analises e soluções de problemas em cromatografia liquida

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16/05/2018
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Universidade Estadual de Campinas
Instituto de Química
Departamento de Química Analítica
Profa. Alessandra Sussulini
E-mail: sussulini@iqm.unicamp.br
Sala E-208
ANÁLISES E SOLUÇÕES DE PROBLEMAS 
EM CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
QP 216 – Técnicas Cromatográficas e 
Eletroforéticas
Cromatograma
Composto A
Composto B
Composto C
Tempo após injeção
Picos cromatográficos
Injeção da amostra 
na coluna
tR: Tempo de retenção 
(tempo entre injeção da amostra e saída do composto do sistema)
tM: Tempo morto
(tempo que um composto não retido pela coluna leva para percorrê-la)
t'R: Tempo de retenção ajustado 
(tempo que as moléculas do composto ficam retidas na FE)
Cromatograma Cromatograma
Altura do 
pico A
Área do 
pico C
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Identificação individual das 
espécies contidas na amostra
Determinação da identidade da 
amostra propriamente dita
Fontes de Informações Qualitativas:
RETENÇÃO: Uso de dados de tempo de retenção
de um analito para sua identificação (t’R)
DETECÇÃO: Detectores que fornecem
informações estruturais sobre as substâncias
eluídas (MS)
Análise Qualitativa
1. Usando tempo de retenção relativo (t’R):
Comparação de cromatogramas da amostra e 
de uma solução padrão do analito suspeito
AMOSTRA PADRÃO
Análise Qualitativa
Identificação por t’R é pouco confiável:
 Dependência com parâmetros instrumentais: Variações
nestas condições afetam sensivelmente os t’R
 Sobrecarga na coluna: Aumento excessivo na massa de
material eluído deforma o pico cromatográfico e altera o
seu t’R
Análise Qualitativa
M
A
S
S
A
Saturação da coluna 
cromatográfica com aumento 
de massa eluída provoca 
cauda frontal no pico
Amostra complexa: incerteza 
nos t’R medidos pode levar a 
identificação errônea
Comparação com 
cromatograma da 
amostra dopada 
permite identificação 
mais confiável
Análise Qualitativa
2. Co-cromatografia com padrões (spiking):
Comparação de t’R da amostra dopada com o 
analito suspeito
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 Detecção por Espectrometria de Massas (MS)
 Detecção Espectrométrica por Absorção no 
Infravermelho (IR)
Identificação muito confiável quando combinada a 
técnicas de identificação baseadas em retenção
Análise Qualitativa
3. Técnicas auxiliares:
Métodos de detecção que fornecem informações 
qualitativas sobre os analitos eluídos
Análise Qualitativa usando MS
TEMPO
C
O
N
T
A
G
E
N
S
 (
ío
n
s
 t
o
ta
is
)
MASSA / CARGA
A
B
U
N
D
Â
N
C
IA
1 Seleção manual ou automática do espectro de 
massas correspondente a um eluato
2 Interpretação manual do espectro e/ou 
comparação automática com biblioteca de 
espectros padrão do equipamento ou bancos 
de dados livres
Análise Qualitativa usando MS
Busca automática em bibliotecas de espectros: comparação 
estatística
BIBLIOTECA DE
ESPECTROS
ESPECTRO
DESCONHECIDO
Lista com possíveis 
candidatos
LIMITAÇÕES
Identificação pouco confiável de espectros muito simples
Limitada pelo tamanho da base de dados
Diferenças entre espectros gerados por diferentes equipamentos
Análise Qualitativa usando MS
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Análise Qualitativa usando MS Análise Quantitativa
O tamanho de um pico é proporcional à quantidade 
de material referente ao pico
Tamanho do pico
Altura do pico
Área do pico
 Modo manual mais simples e fácil de medir o tamanho de um pico
 Altura do pico é menos sujeita à interferência de picos com baixa resolução
 Não considera a largura do pico: exigência de maior precisão das variáveis
instrumentais e do método
 Problemas com picos assimétricos
Análise Quantitativa
Altura do pico
Análise Quantitativa
 Menos influenciável por parâmetros cromatográficos e instrumentais
 Erros menores para picos assimétricos
Requer 
