Aula de Hemoderivados

Prévia do material em texto

FATOR VIII FATOR IX 
 ALBUMINA 
IMUNOGLOBULINA 
HEMODERIVADOS : PRINCIPAIS PRODUTOS 
 
 
HEMODERIVADOS 
Fator VIII 
Fator de Won Willebrand 
Fator IX 
Complexo Protrombínico 
Fator VII 
Fator VII ativado 
Fator XIII 
Fibrinogênio 
Antitrombina III 
Plasmina 
Proteína C 
Antitripsina 
Cola de Fibrina 
 
IgG IV Poliespecífica 
IgG IV anti-D 
IgG específicas(dezenas) 
 
 
 
 
 
 
 
 
Albumina 25% 
Albumina 20% 
Albumina 5% 
Albumina 4% 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FATORES DA COAGULAÇÃO 
 
IMUNOGLOBULINAS EXPANSORES 
OUTROS GRUPOS 
Alfa-2-Macroglobulina 
 
Proteínas 
Sistema 
Complementar 
 
 
 
IVIG Gramas 3,75 
Albumina Gramas 25 
FVIII IU's 180 
 
 
 
 
300.000 
IVIG Kg 1.125 
Albumina Kg 7.500 
FVIII IU's 54.000.000 
Produção de Imunoglobulina 
Fracionamento Plasma: 
 (por litro) 
Litros Plasma necessários p/ suprir o 
consumo IVIG no Brasil: 
HEMODERIVADOS 
 
 
PARA QUE SERVEM OS HEMODERIVADOS? 
Concentrado de Fator VIII Hemofilia A 
 
 
 
 
 
Concentrado de Fator IX Hemofilia B 
 
 
Fatores da Coagulação Sanguínea 
FATOR IX 
 FATOR VIII 
Hemofilia 
• Hemofilia A: 
– def. fator VIII (70 - 85%) 
– 1: 5.000 nascimentos masculinos 
• Hemofilia B: 
– def. fator IX (15 - 30%) 
– 1: 30.000 nascimentos masculinos 
gene fator VIII e fator IX - cromossomo X 
Hemostasia 
• Conceito: 
– Processo através do qual o sangue é mantido no estado fluido na circulação, 
evitando sua perda na ocorrência de lesão vascular. 
Trombose Hemorragia 
Hemostasia Primária 
Proteínas da coagulação 
Anticoagulação 
Fibrinólise 
HMWK =Cininogênio de Alto Peso Molecular 
Cascata da Coagulação 
Hemofilia Fator IIIV 
Hemofilia é uma doença genético-hereditária que se caracteriza por 
desordem no mecanismo de coagulação do sangue e manifesta-se 
quase exclusivamente no sexo masculino. 
 
Hemofilia A: ocorre por deficiência do fator VIII da coagulação do 
sangue 
Hemofilia B: deficiência por deficiência do fator IX. 
Distúrbios na coagulação 
Fator VIII 
• Mesmo quando presente em concentrações relativamente 
baixas no plasma, a função de coagulação é mantida 
• Somente uma redução substancial (maior que 70%) leva aos 
distúrbios sanguíneos característicos da hemofilia A 
 
Fator VIII 
• FVIII circula na forma de complexo com o Fator de von 
Willebrand (VWF) 
• VWF liga-se a cadeia leve dos aminoácidos das regiões amino 
e carboxil terminal do FVIII 
• A presença do VWF aumenta a meia vida do FVIII circulante: 
protege da degradação, protegendo importantes sítios de 
ligação da função cofator 
Evolução dos Métodos de Produção 
• Tratamento de Hemofilia com infusões de plasma: riscos de 
infecções 
• 1950: Fracionamento de Cohn levou ao desenvolvimento de 
plasma rico em FVIII 
• Uso do Crioprecipitado 
• Revolução no Tratamento: Processo de congelamento e 
descongelamento - crioprecipitado (rico em FVIII) – 
diminuição do volume - diminuindo a necessidade de 
transfusão de sangue total – diminuindo o volume de infusão 
– estabelecimento de uma dose de FVIII 
 
