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Ate este mes desc nção: O ma e Programa smo. Os cré critos na Bib D aterial deste de Educaçã éditos do co bliografia Con Cu DNA MÓ módulo está ão Continuad onteúdo aqu nsultada. urso A For ÓDU á disponível da. É proibid ui contido sã de rense LO I apenas com da qualquer ão dados a e II mo parâmetro forma de co os seus res o de estudos omercializaçã spectivos au s para ão do utores 65 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores MÓDULO III Estudo da Metodologia Aplicada à Identificação Humana (Cont.) Coleta do Material Biológico As amostras de material biológico devem ser minuciosamente colhidas, seja quando dispostas na cena do crime ou quando forem de indivíduos devidamente identificados. É importante que todas as pessoas que manipulam as amostras tenham conhecimentos específicos baseados na literatura especializada, e ainda possuam treinamento em boas práticas de manipulação em laboratórios forenses, com rígida formação em controle de qualidade (INTERPOL, 2001). Amostras que não estiverem adequadamente identificadas e documentadas podem ser questionadas; aquelas que não forem corretamente coletadas são passíveis de não serem analisadas; outras, se não forem devidamente acondicionadas podem sofrer contaminação e se não forem criteriosamente preservadas pode ocorrer decomposição e deterioração (FBI, 2003). O FBI (1999, 2001) e a INTERPOL (2001) elaboraram normas para os laboratórios forenses que participam da formação dos bancos de DNA internacional, englobando principalmente a metodologia de coleta de evidências biológicas para análise do DNA, assim como aspectos importantes para o treinamento de pessoal que serão descritas adiante. O material biológico presente na cena do crime pode aparentar invisível a olho nu, dessa maneira, utiliza-se reagente como o luminol que não interfere na análise do DNA para detecção de amostras com vestígios de sangue, sendo que reage com o ferro presente na hemoglobina, exibindo uma quimioluminescência (GROSS et al, 1999). Outros kits de reagentes são empregados: aqueles que contém antígeno próstata- específico para sêmen (HOCHMEISTER et al, 1999) e para saliva, o teste de detecção de amilase por Phadebas® (WILLOTT & GRIFFITHIS, 1980) etc. Diversos cuidados devem ser tomados para a documentação das amostras coletadas na cena do crime: fotografar o local de remoção das evidências, realizar anotações da sua disposição e de características pertinentes (SÃO PAULO, 1999; INTERPOL, 2001 ; FBI, 2003; 66 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores BONACORSO, 2005). Amostras de sangue podem ser coletadas dos indivíduos, encontradas em corpos, objetos e superfícies (Figura 46). Qualquer que seja o material biológico a ser coletado, o manipulador deverá utilizar luvas ou pinças estéreis (Figura 46 e 47). A coleta de sangue em indivíduos hígidos deverá ser realizada em dois tubos de 5mL contendo EDTA como anticoagulante, devidamente identificado e a seguir refrigerado. Recomenda-se que os objetos, superfícies ou corpos que possuem as amostras de sangue sejam recolhidos se possível, além de realizar esfregaços nas formas líquidas ou, se secas, umidificar a região com água estéril, seguida de esfregaço. Em ambos os casos aconselha-se esperar secar os esfregaços (Figuras 48 e 49) para depois serem embalados em envelope de papel limpo (Figura 47), evitando que a umidade facilite o crescimento de bactérias e fungos. Amostras de sêmen, de saliva e urina, ou de objetos que os contém, podem ser utilizadas e seguem a mesma metodologia descrita anteriormente. Tecidos, dentes, ossos e fios de cabelos também podem servir de fonte de células para análise de DNA (FBI, 2003). A estocagem do material deve ser em refrigerador a 4°C ou em freezer a -20°C, no entanto, para longos períodos, estocar a -70 a -80°C (BUTLER, 2005). 