METODOS DE COLETA

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MÉTODOS DE COLETA
METODOLOGIA DE ESTUDOS BIOLÓGICOS DO PLÂNCTON
1. Coleta de materiais aquáticos
		Quaisquer tipos de estudos biológicos iniciam-se por coleta de materiais e observação no campo, e a metodologia varia de acordo com o objetivo das pesquisas e objetos.
		Os objetivos podem contemplar: classificação sistemática, distribuição espacial e sazonal, biota e biótopo, produtividade primária e total, migração, hábito alimentar, reprodução, constituição populacional e muitos outros estudos.
		Nos estudos da comunidade aquática os habitats e seus ecossistemas específicos também constituem fatores importantes e limitantes, que podem ser considerados em quatro grandes modalidades, a saber: zonas litorâneas e estuarina; zona de grande concentração de algas superiores; zonas de arrecifes e de manguezais; e zona pelágica e de ressurgência.
2. Métodos de coleta para a captura de seres planctônicos
	2.1 Tipos de redes
		
		A rede de plâncton é o aparato mais usado para a coleta desses organismos. Apesar de existir algumas variações de pouca importância em termos de padronização, a rede consiste basicamente de um cone feito de seda (ou um material equivalente) com uma moldura em forma de anel ou arco para fixar 3 cordas de nylon (Figura 1).
Fig. 1 - Rede de Coleta
		As redes variam conforme os objetivos do estudo e podem ser dos tipos:
HENSEN net: para análise quantitativa do fitoplancton;
NANSEN net: para análise quantitativa do zooplancton;
INTERNATIONAL STANDARD net: para análise quali-quantitativa do zoo e fitoplancton;
KITAHARA net: para análise quantitativa do fitoplancton;
Para os estudos quantitativos empregam-se “closing net”, cuja boca pode ser fechada de acordo com a necessidade, ou ainda o tipo “flow meter”.
	2.2 Variações de malha e procedimentos de captura
		De acordo com os tipos de plâncton a serem coletados, as malhas das redes passam por uma seleção. Por exemplo, utilizam-se malhas de:
n( 20 – 25 (76-64N): microplancton;
n( 3 – 5 (333-282N): macroplancton;
n( 1 – 000 (417-102N): captura de larvas;
PVC (sampler): é utilizado para nanoplancton ou na coleta de plâncton, tendo em vista a avaliação da produtividade primária.
Quanto à coleta propriamente dita, realizam-se arrastos horizontais e verticais, imprimindo-se velocidades de arrasto de 1 – 2 nós e 0,5 – 1,0 m/s, respectivamente. Evidentemente, urge proceder à correção da profundidade do arrasto, conforme o ângulo formado pelo cabo de arrasto através do deslocamento da embarcação, provocado pela correnteza, como também o próprio propulsor, os ventos e a direção do arrasto em relação aos fatores acima mencionados. A fim de diminuir a margem de erro na profundidade do arrasto, causada pela inclinação do cabo e, também, para facilitar a chegada da rede de plâncton à profundidade desejada, pode-se utilizar o “depressor”.
		Recentemente, para a análise do plâncton tem-se utilizado as fotografias tiradas pelo LAND-SAT na detecção da área e direção do deslocamento da maré vermelha ou área de poluição, por exemplo. No entanto, as informações do LAND-SAT são limitadas extremamente à superfície da água. Os materiais coletados são adequadamente acompanhados de registros de dados de coleta e transportados para o laboratório fixados em formol neutro 3-5%.
	2.3 Garrafas e bombas
	2.3.1 Garrafa de Van Dorn
Os frascos coletores são recipientes geralmente cilíndricos (Fig. 2) que se introduzem em posição vertical ou horizontal até a profundidade onde se deseja tomar a amostra. Uma vez ali, se aciona um mecanismo de fecho por meio de um mensageiro. As tampas das extremidades do cilindro se fecham rapidamente e o volume de água fechado no recipiente é levado à superfície sem misturar-se com água de outras profundidades.
- vantagens: sua maior vantagem baseia-se, na captura eficiente das formas mais pequenas do plâncton, pelo qual são insubstituíveis nos estudos quantitativos do fitoplancton e recomendáveis na coleta de outras variedades diminutas, como protozoários e rotíferos. São, alem do mais, aparelhos relativamente simples e fáceis de manusear. Fabricam-se em uma grande variedade de formas, tamanhos e materiais de modo que não é difícil escolher o modelo adequado a cada situação.