 
Processo Padrão de Fracionamento do Plasma 
Processo de Produção 
• Precipitação e Cromatografia 
• Agentes Precipitantes: PEG, glycina, hidróxido 
de alumínio 
• Cromatografia: Gel, Troca Iônica, Afinidade 
Processos 
• Cromatografia em Gel: 
• - Rende FVIII na forma de complexo com VWF, o que aumenta a 
estabilidade (60-80%) 
• Colunas maiores que 1m e 80 de diâmetro 
• Cromatografia de Troca Iônica: o melhor método 
• - resinas resistentes tratamento com NaOH (sanitizar a coluna entre os 
ciclos); 
• - Rende FVIII na forma de complexo com VWF, 
• - Toyopearl DEAE 650M, Fractogel TMAE (80%) 
• Cromatografia de Afinidade: 
• - Liga FVIII seletivamente baseado no reconhecimento bioquímico da 
sequencia de uma proteína específica: Heparina imobilizada ( Alphanate –
Grifols) 
• - Remoção de vírus: não se liga na resina 
 
 
 
Etapa de triagem do plasma 
Cromatografia de afinidade: 
Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao 
 ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou 
 por competição com o ligante livre 
Desprezar 
proteínas não 
retidas 
Lavagem 
Eluição 
pH 2,0 ou sal 
Antígeno A 
puro 
Anti-A 
interage 
apenas 
com a 
proteína A 
- 
Mistura de proteínas 
Coluna 
empacotada 
com ess gel 
Partículas de 
gel recobertas 
de anticorpos 
anti-A 
Adsorção 
Complexo 
Ag-AC é 
desfeito 
Um dos métodos mais 
eficientes para a 
purificação de proteínas, 
possibilitando um alto 
rendimento com número 
reduzido de etapas. 
 
A separação de 
moléculas tem como 
base a interação 
específica do analito 
(molécula-alvo) com um 
ligante imobilizado na 
matriz. Forças 
envolvidas nessa 
interação podem ser não 
covalentes 
(eletrostáticas, 
hidrofóbica, pontes de H) 
ou covalentes (p.e., 
ponte dissulfeto). 
Ex: cromatografia de imunoafinidade 
Ligante 
grupo-específico 
Especificidade 
Proteína A Região Fc de IgG 
Proteína G Região Fc de IgG 
Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil- 
Cibacron Blue Várias enzimas, albumina 
lisina Plasminogênio, RNA ribossomal 
arginina proteinases tipo tripsina 
benzamidina proteinases tipo tripsina 
calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina 
heparina Fatores de coagulação, lipases, 
hormônios, receptores estoróides, etc 
Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos 
de His expostos 
1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo 
 - análogos de substratos ou inibidores de enzimas 
 - agonistas ou antagonistas de receptores 
 - determinantes antigênicos de anticorpos 
 
2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos: 
Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade 
8-AEA-cAMP 
 
8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic 
monophosphate 
(ligante para proteínas com afinidade por cAMP 
ou cGMP) 
 Sítios de ligação das proteínas 
A, G e L à imunoglobulina, que 
permitem a purificação de 
anticorpos por cromatografia 
de afinidade 
 
 
Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento 
estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade 
ou impede sua ligação à resina. 
 