67 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 46: Amostras de sangue sendo coletadas de um objeto perfuro-cortante – faca – frequentemente utilizado em agressões físicas e homicídios. 68 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 47: manipulação de material contendo amostras biológicas com luvas. Figura 48: esfregaço bucal utilizado para a coleta de saliva e células descamadas da mucosa oral, para a extração de DNA. 69 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 49: Coletor estéril apropriado para coleta de materiais biológicos presentes na cena do crime. O armazenamento do material biológico úmido em sacos plásticos deve ser de no máximo 2 horas ou, quando possível, permitir que seque antes do acondicionamento final. Cada tipo de amostra de material biológico (sangue, saliva, osso, dente, etc.) deve ter sua coleta e disposição individualmente descrito (Secretaria de Segurança Pública de São Paulo – SSP-SP, 1999; INTERPOL, 2001). A degradação do DNA de amostras biológicas, utilizadas em investigação criminal, pode ocorrer decorrente de um processo natural de exposição ao meio-ambiente. Luz, umidade, temperaturas elevadas, bem como contaminações bacterianas ou fúngicas levam à degradação química do DNA humano (SCHNEIDER et al, 2004). A comissão de DNA da Internacional Society For Forensic Haemogenetics – ISFH sugeriu algumas recomendações para a análise de DNA pela PCR, incluindo que essa contaminação pode ser evitada, atendendo a certos cuidados durante todo o processo de análise de DNA, que vão desde a coleta e armazenamento do material biológico do qual 70 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores será extraído o DNA, até o próprio local de preparação da PCR. As contaminações das amostras pelos investigadores e pessoas do laboratório podem resultar em uma incorreta interpretação do perfil genético. Dessa maneira, o desenvolvimento e cumprimento de normas de procedimentos e treinamentos específicos para o exame de DNA tornaram-se imprescindíveis (INTERPOL, 2001). Visando o estabelecimento de normas para coleta e exame de materiais biológicos para identificação humana, a Secretaria de Segurança Pública do Estado de São Paulo (SSP-SP) baixou a Resolução SSP-194, em 2 de junho de 1999 (São Paulo, 1999): “Considerando: a) a necessidade de normatizar os serviços periciais relativos à coleta de materiais biológicos para exames de identificação humana, tanto nos locais de crime quanto na pessoa humana, viva ou morta; b) que os procedimentos a serem seguidos pelos órgãos policiais e periciais oficiais devem estar em consonância com os ditames da legislação em vigor, e c) que é imprescindível a correta preservação das amostras para não haver contaminações ou outros prejuízos (p. 104)”. Continuando na mesma Resolução, em seu anexo cita os cuidados que devemos ter para a coleta,armazenamento e análise do material biológico para a extração de DNA. Os cuidados incluem utilização de luvas descartáveis; instrumentos de coleta, armazenamento e análise devem ser estéreis; a documentação completa do vestígio eleito para a coleta, incluindo-se fotografias da região, tipo de armazenamento, entre outros; o armazenamento do material biológico úmido em sacos plásticos deve ser de no máximo 2 horas ou, quando possível, permitir que seque antes do acondicionamento final. Cada tipo de amostra de material biológico (sangue, saliva, osso, dente, etc.) deve ter sua coleta e acondicionamento individualmente descrito. 