estabelecimento 
apropriado dos 
limites de integração
Área do pico
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A altura ou área do pico é uma resposta obtida em 
função do sinal do detector
Relacionar com a concentração ou massa do analito
Necessidade de realizar calibração
Normalização 
das áreas dos 
picos
Padrão externo Padrão interno
Adição de 
padrão
CURVAS ANALÍTICAS
Análise Quantitativa
Normalização das áreas dos picos
Não é 
realmente um 
método de 
calibração
Não há comparação 
com quantidades 
conhecidas do material
Aplicada para estimar 
as impurezas ou a 
degradação de um 
material puro
Assume-se que o fator de resposta do detector é o mesmo 
para todos os picos cromatográficos
Análise Quantitativa
Todo composto produz um pico 
e a resposta do detector 
depende somente da 
concentração do composto
1. Padronização externa
Compara a área do pico do analito de interesse com as áreas 
obtidas a partir de soluções preparadas com padrões
Fontes de erros: preparo das amostras e das 
soluções padrão ou problemas de injeção
A faixa de concentração dos padrões deve estar no mesmo 
nível de concentração que as amostras
Análise das amostras devem ser realizadas em condições 
exatamente iguais aos padrões 
A concentração do analito na amostra real é encontrada pela 
equação da reta:
y = bx + a
Análise Quantitativa
1. Padronização externa
Análise Quantitativa
Determinação simultânea de 4 fármacos por RP-HPLC-DAD
A
B
C
D
Dewani et al., Arab. J. Chem. 7 (2014) 811-816
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2. Padronização interna
Padrão interno (P.I.): Composto similar ao analito, inerte a 
qualquer componente da amostra, puro, ausente na 
amostra, bem resolvido do restante dos picos 
Vantagens:
• Pequenas mudanças no sistema não 
alteram o resultado
• Ideal para compensar perdas de 
amostra
• Maior confiabilidade dos resultados
A adição de P.I. compensa variações instrumentais e é adequada 
para análises de amostras que são extensivamente preparadas
Adiciona-se concentrações iguais do P.I. a diferentes 
concentrações do padrão do analito: Aanalito/AP.I. x Canalito
Adiciona-se a mesma concentração de P.I. à amostra real
Desvantagens:
• Preparo das soluções e amostras 
trabalhoso
• A seleção do P.I. em amostras 
complexas pode ser difícil
Análise Quantitativa
Antes da adição do PI Após a adição do PI
Analito de interesse  Padrão interno 
Análise Quantitativa
2. Padronização interna
2. Padronização interna
Análise Quantitativa
Análise de levodopa em plasma humano por RP-HPLC-MS
Amostra de paciente 
que ingeriu levodopa
(analito)
Amostra de paciente 
que ingeriu 
carbidopa (P.I.)
Martins et al., Química Nova 36 (2013) 171-176. 
Um padrão de calibração deve ser idealmente 
preparado na matriz da amostra (branco)
Calibração por adição de padrão:
A amostra é fortificada com diferentes 
concentrações de padrão: extrapolando a curva 
para o eixo x, encontra-se a concentração 
original do analito na amostra
Nem sempre é possível preparar um solução representativa em 
uma matriz que não contenha o analito de interesse
Análise Quantitativa
3. Adição de Padrão
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Análise do ácido 5-hidroxi-indol-acético em fluido cérebro 
espinhal humano por RP-HPLC-DAD
5HIAA,
metabólito da 
serotonina (um 
neurotransmissor)
Análise Quantitativa
3. Adição de Padrão Quantificação de biomoléculas por SRM:
Seleção da 
molécula
Fragmentação Seleção do 
fragmento
Experimento SRM:
1. Escolher a molécula de interesse (alta intensidade no espectro de massa)
2. Escolher o fragmento predominante da molécula de interesse (transição íon
precursor íon fragmento) – transição de quantificação
3. Otimizar parâmetros de MS (ex. gás de colisão) paramaximizar sinal
4. Validar experimento: confirmar identidade da molécula por MS/MS –
transição de confirmação
Análise Quantitativa usando MS
Quantificação de biomoléculas por SRM:
Waters Corp.
