Fascísculo Técnicas em Engenharias Genéticas

Prévia do material em texto

Técnicas em Engenharia Genética
Vera Lucia MacieL SiLVa
São Luís
2014
Edição
Universidade estadUal do Maranhão - UeMa
núcleo de tecnologias para edUcação - UeManet
Coordenadora do UemaNet
profª. ilka Márcia ribeiro de soUsa serra
Coordenadora de Designer Educacional
profª. ilka Márcia ribeiro de soUsa serra
Coordenadora do Curso de Especialização em Ensino de Genética
profª. ligia tchaicka
Professora Conteudista
profª. vera lUcia Maciel silva
Designer Educacional
clecia assUnção silva liMa
Revisoras de Linguagem
lêda Maria soUsa tôrres de oliveira
lUcirene ferreira lopes
Diagramadores 
JosiMar de JesUs costa alMeida
lUis Macartney sereJo dos santos
tonho leMos Martins
Designers Gráficos
annik azevedo
helayny farias
rôMUlo santos coelho
Responsável pela Impressão Gráfica
cristiane costa peixoto
Governadora do Estado do Maranhão
roseana sarney MUrad
Reitor da UEMa
prof. José aUgUsto silva oliveira
Vice-reitor da UEMa
prof. gUstavo pereira da costa
Pró-reitor de administração
prof. Walter canales sant’ana
Pró-reitora de Extensão e assuntos Estudantis
profª. vânia loUrdes Martins ferreira
Pró-reitora de Graduação
profª. Maria aUxiliadora gonçalves cUnha
Pró-reitor de Pesquisa e Pós-graduação
prof. porfírio candanedo gUerra
Pró-reitor de Planejamento
prof. antonio pereira e silva
Diretora do Centro de Ciências agrárias - CCa
profª. francisca neide costa
Maciel-Silva, Vera Lúcia.
 Técnicas em engenharia genética / Vera Lúcia Maciel Silva. – 
São Luis: UemaNet, 2014.
 69 p.
 1. Genética. 2. Engenharia genética. 3. Técnicas. I. Título
CDU: 575
uniVerSidade eStaduaL do Maranhão
Núcleo de Tecnologias para Educação - UemaNet
Campus Universitário Paulo VI - São Luís - Ma
Fone-fax: (98) 2106-8970
http://www.uema.br
http://www.uemanet.uema.br
Proibida a reprodução desta publicação, no todo ou em parte, sem a 
prévia autorização desta instituição.
ATIVIDADES GLOSSÁRIO DICA DE SITE 
ÍConEs
orientação para estudo
ao longo deste fascículo serão encontrados alguns ícones utilizados 
para facilitar a comunicação com você.
Saiba o que cada um signifi ca.
 SAIBA MAIS SUGESTÃO DE LEITURA ATENÇÃO
ATIVIDADES GLOSSÁRIO DICA DE SITE 
AprEsEnTAção ................................................................................................. 7
UnIDADE 1 - Fundamentos da Biologia Molecular ............................. 9
1 Introdução .............................................................................................. 9
2 Ácidos nucleicos .................................................................................. 9
2.1 Tipos e características dos ácidos nucleicos ............................ 10
2.1.1 Estrutura do DNa .................................................................................... 11
2.1.2 a estrutura do RNa ................................................................................ 15
3 replicação ............................................................................................... 17
3.1 Experimento de Meselson-stahl .................................................. 18
3.2 Mecanismo da replicação ................................................................ 19
4 Transcrição .............................................................................................. 23
4.1 Dogma Central da Biologia ............................................................. 23
4.2 processo da transcrição .................................................................... 24
4.2.1 Componentes da transcrição ............................................................. 25
4.2.2 Etapas da transcrição ............................................................................ 25
4.3 Splicing ou processamento do rnA ............................................. 28
5 síntese de proteínas ........................................................................... 30
5.1 Código Genético ................................................................................... 30
5.1.1 Universalidade do Código genético ................................................ 32
5.2 o processo de Tradução .................................................................... 33
5.2.1 Etapas da tradução ................................................................................ 33
 referências ............................................................................................. 36
UnIDADE 2 - Técnicas Básicas da Engenharia Genética ..................... 37
1 Introdução .............................................................................................. 37
2 Extração de DnA ................................................................................... 37
2.1 Etapas da extração de DnA ............................................................. 38
2.2 Aplicações da técnica de extração de DnA .............................. 39
3 Eletroforese ............................................................................................ 43
3.1 Eletroforese de DnA ........................................................................... 44
3.1.1 Eletroforese de DNa em gel de agarose ......................................... 44
3.2 Aplicações da técnica de eletroforese ........................................ 46
4 Endonucleases de restrição (ou Enzimas de restrição) ..... 48
4.1 Aplicações das enzimas de restrição .......................................... 51
4.2 Componentes da pCr ......................................................................... 52
4.3 Etapas da pCr ........................................................................................ 53
4.4 pCr em Tempo real ............................................................................. 54
4.5 Aplicações da técnica da pCr ......................................................... 55
5 sequenciamento de DnA ................................................................. 57
5.1 Método sanger ..................................................................................... 57
5.2 o processo do sequenciamento .................................................... 58
5.3 Tecnologias de sequenciamento de nova Geração (nGs) ..... 60
5.4 projeto Genoma Humano (pGH) ................................................... 61
5.5 Aplicações do sequenciamento de DnA ................................... 61
 referências ............................................................................................. 66
 Currículo da professora-autora ..................................................... 69
Caro estudante,
Este material tem o propósito de oferecer conhecimentos sobre as principais 
técnicas da Engenharia Genética. É válido ressaltar que engenharia 
genética é um termo usado para descrever técnicas modernas em Biologia 
Molecular, sendo então definida como um conjunto de técnicas referentes 
à manipulação do DNA.