71 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores EXTRAÇÃO DE DNA A quantidade, a pureza e a integridade do DNA dependem de vários fatores, podendo ser influenciados pelas metodologias aplicadas para a sua extração. Após a coleta do material biológico, o DNA da amostra deverá ser separado de outras substâncias celulares antes de ser examinado. Proteínas celulares, contaminações químicas e microbiológicas diminuem o poder discriminatório das análises utilizando o DNA (BUTLER, 2005; HOFF-OLSEN et al, 1999; JUNG et al, 1991). A escolha do uso de diferentes métodos de extração de DNA está relacionada ao tipo de material envolvido e influencia diretamente o sucesso da análise dos STRs. A maioria dos procedimentos de extração de DNA compreende a lise celular, seguida da remoção das proteínas celulares precipitadas e por fim a precipitação do DNA com sua final eluição. Existem diversos métodos para obtenção de DNA: a extração orgânica, que é a mais tradicional, empregando-se a proteinase K para lise celular e fenol clorofórmio Este material de para a pre por FTA Cada um 2005; BUT Figur eve ser utilizado a ecipitação (Figura 52 a delas po TLER, 200 ra 50: Esque apenas como parâ das prote 2); pela síl ossui suas 05; RAND ma da extraç âmetro de estudo eínas (Figu lica; por p s indicaçõ et al, 1991 ção de DNA 72 deste Programa ura 50); a e precipitação ões, vantag ; SALAZA pelo método . Os créditos dest extração p o salina; e gens e de AR et al, 19 o orgânico. te conteúdo são d pela resina e por tiocia esvantagen 998; HIRAT dados aos seus re Chelex (F anato de g ns (BONAC TA, 2002). espectivos autores Figura 51); guanidina. CCORSO, s 73 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA DE SALIVA PELO MÉTODO ORGÂNICO (Anzai et al.; 2001). A amostra de saliva coletada e colocada em tubo estéril é submetida à centrifugação para a separação das células de sua parte aquosa, removendo- a. As pontas contendo o algodão dos swabs – que contém a saliva coletada sobre a pele – foram colocadas em um tubo estéril, sendo imediatamente iniciado o processo de extração, sem nenhum preparo prévio. Em seguida, adiciona-se 700μL do tampão de lise para saliva (10mM TRIS pH8,0; 10mM EDTA; 0,1 M NaCl; 2% SDS) e posteriormente 35μl de Proteinase K 20mg/mL. Após agitação, a tampa do tubo deve ser vedada com Parafilm® e incubada por uma noite a 56oC. A seguir, a Proteinase K é inativada a 95oC por 10 minutos, adicionando-se 700μL de fenol tamponado com pH 8,0 e homogeneizando-se com movimentos manuais leves por 5 minutos. Centrifuga-se e o sobrenadante é transferido para outro tubo, utilizando uma micropipeta com ponteira estéril. Acrescenta-se fenol/ clorofôrmio/ álcool isoamílico (25:24:1) na mesma quantidade do sobrenadante removido, homogeneiza-se, centrifuga-se e remove-se o sobrenadante novamente para outro tubo. Adiciona-se ao sobrenadante cerca de 2 ou 3 vezes o volume recuperado, álcool 100% e 10% do volume em acetato de sódio 5M. Incuba-se durante uma noite a -20oC. No terceiro dia de extração, centrifuga-se a mistura. Dispensa-se o etanol, e ao precipitado adiciona-se 1mL de etanol 70%, homogeneizando-se cuidadosamente. Centrifuga-se e novamente é removido o álcool. Seca-se totalmente o "pellet". Ressuspende-se o "pellet" com 100μL de T.E. (Tris-base 100mM, pH 7,6; EDTA 10mM, pH 8,0). Este material de Figur eve ser utilizado a ra 51: Esque apenas como parâ ma da extraç âmetro de estudo ção de DNA 74 deste Programa pelo Chelex . Os créditos dest x 100®. te conteúdo são d dados aos seus reespectivos autoress Este material de Figur eve ser utilizado a ra 52: Esque apenas como parâ ma da extraç âmetro de estudo ção de DNA 75 deste Programa de amostra . Os créditos dest biológica de te conteúdo são d epositada em dados aos seus re m papel FTA® espectivos autores ®. s 76 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores A técnica mais amplamente empregada envolve, em sua primeira fase, a lise celular, seguida de desnaturação ou inativação de proteínas. Com solventes orgânicos o DNA é posteriormente separado de macromoléculas, como as proteínas através de