Análise Quantitativa usando MS
Quantificação de biomoléculas por SRM:
 Método extremamente seletivo (escolha adequada dos 
fragmentos) e sensível
 Informações: m/z do precursor, m/z de pelo menos 2 
fragmentos, tempo de retenção (LC-MS/MS)
 Padrão interno é necessário (efeitos de supressão iônica, 
variações instrumentais – LC)
 Padrão interno: composto marcado isotopicamente ou 
similar ao analito, com tempo de retenção próximo
Análise Quantitativa usando MS
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 Lavar um sistema com tampão usando solvente orgânico
puro: precipitação
 Injetar amostras que podem precipitar na fase móvel:
testar miscibilidade
 Usar HCl, H2SO4 ou CHCl3 degradado em sistema de aço
inox: corrosão do sistema
 Deixar a bomba trabalhar seca: danificação dos selos
Dicas: o que não fazer em HPLC Dicas: o que não fazer em HPLC
 Usar fita de Teflon para vedar conexões: sem efeito e
pode causar entupimento
 Deixar o sistema parado com fase móvel contendo
tampão ou ácidos/bases fortes: cristalização =
danificação dos selos da bomba, injetor, entupimento do
detector
RUÍDO E DESVIO DA LINHA DE BASE
Desvio ou deriva (drift): Resulta de alterações na linha de base. Tem
frequências muito superiores às dos picos em análise. Normalmente
associado ao aquecimento do detector na 1ª hora ou mudanças na
temperatura, sujeira na cela de detecção, degradação da fase móvel
Ruído (noise): é a variação mais curta da linha de base de uma linha
reta causada pelas flutuações dos sinais elétricos, instabilidade da
lâmpada, flutuações da temperatura. NA PRÁTICA: qualquer
perturbação na saída do detector que não esteja relacionada ao
soluto eluído
Problemas em HPLC
TIPOS GERAIS DE RUÍDOS E CAUSAS TÍPICAS
Problemas em HPLC
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Problemas com formato de pico
A – Interação com silanóis livres 
B – Complexação com íons metálicos na FE
C – pH da fase móvel inadequado
D – Entupimento de filtro 
1. Utilizar FE a base de sílica de alta
pureza
2. Empregar aditivo básico na FM (ex.
TEA) – não é necessário quando se
utilizada FE de alta pureza
1. Diminuir o pH da fase móvel para
suprimir a ionização dos silanois
2. Aumentar a concentração do tampão
1. Retirar o filtro e deixar no ultrassom
com metanol para limpeza
2. Trocar o filtro
CAUDA
Problemas em HPLC
E – Espaços vazios na coluna 
F – Volume morto excessivo 
1. Trocar a coluna
1. Minimizar o número de conexões
2. Empregar tubos de conexão mais
curtos ou de < d.i.