- desvantagens: seu volume reduzido – usualmente de 2 a 6 litros – constitui sua maior limitação dada a distribuição não homogênea do plâncton. Quando a população é pouco densa, o volume da amostra deve ser muito grande. Outra desvantagem é que os animais de movimentos rápidos tendem a escapar, por ser uma coleta não muito definida. Este escape pode ser em parte mediante o uso de coletores transparentes. As garrafas somente permitem obter amostras locais; é preciso tomar um grande número delas se deseja uma amostra integrada no perfil vertical. Em tal caso, as amostras são representativas de um ponto muito limitado no lago e a maioria das vezes não revelam muito do lago em sua totalidade. Estas garrafas não podem ser muito longas e nem muito larga. Recomenda-se o seu uso em regiões litorâneas com vegetação abundante.
2.3.2 Bombas
Em suas duas versões (mecânica ou elétrica) tem a vantagem de permitir a extração de um grande volume de água em um tempo hábil. Além do mais, permitem obter amostras integradas quando são deslocadas verticalmente a velocidade constante, ou amostras locais, mesmo que a forca da sucção rasgue a estratificação localmente. Para a maior eficiência de captura tem que tomar certas precauções: agrega-se um funil largo no extremo da mangueira para facilitar a coleta de animais que tendem escapar do campo da sucção. A bomba deve ser peristáltica ou centrifuga a fim de evitar que os organismos frágeis se danifiquem. Por último entre uma tomada de amostra e a seguinte é indispensável expulsar toda a água que resta na mangueira.
A B
Figura 2 – Coletor transparente (A) e armadilha (B).
Qualquer que seja o método de amostragem que se utiliza é necessário estimar seu erro para tratar de minimiza-lo, sem que ele implique um investimento exagerado de tempo e trabalho na amostra. Nunca se observam distribuições comparáveis com uma distribuição normal ou ao acaso.
3. Avaliação da transparência da água (importância do disco de Secchi)
Do ponto de vista ótico, a transparência da água pode ser considerada o oposto da turbidez. Sua avaliação de maneira mais simples é feita através de um disco branco de 20 a 30 cm de diâmetro, denominado disco de Secchi. Este disco foi introduzido em estudos limnologicos pelo padre italiano Ângelo Secchi, em 1886. o disco de Secchi destina-se à medida visula da transparência da água. Esta medida é obtida mergulhando-se o disco branco no lado da sombra do barco, através de uma corda marcada. De preferência, usa-se discos com quadrantes pintados de preto, que facilita a leitura ou melhora a visualização da cor branca na água. A profundidade de desaparecimento do disco de Secchi é inversamente proporcional à quantidade de compostos orgânicos e inorgânicos no caminho ótico. Em outras palavras, a profundidade de desaparecimento do disco de Secchi corresponde àquela profundidade na qual a radiação de 400-740 (m, portanto a faixa visível, refletida obtida (em metros) é denominada transparência de disco de Secchi.
Os valores obtidos para a profundidade de disco de Secchi em lagos de águas claras são mais reais, visto que nestas condições ocorre pouca dispersão da radiação, conseqüentemente a radiação refletida a partir da superfície do disco é em grande parte captada pelo olho do observador (Figura 3). Por outro lado, nos lagos com alta concentração de compostos dissolvidos e particulados, ocorre forte dispersão da radiação. Nestas condições podem ocorrer três fenômenos principais:
a) Parte da radiação que incidiria no disco é dispersa, saindo do caminho ético do observador, não sendo envolvida,portanto, no processo de observação;
b) parte da radiação que é refletida a partir do disco é dispersa, não retornando pelo caminho ótico do observador;
c) radiações dispersas, fora do caminho ótico original, atingem este caminho, passando a ser envolvidas no processo de observação.
Como resultado observa-se freqüentemente em lagos túrbidos, a subestimação dos valores do disco de Secchi, ou seja, a superestimação de k.
Os melhores resultados são obtidos quando se mergulha o disco de Sechhi (entre as 10:00hs e 14:00hs), procedendo-se da seguinte maneira: anota-se a profundidade do seu desaparecimento, deixa-se afundar mais alguns centímetros (em lagos profundos até cerca de um metro) e levanta-se o disco vagarosamente, até o seu ressurgimento e anotando-se a segunda profundidade. A média das duas medidas corresponde à profundidade do disco de Secchi. Muitos pesquisadores, para eliminar as distorções provocadas pela radiação refletida da superfície da água, utilizam tubos cilíndricos com uma lâmina de vidro na extremidade inferior, que é mergulhada na subsuperfície, através da qual se faz a visualização e a leitura.