solubilização em água, e em seguida precipitado com etanol. Outras metodologias com o mesmo princípio, inclusive kits comerciais, podem ser utilizadas para cada tipo de amostra biológica. Há diferentes metodologias para a extração de DNA de sangue total (Salazar et al., 1998; Schneider, 1998), de esfregaços vaginais e de amostras de sêmen (Schneider, 1998), de saliva total e de materiais contendo saliva (Walsh D et al., 1992; Sweet et al., 1996; Hochmeister et al., 1998; Anzai et al., 2001, Anzai-Kanto, 2005); de dente humano (Oliveira, 2000), de osso (Hagelberg et al., 1991; Alves, 2000) (Figura 53); de material parafinado (Mesquita et al., 2001), tecidos removidos de cadáveres (Hochmeister, 1998) (Figura 51), entre outros. Figura 53: Cadáver em avançado estado de putrefação, submergido em mar por aproximadamente 1 mês. O material biológico coletado para a extração de DNA foi a cabeça do fêmur e tecido da parte interna do tórax, utilizando a porção interna da amostra para evitar a contaminação do DNA externo. 77 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores A quantidade, a pureza e a integridade do DNA dependem de vários fatores como condições da amostra e da conservação, sendo necessário utilizar critérios para escolha da metodologia de extração para cada tipo de amostra (HAGELBERG et al., 1991; HOCHMEISTER, 1998; SALAZAR et al., 1998; SCHNEIDER, 1998; ALVES, 2000; ANZAI et al., 2001; MESQUITA et al, 2001; OLIVEIRA et al, 2002). O DNA pode ser obtido inclusive de células únicas, como as bucais. O isolamento de DNA micromanipulado de cada uma das 226 células utilizadas, a alteração da concentração de iniciadores, a utilização de AmpliTaqGold® e reação de PCR com 34 ciclos, possibilitou que Findlay et al. (1997) obtivessem sucesso ao amplificar o DNA de cada uma dessas células. AmpliTaqGold tem uma estabilidade à temperatura maior do que outras taqs, como a taq polimerase comum. Ao amplificarem individualmente o DNA de cada célula, obtiveram amplificação em 91% (206), sendoque em 50% (114) o perfil genético (7 loci) foi completo, em 64% (144) amplificou-se 4 a 6 loci. Os autores insistem no rigoroso controle da contaminação, posto que mesmo tomando esse cuidado em sua Extração de DNA Do Sangue (Salazar et al, 1998) As amostras de sangue foram submetidas à lise celular com 1000µL do tampão Tris-1 (Tris HCl 10mM pH 8,0, KCl 10mM, MgCl2 10mM EDTA 2mM pH 8,0) contendo Triton X-100 a 2.5%. Após a centrifugação, os núcleos celulares foram lisados com 220µL do tampão Tris-2 (Tris-HCl 10mM pH8,0, KCl 10 mM, Mg Cl2 10mM, EDTA 2mM pH 8,0, NaCl 0,4 M) contendo SDS a 1%. As proteínas foram removidas por precipitação salina com 100% seguindo de lavagem etanol 70%, por 3 vezes. Posteriormente o DNA foi ressuspendido em 100µL do tampão TE (Tris-HCl 10 mM e 1mM EDTA, pH 8,0) e mantidos a –20oC. 78 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores pesquisa obtiveram 28% com alelos adicionais aos verdadeiros alelos, e 11% somente com alelos adicionais. Quantificação de DNA A quantificação do DNA após a sua extração é importante para o aperfeiçoamento da qualidade do produto de DNA resultante da PCR (Internacional Society for Forensic Haemogenetics, 1992). O excesso de DNA em uma amostra de PCR poderá saturar a reação, fazendo com que apareça artefatos de técnica e amplificações inespecíficas que podem dificultar a sua análise. Já a sua falta poderá acarretar a perda de um dos alelos, quando o indivíduo é heterozigoto, ou mesmo na não amplificação dos mesmos (Butler, 2005). A qualidade e quantidade de DNA devem ser examinadas após a extração, além de verificar a possibilidade de degradação (JUNG et al, 1991; HOFF-OLSEN et al, 1999). O DNA pode ser quantificado por espectrofotometria em espectrofotômetro (Figura 54 e 55) a 260 nm, sua pureza pela relação 260/280 nm e a sua integridade pode ser avaliada em géis de agarose. No entanto, esses métodos avaliam a quantidade geral de DNA, seja ele humano ou de outro tipo. Quando se refere às amostras utilizadas em investigação criminal ou passíveis de degradação e contaminação, recomenda-se a utilização da quantificação de DNA de humano (INTERNACIONAL SOCIETY FOR FORENSIC HAEMOGENETICS - ISFH, 1992). 