 A introdução de um braço espaçador diminue esse risco. 
Estratégias para acoplamento de ligantes à resina 
 Reagente Alvo no ligante 
Braço espaçador covalente entre 
a resina e o ligante 
Ligação reversível não covalente 
ligante 
Molécula-alvo (analito) 
Preparo da resina de afinidade: 
 
Passo 1. Ativação da resina 
 
 
 Passo 2. Acoplar 
 o ligante 
Redução viral 
• Pilares de segurança 
• 1- cuidadosa seleção de doadores 
• 2- triagem das doações e liberação do pool de 
plasma não reativo 
• 3-Inativação viral/ remoção associada com o 
processo de produção 
Processos de Remoção/inativação viral 
• Pasteurização: 60oC por 10hs 
• – Fragilidade proteica – desnaturação e provoca imunogenicidade 
• - Desenvolvimento de anti FVIII – falha no tratamento com FVIII 
• - requer uso de estabilizantescomo açúcares, aminoácidos, polióis 
• Calor Seco: aquecimento do produto liofilizado 100oC/ 30min ou 80oC / 
72hs 
• - prolongado aquecimento reduz atividade a 50% ( vírus envelopados e 
não envelopados) 
• Solvente/detergente: Tri-n-butil fosfato (TNBP, 0,3%) solvente em 
combinação com detergentes (1% de triton X-100, ou polissorbato 80. 
Inativa apenas vírus envelopados 
• - remoção dos reagentes por cromatografia 
 
Processos de Remoção/inativação 
viral 
• Nanofiltração: Filtração viral 
• - Retém o complexo FVIII/VWF intácto 
• -membranas com poros 15nm remove vírus não envelopados 
• - Filtração 35-25nm: dissociação do FVIII/VWF com 
cloreto de cálcio – Filtração – ressociação por 
remoção do CaCl2 
• Luz Ultravioleta 
• Neutraliza vírus por provocar o rompimento do DNA e previnir a replicação 
- vírus envelopados e não envelopados 
• Pode provocar danos na proteina 
• difícil processo para escala industrial 
 
Manufatura do Factame Dissociação do complexo FVIII e FVW 
Fator de von Willebrand 
• Circula no plasma complexado ao fator VIII 
• Funções: 
– acentuar a síntese de fator VIII 
– proteger o fator VIII contra a proteólise 
– aumentar a concentração do fator VIII no sítio da 
lesão vascular 
Distúrbios na coagulação 
• Doença de von Willebrand é uma doença 
hemorrágica causada causada por uma 
diminuição ou uma disfunção do fator de von 
Willebrand (FvW). 
Doença de von Willebrand 
Alteração quantitativa ou qualitativa do FvW 
• Variabilidade clínica e de hereditariedade 
– dependendo do tipo 
• Doença hemorrágica hereditária mais comum 
– prevalência estimada de 1-3% (10% com sintomatologia) 
 
Classificação 
 a) Tipo 1 
• É o tipo mais comum, entre 60-80% dos casos; 
• É um defeito quantitativo onde a concetração 
do FvW fica entre 20-50% do valor normal; 
• Causa sangramentos de leve a moderado. 
b) Tipo 2 
• É um defeito qualitativo e acomete entre 
20-30% dos casos. 
• 2A: subtipo mais comum neste caso o FvW 
tem dificuldade de unir-se às plaquetas e 
há diminuição da presença de grandes 
multímeros. 
Classificação 
• 2B: o FvW tem grande afinidade de união às 
plaquetas, por isso diminui a circulação livre 
do FvW. 
• 2M: não há ausência dos grandes multímeros 
porém eles não tem a mesma capacidade de 
ligação às plaquetas. 
• 2N: o FvW perde a capacidade de ligação com 
o Fator VIII. 
Classificação 
c) Tipo 3 
• É o tipo mais grave caracterizado pela 
deficiência total do FvW. O paciente tem 
sangramentos severos. 
Classificação 
 endotélio 
GP Ib 
Adesão Plaquetária 
Plaqueta 
GP IIb-IIIa 
Lesão endotelial – exposição do colágeno 
FVW 
FVW 
Plaqueta Inativa 
 endotélio 
FVW 
Lesão endotelial – exposição do colágeno 
Ativação Plaquetária 
GP Ib 
Plaqueta 
GP IIb-IIIa 
Plaqueta 
Ativada 
ADP, Ca2+, serotonina, FVW, 
FV, fibrinogênio, PDGF 
TXA2 
Adesão Plaquetária 
Complexo 
Protrombinase 
FXa-FVa 
 