3. Checar a vedação de todas as
conexões
Problemas em HPLC
CAUDA
PICOS DUPLOS
A – Contaminação na coluna de 
guarda ou na coluna analítica
B – Entupimento de filtro
1. Remover a coluna de guarda e
proceder a análise – trocar a
coluna de guarda
2. Para contaminantes fortemente
retidos, tentar o procedimento de
recuperação
3. Trocar a coluna
1. Retirar o filtro e deixar no
ultrassom com metanol para
limpeza
2. Trocar o filtro
Problemas em HPLC
PICOS DUPLOS
C – Solvente da amostra 
incompatível com a FM
D – Eluição simultânea de 
um segundo composto
E – Coluna sobrecarregada
1. Injetar a amostra na fase móvel
1. Empregar procedimentos de
clean up da amostra antes da
injeção
2. Alterar a seletividade a partir de
mudanças na fase móvel ou
emprego de outra FE
1. Empregar FE com maior
capacidade de amostra
2. Aumentar o diâmetro da coluna
3. Diminuir a quantidade de amostra
Problemas em HPLC
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A – Formação de canais na coluna
(caminhos preferenciais)
B – Coluna sobrecarregada 
C – Solvente da amostra 
incompatível com a FM
D – Baixa temperatura
1. Trocar a coluna
2. Utilizar a coluna dentro dos
limites de pH recomendados
1. Injetar volumes menores ou
amostras mais diluídas;
2. Empregar FE com maior
capacidade de amostra
1. Injetar a amostra na fase móvel
1. Aumentar a temperatura da
coluna
CAUDA FRONTAL
Problemas em HPLC
Problemas com mudanças na retenção
Diminuição dos tempos de retenção
A – Perda de fase estacionária ligada
B – Grupos ativos na FE
C – Aumento da vazão
D – Coluna sobrecarregada 
1. Trocar a coluna
2. Trabalhar em pH 2-8 para colunas
de fase reversa a base de sílica
1. Empregar modificadores orgânicos
na fase móvel
2. Aumentar a força do tampão
1. Verificar e ajustar a vazão da
bomba
1. Reduzir a quantidade de amostra
injetada
2. Empregar colunas com diâmetro
interno maior
Problemas em HPLC
A – Alteração na composição da FM
B – Perda de fase estacionária ligada
C – Diminuição da vazão
D – Bolha na fase móvel
1. Manter os reservatórios de
solvente tampados
2. Preparar fase móvel nova
1. Trocar a coluna
1. Verificar e ajustar a vazão da
bomba
2. Verificar se existem vazamentos
no sistema, inclusive nos selos
das bombas
1. Verificar a vazão e pressão
2. Desgaseificar a fase móvel
Aumento dos tempos de retenção
Problemas em HPLC
A – Condicionamento insuficiente
B – Alteração na composição da 
fase móvel
C – Capacidade tamponante
insuficiente
D – Flutuação na temperatura da
coluna
1. Equilibrar a coluna por mais tempo
entre as análises
1. Verificar o preparo da fase móvel e
preparar uma nova se necessário
2. Verificar a precisão da válvula de
gradiente
1. Empregar concentrações de tampão
maiores de 20 mmol/L
1. Manter a temperatura ambiente
constante
2. Manter a temperatura da coluna
constante
Flutuação dos tempos de retenção
Problemas em HPLC
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Problemas com picos fantasma ou artefatos
Picos fantasmas
A – Contaminação na coluna ou no injetor
B – Eluição tardia de pico da 
injeção anterior
C – Água contaminada em FR
D – Interferentes desconhecidos 
na amostra 
1. Empregar apenas solventes de
grau HPLC
2. Lavar a coluna para remover
impurezas
3. Limpar o injetor entre as
análises
1. Aumentar o tempo de corrida
2. Lavar a coluna com FM forte ao
final de cada análise
3. Gradiente: terminar em
concentração mais alta
1. Empregar água de grau HPLC
1. Fazer o clean up da amostra
Problemas em HPLC
A – Índice de refração do soluto 
menor que o da FM (para 
detector por índice de refração)
B – Absorção do soluto menor 
que a da FM (detector UV)
C – Solvente da amostra FM
têm composições diferentes
1. Empregar fase móvel com índice de
refração menor