79 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 54: Espectrofotômetro utilizado para quantificação de ácidos nucléicos. Figura 55: Espectrofotômetro utilizado para quantificação de DNA que utiliza apenas 1μL de produto de extração de DNA. 80 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Essa quantificação pode ser realizada por hibridização de uma sonda utilizando- se um determinado lócus (D17Z1) em uma amostra de DNA imobilizada de uma membrana de náilon – dot blot (WALSH et al., 1992; ANDERSEN, 1998), e por kits comerciais como, por exemplo, o AluQuant™ human DNA quantitation system (WAYE et al, 1989; HOFF-OLSEN et al, 1999; MANDREKAR et al., 2001; SCHNEIDER et al, 2004; BUTLER, 2005). Apesar dessas técnicas serem mais complexas e caras que a espectrofotometria, elas quantificam somente o DNA humano, pois possuem sondas específicas para o mesmo. Tal característica pode ser imprescindível em casos forenses que haja a possibilidade de contaminação de DNA externo. No entanto, muitas vezes não é utilizada, pois há a necessidade de 5 a 10μL de produto de DNA, o que muitas vezes não é obtido. Uma metodologia que está substituindo as outras técnicas de quantificação por utilizar pouca quantidade de DNA, ser específico para DNA e inclusive possibilitando verificar a presença de inibidores da enzima polimerase é a quantificação de DNA por PCR em tempo real. Principalmente em casos forenses que existe ínfima quantidade de DNA, está sendo altamente recomendada. Consiste no emprego de marcadores específicos marcados com fluorescência que são utilizados para a amplificação de regiões do genoma humano. No entanto, para fins didáticos, será explicado após a explicação da reação em cadeia pela polimerase (PCR), pois envolve a amplificação do DNA. A amostra biológica sendo preservada adequadamente e realizada em ótimas condições de extração e quantificação obtém-se quantidades maiores ou menores de DNA (Tabela 3). 81 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Tabela 3: Quantidade de DNA extraído de diversos tipos de material biológico (Butler, 2005). Tipo de amostra Quantidade de DNA Sangue total 20000 ~ 40000 ng/mL Mancha de sangue 250 ~500 ng/cm3 Líquido seminal 150000 ~ 300000 ng/mL Esfregaço de material vaginal pós-coito 10 ~3000 ng/esfregaço Fio de cabelo com bulbo 1 ~750 ng/fio Pêlo com bulbo 1 ~10 ng/pêlo Saliva total 1000 ~10000 ng/mL Esfregaço bucal 100 ~1500 ng/esfregaço Urina 1 ~20 ng/mL Osso 3 ~10 ng/mg Tecido 50 ~500 ng/mg 82 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Reação de Amplificação pela Polimerase - PCR Uma tecnologia que revolucionou o campo da biologia molecular foi a PCR, tendo como seu inventor Kary Mullis (Figura 56), recebendo o Prêmio Nobel por essa descoberta (INTERPOL, 2001). A PCR consiste na amplificação seletiva de uma sequência-alvo de DNA específica a partir de uma coleção heterogênea de DNA, empregando-se um par de oligonucleotídeos iniciadores que são complementares a uma certa extensão em ambas as fitas do DNA a ser amplificado (Saiki et al, 1985). Várias sequências de iniciadores de diversas regiões do DNA humano já foram estabelecidas possibilitando a amplificação de seus respectivos STRs nas reações de PCR (Polymeropoulos et al., 1991; Polymeropoulos et al., 1992; Nishimura & Murray, 1992; Li et al., 1993; Moller et al., 1994; Urquhart et al., 1994; Urquhart et al., 1995; Jin et al., 1997). A sequência-alvo de DNA, cuja