade progressiva (PR): espermatozoides que se movem ativamente, seja linearmente ou em um grande círculo, independentemente da velocidade. x Motilidade não progressiva (NP): todos os outros padrões de motilidade com ausência de progressão, ex. nadando em pequenos círculos, a força flagelar dificilmente deslocando a cabeça, ou quando somente uma batida flagelar pode ser observada. x Imotilidade (IM): sem movimento. Comentário 1: A edição anterior deste manual recomendava que os espermatozoides progressivamente móveis fossem classificados em rápidos ou lentos, com velocidade >25 µm/seg a 37 °C, definindo os espermatozoides “grau a”. No entanto, é difícil para os técnicos definirem a progressão para a frente com tanta exatidão sem viés (Cooper & Yeung, 2006). Comentário 2: Ao discutir a motilidade dos espermatozoides é importante especificar a motilidade total (PR + NP) ou a motilidade progressiva (PR). 2.5.2 Preparando e avaliando uma amostra para motilidade x Se a motilidade for avaliada a 37 °C, ligar o aquecedor de lâminas com 10 minutos de antecedência para permitir que a temperatura se estabilize. x Preparar uma preparação úmida de 20 µm de profundidade (ver Seção 2.4.2). x Examinar a lâmina com ótica de contraste de fase com ampliação de × 200 ou × 400. x Esperar a amostra parar de derivar. x Procurar espermatozoides em uma área de pelo menos 5 mm da borda da lamínula (ver Fig. 2.4b), para evitar a observação dos efeitos da secagem na motilidade. x Vasculhar sistematicamente a lâmina para evitar a exibição repetida da mesma área. Mudar os campos com frequência. Evitar escolher campos com base no número de espermatozoides móveis visto (a escolha do campo deve ser aleatória). x Começar a marcar um determinado campo em um instante aleatório. Não espere que os espermatozoides entrem no campo ou na grade para começar a pontuar. x Avaliar a motilidade de todos os espermatozoides dentro de uma área definida do campo. Isto se faz mais facilmente usando uma lente ocular (ver Fig. 2.4a). Selecionar a parte do campo ou grelha a ser pontuada a partir da concentração espermática, ou seja, marcar apenas a linha superior da grelha se a concentração de espermatozoides for alta; marcar toda a grelha se a concentração de espermatozoides for baixa. x Vasculhar e contar rapidamente para evitar superestimar o número de espermatozoides móveis. O objetivo é contar todos os espermatozoides móveis na seção da grade instantaneamente; evitar a contagem dos presentes inicialmente mais aqueles que nadam na seção da grade durante a pontuação, o que influenciaria o resultado em favor dos espermatozoides móveis. x Inicialmente, vasculhar a seção da grade que está sendo pontuada para as células PR (veja a Seção 2.5.1). Em seguida, contar os espermatozoides NP e finalmente os espermatozoides IM na mesma seção da grade. Com experiência, pode ser possível pontuar todas as três categorias de movimento de espermatozoides de uma vez só e marcar as maiores áreas da grade. 21 x Registrar o número de espermatozoides em cada categoria de mobilidade com o auxílio de um contador de laboratório. x Avaliar pelo menos 200 espermatozoides num total de pelo menos cinco campos em cada réplica, para obter um erro de amostragem aceitavelmente baixo (ver Quadro 2.5). x Calcular a porcentagem média e a diferença entre as duas porcentagens para o grau de motilidade mais frequente (PR, NP ou IM) nas preparações úmidas replicadas. x Determinar a aceitabilidade da diferença da Tabela 2.1 ou da Figura A7.2, Apêndice 7. (Em cada mostra, a diferença máxima entre duas porcentagens que se espera que ocorra em 95% das amostras é devido ao erro de amostragem isolado). x Se a diferença entre as porcentagens for aceitável, relatar a porcentagem média para cada grau de motilidade (PR, NP e IM). Se a diferença for muito alta, pegar duas novas alíquotas da amostra de sêmen, fazer duas novas preparações e repetir a avaliação (ver Quadro 2.6). x Relatar a porcentagem média de cada grau de motilidade para o número inteiro mais próximo. Nota 1: Avalie apenas os espermatozoides intactos (definidos como tendo uma cabeça e uma cauda; veja a Seção 2.7.3), uma vez que apenas os espermatozoides intactos são contados para a concentração espermática. Não conte cabeças de alfinete móveis. Nota 2: Se os espermatozoides estão sendo pontuados em dois estágios (ex. PR primeiro, seguido por NP e IM da mesma área) e uma contagem de 200 espermatozoides é alcançada antes que todas as categorias de motilidade daquela área tenham sido pontuadas, a contagem deve continuar além de 200 espermatozoides até que todas as categorias tenham sido contadas, a fim de evitar viés em relação à categoria de motilidade pontuada primeiro. Nota 3: É comum superestimar a motilidade dos espermatozoides, mas isso muitas vezes pode ser evitado invertendo a ordem da análise (NP e IM primeiro), usando uma lente ocular reticulada e estando ciente de, e evitando, na medida do possível, potenciais fontes de viés (veja a Seção 7.13.3). Nota 4: Em raras ocasiões, com amostras não homogêneas, até mesmo um terceiro conjunto de réplicas
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