Ativação Plaquetária 
Plaqueta 
Ativada 
ADP, Ca2+, serotonina, FVW, 
FV, fibrinogênio, PDGF 
TXA2 
Complexo 
Protrombinase 
FXa-FVa 
 
fibrinogênio GP IIb-IIIa Plaqueta 
ativada 
Agregação Plaquetária Ativação Plaquetária 
Plaqueta 
Hemostasia primária 
Elementos: 
• vasos (endotélio) 
• plaquetas 
• fator de von Willebrand 
 
Quadro clínico: 
– sangramento cutaneo-mucoso 
Hemostasia primária 
Adesão Plaquetária 
 
colágeno plaquetas 
FVW 
Agregação Plaquetária 
 
plaqueta plaqueta 
Fibrinogênio 
DVW 
Funções do FVW: 
1-Ligar-se ao colágeno presente no 
subendotélio e nas plaquetas 
promovendo a formação do botão 
plaquetário no local da lesão endotelial 
(adesão e agregação plaquetária) 
2-Ligar-se e transportar o FVIII 
protegendo-o da degradação proteolítica 
do plasma 
Fator de 
von Willebrand 
Sintetizado e armazenado no 
endotélio e megacariócitos sob a 
forma de grandes multímeros 
Função: 
• Adesão plaquetária: ligação à 
GPIb-IX-V e ao vaso lesado 
(hemostasia primária) 
 
• Complexo com FVIII: evita sua 
proteólise 
 (hemostasia secundária) 
 
Produção Inústrial do Fator de 
von Willebrand 
Precipitação pelo PEG 
Métodos de Precipitação 
Glicina, Heparina seguido de precipitação em meio ácido 
Processos de Inativação Viral: Pasteurização a 60oC por 10hs. 
 
Cromatografia: 
- Exclusão 
- Troca Iônica: DEAE 650 
- Afinidade: Heparina 
 
TnBP: tri-n-butilfosfato, Polisorbato 80 (Tween 80) 
Coagulação 
• Enquanto as plaquetas formam um tampão inicial no 
local do ferimento, os fatores da coagulação em uma 
série de reações formam base de fibrina que 
fortalece o coágulo formado. 
 
 
Fator IX 
• Proteína altamente glicosilada, sintetizada no 
fígado 
• Circula com uma cadeia simples com peso 
molecular de 56kDa 
• Presente no plasma de 3 a 5 mg/L 
• Cadeia polipeptídica de 461 aa 
• Fator dependente da Vitamina K (co-fator) e 
Ca. 
 
 
Processo de Produção de 
concentrados de FIX 
• Obtido do complexo protrombínico (PCC): 
FII, FVII, IX e X além dos inibidores da 
coagulação: Proteína C, Proteína S etc. 
• Material de Partida: Sobrenadante formado 
após remoção do crioprecipitado (1UI/mL) 
• Precipitação com 8% etanol: Fração 
1(0,7UI/mL) 
• Obtenção: remoção do crioprecipitado – 
criosobrenadante (alta quantidade FIX) 
 
Processo Padrão de Fracionamento do Plasma 
Obtenção do PCC 
- Os pontos isoelétricos estão entre 4.4 e 4.6 ( são proteínas negativamente 
carregadas ) 
- Podem ser adsorvidas isoladas por cromatografia de troca aniônica (DEAE-
sepharose) 
 
 
 Purificação do FIX 
Combinação dos processos: Adsorção, Cromatografia de 
troca iônica ou Cromatografia de afinidade 
 
 
 
 
 
Processo de Inativação Viral 
Solvente/Detergente (tri-n-butil fosfato ) e 
detergente (não iônico polisorbato ou óxido de 
polietileno) 
 
Incubação a 25oC por 6hs (vírus envelopados) 
- Tratamento pelo calor seco após liofilização: 
100oC /1h ou 80oC /72hs. 
- Nanofiltração (20nm)