continuação é originalmente conhecida, é denominada DNA molde. Figura 56: Kary Mullis inventou a PCR, permitindo que sejam amplificados in vitro fragmentos de moléculas de DNA. 83 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores A PCR envolve três etapas: desnaturação, hibridização e extensão. A desnaturação ocorre quando a molécula de DNA é aquecida acima da temperatura de 90°C, na qual as pontes de hidrogênio da dupla hélice se rompem, ocorrendo a separação das cadeias complementares. Os iniciadores se ligam especificamente às sequências de DNA complementares no processo de hibridização, mediante uma temperatura que pode variar de 45 a 72°C e deve ser previamente otimizada, estando relacionada à temperatura de melting (Tm), que é medida através de uma fórmula específica que envolve a quantidade de C e G em sua sequência. A prevalência de ligação dos iniciadores ocorre pela sua alta concentração no meio da reação. A enzima termoestável denominada DNA polimerase direciona o posicionamento dos precursores do DNA – dNTP – iniciando a síntese de novas fitas de DNA. Com um novo aumento de temperatura, a enzima DNA polimerase catalisa a reação, incorporandoo nucleotídeo na posição terminal do iniciador, complementando as bases do DNA molde, promovendo a extensão da fita (Saiki, 1985, Sambrook et al, 2001) (Figura 57, 58 e 59). 84 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 57: Esquema da reação de PCR, com visualização dos fragmentos. 85 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 58: Representação esquemática da PCR com detalhamentos dos reagentes que a envolvem. 86 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 59: Esquema representativo de exemplo de ciclagem para uma PCR convencional. A PCR é realizada em equipamentos denominados termocicladores que controlam e variam a temperatura automaticamente para cada programa pré-estabelecido pelo pesquisador (Figura 60). 87 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 60: Exemplo de termociclador utilizado para a PCR. A reação de PCR é preparada utilizando-se diversos reagentes que devem possuir concentrações específicas para cada tipo de análise. Atualmente, existem diversos kits de PCR contendo todos os reagentes pré-padronizados que facilitam a utilização da PCR em laboratórios forenses. No entanto, é de grande importância que o pesquisador entenda todo o processo de amplificação e seus reagentes. O reagente que vai direcionar a otimização de cada reação será o primer ou iniciador, que flanqueará a região do DNA a ser copiada, sendo um oligonucleotídeo sintetizado quimicamente e é adicionado à reação em altas concentrações (Butler, 2005). 88 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Tabela 4: reagentes utilizados em uma PCR com a respectiva concentração ótima. Reagente Concentração ótima Tris-HCl, pH 8,3 (25°C) 10 a 50 mM Cloreto de Magnésio 1,2 a 2,5 mM Cloreto de Potássio 50 mM Desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs) 200 μM de cada nucleotídeo(dATP, dTTP, dCTP, dGTP) DNA polimerase termoestável 0,5 a 5 U Soro de Albumina Bovina (BSA)* 100 μg/mL Primers ou Iniciadores 0,1 a 1,0 μM DNA 1 a 10 ng de DNA * Não é utilizado em todas as reações As ciclagens da PCR variam de acordo com os reagentes empregados, principalmente com a enzima polimerase, que altera a temperatura de extensão, os primers, que muda a temperatura de hibridização; e com a amostra de DNA, pois apresenta-se em pouca quantidade, podendo aumentar o número de ciclos. Só para ter uma idéia da variação das condições de ciclagem para kits diferentes utilizados em DNA forense foram colocados na tabela 5 exemplos de parâmetros de duas empresas distintas. 