A utilização do disco de Secchi em Limnologia é muitas vezes criticada. No entanto, considerando sua simplicidade de utilização; custo reduzido, facilidade de transporte e, sobretudo o número de informações que se pode extrair a partir dos valores de profundidade do disco de Secchi, além do fato de que por ser ainda utilizado quase universalmente, possibilitando comparações, é um instrumento indispensável em estudos limnológicos. Outro fator a considerar é o de que em muitos países o disco de Secchi já é utilizado há muitas décadas no mesmo ecossistema, o que possibilita não só avaliar a evolução da transparência da água, como também inferir sobre fenômenos ligada à biologia, à física e química do ambiente, como por exemplo, a eutrofização.
Fig. 3 – Implicações óticas da medida de profundidade do disco de Secchi, em dois ambientes diferenciados quando a concentração de compostos suspensos. 
4. Técnicas de conservação e preservação do material coletado
	4.1 Fitoplancton
 
a) Solução de Lugol – prepare uma solução com 200g de KI, 100g de I2, 200 ml de H2O e 190 ml de ácido acético glacial. Adicione 10 gotas da solução para cada 200 ml de amostra de fitoplancton.
b) Solução de Transeau – prepare uma solução com 6 partes de H2O, 3 partes de álcool etílico 95% e uma parte de formalina. Usar na proporção de 1 parte da solução para 1 parte de plâncton. A adição de sulfato de cobre (na proporção de 4% aproximadamente) permite a preservação da cor verde por mais tempo. Pode-se também adicionar gotas de glicerina pura para diminuir a evaporação.
	4.2 Zooplancton
a) Formalina – dilua a formalina concentrada (formaldeído 40%) até obter uma solução com aproximadamente 4 a 5% (formaldeído 2%). Usar numa proporção de 1 parte de plâncton para 9 partes de solução.
Obs: os esqueletos calcários podem ser rapidamente dissolvidos se a solução não estiver neutralizada.
b) Formalina neutralizada com bórax – adicione 30 g de tetraborato de sódio ou bórax (Na2B4O7 . 10 H2O) ao formaldeído de 11 a 40%. Dilua essa solução estoque para obter 4 a 5% e use 9 partes do preservativo para 1 parte de plâncton.
c) Formalina neutralizada com hexamina – prepare uma solução estoque de formaldeído 40% supersaturado com hexamina (hexametil-tetramina); isso requer aproximadamente 200 g de hexamina/litro de formaldeído. Para usar, dilua a solução estoque para 4 a 5% e adicione à amostra de plâncton numa proporção de 9 partes do preservativo para 1 parte de biomassa.
5 . Métodos de avaliação da biomassa 
	5.1 Avaliação da biomassa
A análise quantitativa do fitoplancton tem sido uma das principais dificuldades no estudo desta comunidade. Daí a grande atenção que este problema tem merecido de vários pesquisadores, desde o início deste século.
Para a estimativa da biomassa fitoplanctonica, inúmeros métodos foram desenvolvidos, sendo que nenhum dos disponíveis hoje, pode ser utilizado indistintamente para todos os tipos de organismos fitoplanctonicos.
	5.2 Contagem de organismos
a) Filtração – este método constata da filtração de um volume conhecido de amostra através de uma membrana de 0,45 (m de porosidade. Esta filtração deve ocorrer sob pressão que deve variar de 1/3 a ½ atmosfera. Após uma série de tratamentos químicos com etanol, creosoto e metoxibenzeno a amostra pode ser contada, sob microscópico.
b) Contagem eletrônica – através de um contador de partículas, a biomassa do fitoplancton pode ser avaliada. O aparelho baseia-se no movimento de partículas dentro de um campo elétrico. Assim, qualquer alteração, provocada por partículas quando passam através de uma abertura é registrada automaticamente. A grande desvantagem deste método é a não diferenciação entre os detritos (orgânicos e inorgânicos) e as células vivas. Este método é mais comumente usado para contagem de algas cultivadas em laboratório.
c) Fluorescência – este método tem sido utilizado para a avaliação da biomassa do bacterioplancton. Sua principal vantagem é a pronta distinção entre material vivo e morto. O alto custo de aquisição do microscópico de fluorescência é um dos principais fatores limitantes ao seu uso.