2. Inverter a polaridade do detector para
obter picos positivos
1. Alterar o comprimento de onda de
leitura
2. Empregar fase móvel com menor
absorção no UV
1. Mudar o solvente da amostra e
dissolver e amostra na fase móvel se
possível
Picos negativos
Problemas em HPLC
Spikes
A – Bolhas na fase móvel
B – Coluna guardada sem
as tampas
1. Desgaseificar a fase móvel
2. Instalar restritor de pressão na saída
para o detector
3. Verificar a vedação das conexões
1. Guardar as colunas com as tampas
2. Lavar as colunas de FR com
metanol desgaseificado
Problemas em HPLC
A – Ajuste errado da bomba
B – Normal do sistema 
C – Temperatura muito baixa
D – Desgaste da coluna
1. Verificar e corrigir o valor
Aumento normal de pressão é:
1. Mudança para uma coluna mais longa
2. Mudança para partículas menores
3. Mudança para diâmetros menores
4. Aumento da vazão caso não sejam
feitas outras mudanças
1. Ajustar a temperatura do forno da
coluna
1. Aumento gradual na pressão é normal
quando se ultrapassa o tempo de vidada coluna
Pressão elevada
Problemas em HPLC
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E – Entupimento dos filtros da coluna
F – Entupimento da coluna de guarda
G – Entupimento do sistema
H – Precipitação de tampão 
1. Lavar ou trocar o filtro
2. Centrifugar ou filtrar as amostras
3. Empregar colunas de guarda
1. Trocar a coluna de guarda com
maior frequência
1. Verificar o sistema para
encontrar o entupimento
1. Lavar a coluna com água
2. Rever as condições de análise
Problemas em HPLC
A – Vazamento no sistema
B – Temperatura da coluna 
muito elevada
C – Vazão muito lenta 
1. Localizar e corrigir o vazamento
1. Abaixar a temperatura
1. Aumentar a vazão
Pressão baixa
Problemas em HPLC
1 – Não desprezar as causas mais simples como rede elétrica,
estabilizador de voltagem, chaves gerais e tomadas de todos os
módulos
2 – Verificar as conexões elétricas entre os módulos, especialmente
detectores e dispositivos de registro e integração
3 – BOMBA: Verificar a chegada livre da FM até a entrada da
bomba; aprender a observar e interpretar a leitura de pressão de
trabalho do sistema, a qual é um bom indicador de uma série de
problemas; conhecer os ruídos normais de funcionamento do seu
sistema; verificar movimento dos indicadores de pistão; certificar
visualmente se há vazão constante na válvula de referência ou na
saída da bomba
Evitando problemas em HPLC
4 – Inspecionar o sistema todo para vazamentos encostando
um pedaço de papel absorvente em todas as conexões
hidráulicas
5 – Conferir se as tubulações entre os módulos são do
diâmetro interno correto, isto especialmente se o sistema
tiver sido usado por outra pessoa ou passado um tempo
sem uso
6 – DETECTOR: Verificar visualmente a vazão de FM na
saída correta. Aprender a usar alguns dos comandos
diagnósticos mais simples do detector como: absorbância,
voltagens e horas de uso da lâmpada, energia das células
(amostra e referência)
Evitando problemas em HPLC
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7 – FASE MÓVEL: Existindo dúvida, re-filtrar, re-desgaseificar,
ou preparar novamente a FM usando outro lote, outra marca ou
outra garrafa, certificar se o pH da fase permanece no valor
correto (água é sempre o componente mais suspeito)
8 – Quando há suspeita de contaminação não hesitar em trocar
vidraria, ampolas, vials, agulhas e seringas, a fim de eliminar as
possíveis fontes de contaminação
9 – Se tiver mais do que um sistema de HPLC a simples
substituição de um módulo por outro pode às vezes revelar a
fonte do problema!
10 – Para trabalhar com HPLC o operador necessita de muita
paciência! Tomar um rumo errado baseado numa conclusão
precipitada é a receita certa para um desastre!
Evitando problemas em HPLC