89 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Tabela 5: Parâmetros utilizados para a ciclagem da PCR em kits de PCR multiplex comercialmente disponíveis no mercado, e que são os mais utilizados mundialmente. Passo do protocolo AmpFlSTR® kits (Applied Biosystems) GenePrint® STR Kits (Promega Corporation) Desnaturação inicial 95°C / 11 minutos 95°C / 11 minutos Quantidade de ciclos 28 ciclos 30 ciclos Desnaturação 94°C / 1 minuto 94°C / 30 segundos (ciclo 1 a 10) 90°C / 30 segundos (ciclo 11 a 30) Hibridização 59°C / 1 minuto 60°C / 1 minuto Extensão 72°C / 1 minuto 70°C / 1 minuto Extensão final 60°C / 60 minutos 60°C / 30 minutos Final 10°C até sua remoção do equipamento 4°C até sua remoção do equipamento As vantagens da utilização da PCR na ciência forense são a sua sensibilidade, pois é capaz de amplificar sequências a partir de quantidades ínfimas da sequência-alvo de DNA e até mesmo do DNA de uma única célula; e sua robustez, permitindo a amplificação de sequências específicas a partir de material biológico degradado (ISFH, 1992, INTERPOL, 2001; Sambrook, 2001). No entanto, tal eficiência e sensibilidade implicam também na atenção aos cuidados para evitar-se a contaminação de DNA externo, que pode ocorrer durante todo o processo de análise do DNA (Internacional Society For Forensic Haemogenetics – ISFH, 1992). Kwok & Higuchi (1989) elucidaram vários cuidados pertinentes à preparação do material para a PCR, objetivando evitar a contaminação das amostras: 90 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores A preservação do DNA forense para a amplificação pela PCR também envolve o controle da temperatura, da umidade, o valor do pH, a presença de ácido húmico e fúlvico e microorganismos. A temperatura baixa pode preservar o DNA, seja ele datado de milhares de anos, ou de amostras forenses, assim como o DNA pode ser mais bem preservado em ambientes secos e com o mínimo crescimento de microorganismos (Figura 61). A presença de ácido fúlvico e húmico pode comprometer a amplificação pela PCR pelo fato de inibir os efeitos da enzima polimerase utilizada na reação. O pH neutro ou levemente alcalino na amostra também ajuda na preservação do DNA. Os ? o isolamento físico da área de preparação da PCR e de seus produtos utilizados; ? não levar para a sala de PCR qualquer tipo de material biológico ou produto de DNA. ? autoclavar a água deionizada e outras soluções, com exceção dos iniciadores, dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), tampão comercial e Taq DNA polimerase; ? aliquotar reagentes; ? utilização de luvas descartáveis que devem ser constantemente trocadas; ? ter cuidado ao abrir os tubos pois parte do produto da PCR pode estar na sua tampa, possibilitando o seu desperdício; ? misturar os reagentes da PCR em um único tubo, aliquotá-los em tubos individuais e por último adicionar o DNA individualmente em cada tubo; ? e finalmente a escolha correta de controles negativos e positivos, que podem auxiliar na detecção de contaminantes. Kwok & Higuchi (1989) 91 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores microorganismos podem metabolizar o DNA por completo, se em grande quantidade (Burger et al., 1999). Figura 61: Esqueletos encontrados em uma vala e que foram utilizados na Herzegovina para a identificação humana de indivíduos mortos durante a 2° Guerra Mundial. Regiões específicas de amplificação são escolhidas de acordo com o objetivo da análise. Atualmente, as regiões mais utilizadas são as STRs para a identificação humana. Edwards et al (1991) relata que as melhores STRs empregadas na identificação humana são aquelas com maior polimorfismo (maior número de alelos), menor tamanho (100 a 200 pares de bases), elevado índice de discriminação e heterozigose e baixa frequência de mutações. Esses dados são levantados por estudos populacionais de regiões distintas, que serão descritos posteriormente. A PCR permite que mais de uma regiãopossa ser copiada simultaneamente