d) Câmara Sedgwick-Rafter – estas câmaras possibilitam rápidas contagens dos organismos fitoplanctônicos, especialmente os maiores do que 50 (m. a utilização deste método para contagem do nanoplancton não é recomendada.
e) Sedimentação em câmaras – para a utilização deste método é necessário o chamado microscópico “invertido”. Este método é mais adequado para o fitoplancton de tamanho intermediário. Para a contagem, a amostra é colocada em câmaras de sedimentação, cujo volume é função da concentração da amostra. Este método é um dos mais recomendados para quantificação do fitoplancton total, ainda que se torne problemático para águas com baixas densidades fitoplanctônicas e, ao mesmo tempo, com detritos orgânicos e inorgânicos em abundancia como é o caso de grande parte das águas interiores brasileiras.
	5.3 Volume de organismos (biovolume)
Muitos autores preferem expressar a biomassa como unidade de volume por litro (mm3/l). este critério tem a vantagem sobre a biomassa expressa em numero de organismos por litro, porque leva em consideração o tamanho do organismo, que no caso do fitoplancton varia grandemente. Este método torna, desta maneira, os resultados mais comparáveis. Em geral, as medidas dos volumes são feitas através da utilização de formulas geométricas mais próxima: esfera, cone, cilindro, etc. ou uma combinação destas formas.
	
5.4 Composição química
A composição química do fitoplancton é determinada após a concentração de volumes conhecidos de amostras, por centrifugação, filtração ou outras técnicas disponíveis. Os componentes mais freqüentemente analisados são: carbono, nitrogênio e fósforo.
	5.5 Peso seco e teor de matéria orgânica 
Este método consiste na determinação de peso seco do fitoplancton, contido em um volume conhecido de amostra e sua posterior incineração em altas temperaturas para a determinação do teor de matéria orgânica. Um dos métodos mais utilizados para a determinação do peso é a passagem da amostra em filtros de fibra de vidro previamente incinerados e peados. Após a filtragem o material é seco (105(C) e a biomassa é determinada por diferença de peso. A desvantagem deste método é que o material inorgânico é incluído na determinação. Após a determinação do peso seco a mesma amostra pode ser incinerada (550(C) para a determinação de matéria orgânica.
	5.6 Pigmentos (clorofila e feopigmentos)
Sendo a clorofila um dos principais responsáveis pela fotossíntese, o conhecimento de sua concentração pode dar indicações da biomassa do fitoplancton. Nos últimos anos, tem se tornado cada vez mais freqüente a utilização da concentraçãode clorofila para expressar a biomassa fotoplanctonica. Para tal, têm sido utilizados aparelhos modernos, como espectrofotômetro e fluorímetros. Para a determinação, filtra-se um volume conhecido de amostras sobre filtros especiais e a extração é feita por meio de solventes orgânicos como acetona, metanol ou éter. Após a leitura da densidade final a partir de formulas. Freqüentemente, determina-se a concentração das clorofilas a, b, c e feopigmentos (produtos de degradação da clorofila) na mesma solução, utilizando-se para tanto comprimentos de ondas específicos.
	5.7 Trifosfato de adenosina (ATP)
Este método tem uma grande vantagem sobre os demais, pois se baseia somente na presença de organismos vivos. Desta maneira evita-se superestimação dos valores de biomassa devido à inclusão de detritos. A determinação da biomassa através do ATP é ainda pouco usada, possivelmente por não ser um método de rotina fácil, além de apresentar elevado custo.
5.8 Técnicas para preparação de lâminas
Para o estudo da maioria do fitoplancton; o microscópio deve compor de uma ocular 10x e objetivas de 10x e 43x. formas maiores semelhantes a um zooplancton são melhores estudados em uma lupa. Para os dois tipos de aparelho a iluminação artificial deve ser feita com lâmpadas que emitem a luz natural e com um filtro azul. 
O uso de lâminas e lamínulas é imprescindível para o estudo do plâncton. Com o auxilio de uma pipeta de Pasteur, o material pode ser coletado da amostra e levado para a análise. No caso do zooplancton, a placa de petri inicialmente ajuda na identificação primária, seguido de uma análise mais aprofundada ao microscópio.
LAGO COM ÁGUA CLARA
- atenuação devido principalmente a absorção.
- dispersão muito reduzida.
- valor da prof. do disco de Secchi mais real.
LAGO COM ÁGUA TÚRBIDA
- atenuação devido a absorção e principalmente a dispersão.
- dispersão muito intensa.
- valor da prof. do disco de Secchi geralmente subetimado (k superestimado).
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