se adicionado mais de um iniciador sense e antissense em uma única reação. A amplificação 92 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores simultânea de duas ou mais regiões de DNA é conhecida por PCR multiplex (Figura 62). Para essa reação a temperatura de hibridização dos iniciadores deve ser compatível e a complementaridade excessiva das regiões deve ser criteriosamente analisada, para prevenir a formação de dímeros de iniciadores que não hibridização com o DNA (EDWARDS & GIBBS, 1994). Figura 62: Kit Multiplex de duas empresas distintas comercialmente disponíveis para a realização de PCR em uma única reação. Há diversas vantagens da PCR multiplex para DNA forense: 1) diminui o tempo de preparo e a quantidade de reagentes utilizados; 2) diversos loci podem ser amplificados em uma única reação, empregando-se pouca quantidade de DNA, 93 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores aumentando a chance de sua amplificação. Atualmente há diversos conjuntos multiplex disponíveis no comércio, facilitando a padronização e comparação dos resultados entre os laboratórios forenses (LEVEDAKOU et al., 2002; WALLIN et al., 2002; KRENKE et al, 2002; COLLINS et al, 2004) (Quadro 1). Quadro 1 - Os loci mais utilizados no FBI e INTERPOL distribuídos segundo os kits comerciais multiplex: Fornecedor Applied Biosystems http://home.appliedbiosystems.com Promega http://www.promega.com PRODUTO AmpFLSTR® Power- Plex® Power-Plex® 16 SGM Plus Profiler Profiler Plus Cofiler Identifier D21S11 (1)(2) X X X X FGA (1)(2) X X X X X VWA (1)(2) X X X X X X THO1 (1)(2) X X X X X X D3S1358 (1)(2) X X X X X X D8S1179 (1)(2) X X X X D18S51 (1)(2) X X X X D16S539 (2) X X X X X TPOX (2) X X X X X CSF1P0 (2) X X X X X D13S317 (2) X X X X X D7S820 (2) X X X X X X D5S818 (2) X X X X X D19S433 (3) X X D2S1338 (3) X X Penta D (3) X Penta E (3) X Amelogenina (1) X X X X X X X (1) ISSOL – Conjunto Padrão de Loci da INTERPOL, idêntico Conjunto Padrão Europeu - ESS, com uma exceção: para o ISSOL a amelogenina é opcional (2) Os 13 lócus do Sintema de índice de Combinação de DNA - CODIS do FBI (3) Lócus que fazem parte do grupo dos mais utilizados mundialmente segundo a INTERPOL Fonte: <http://www.interpol.int/public/Forensic/DNA/loci.asp>. Acesso em: 22 Maio 2006. 94 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Outra técnica que deve ser comentada seria a utilização da PCR em tempo real, que, no momento, está sendo aproveitada em ciência forense para determinar a quantidade de DNA humano viável para a amplificação. A PCR em tempo real amplia regiões específicas de DNA. Diferencia-se da PCR tradicional, pois possui sondas marcadas com fluoróforos proporcionando detecção em tempo real dos fragmentos amplificados, sendo simultaneamente quantificados (Figura 63). Dessa maneira, não há necessidade da utilização de géis e análise por Southern Blot como nas outras técnicas quantitativas descritas anteriormente (ANDREASON, 2003). Entretanto, para a realização da PCR em tempo real é necessário equipamento específico e sondas adequadas. O DNA humano pode ser especificamente quantificado para posterior análise do perfil genético pelas STRs, assim como verificar a presença ou não de inibidores da enzima polimerase (APPLIED BIOSYSTEMS, 2006). Figura 63: Esquema representativo da PCR em tempo real, na qual sondas com fluorescências são utilizadas para a amplificação de uma região específica de DNA. Após a hibridização da sonda com a molécula de DNA, a enzima taq polimerase atua amplificando a região alvo, liberando um fluoróforo que será analisado em tempo real pelo equipamento termociclador, sendo conectado a um computador que através de programas específicos realiza a interpretação dos dados. -------------FIM DO MÓDULO III-------------
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