Entretanto, para falarmos dessas técnicas há necessidade também de 
revermos alguns conceitos básicos de Biologia Molecular, tais como ácidos 
nucleicos, o DNA e sua estrutura, replicação, transcrição e tradução que 
serão apresentados no primeiro capítulo. Após essa fundamentação, 
iremos abordar as principais técnicas utilizadas em Biologia Molecular, 
como extração de DNA; PCR, sequenciamento do DNA.
Bom estudo!
U
n
id
a
d
e
FUnDAMEnTos DA BIoloGIA 
MolECUlAr
1 Introdução
Nessa primeira parte do fascículo serão abordados os princípios 
básicos da Biologia Molecular, veremos os ácidos nucleicos, DNa eRNa, sendo o DNa nosso material genético; o processo pelo qual 
o DNa se duplica, dando origem a novas moléculas, conhecido 
como replicação; a forma como a informação contida no DNa 
é passada para o RNa, isto é, a transcrição e finalizaremos com a 
síntese proteica, que é a produção de proteínas a partir do RNa 
mensageiro. Ressaltamos que essas informações apresentadas são 
fundamentais para o entendimento das técnicas de engenharia 
genética, o assunto da próxima parte do nosso fascículo.
2 Ácidos nucleicos
Os ácidos nucleicos foram descobertos em 1869, por Johann 
Friedrich Miescher, que isolou, do núcleo de leucócitos, uma 
substância composta de hidrogênio, oxigênio, nitrogênio e fósforo 
e a denominou nucleína. Em 1889, Richard altmann, aluno de 
Miescher, descobriu que a nucleína era ácida, e mudou o nome 
para ácido nucleico. No entanto, o papel dos ácidos nucleicos na 
•	 Compreender a estrutura dos ácidos nucleicos (DNa 
e RNa), suas propriedades e suas funções biológicas;
•	 Reconhecer os processos moleculares de 
armazenamento, transmissão e expressão da 
informação genética;
•	 Compreender o dogma central da Biologia molecular.
objetivos
GENÉTICA10
hereditariedade e no controle da atividade celular só começou a ser 
esclarecido no século XX (MaIa; LaNNES, sd). 
2.1 Tipos e características dos ácidos nucleicos
Existe na natureza dois tipos de ácidos nucleicos: DNa (ácido 
desoxiribonucleico) e RNa (ácido ribonucleico). Os ácidos nucleicos 
são macromoléculas poliméricas, formadas por unidades menores 
denominadas nucleotídeos, estes, por sua vez, são formados por três 
partes: um açúcar com 5 carbonos (pentose); um grupo fosfato e uma 
base nitrogenada (Figura 1).
Figura 1 - Estrutura básica de um nucleotídeo e sua composição: uma base nitrogenada, 
uma pentose (açúcar) e um grupo fosfato
Fonte: Modificado de http://scienceaid.co.uk/biology/genetics/dna.html
Nas moléculas de DNa a pentose é uma desoxirribose, enquanto que 
nas moléculas de RNa a pentose é uma ribose (Figura 2).
Figura 2 - Estrutura das bases púricas (a) e das bases pirimídicas (b)
Fonte: http://www.facom.ufms.br/~tmcomparisons/genetica.htm
Fundamentos da Biologia Molecular | unidade 1 11
as bases nitrogenadas, também conhecidas como orgânicas, estão 
classificadas em dois grupos: o das purinas, composto poradenina (a), 
guanina (G), citosina (C) e o grupo das pirimidinas que incluem timina 
(T) e uracila (U) (Figura 3). No DNa são encontradas as bases a, G, C e T e 
no RNa a T é substituída por U.
Figura 3 - Pentose dos ácidos nucleicos
Fonte: http://www.facom.ufms.br/~tmcomparisons/genetica.htm
2.1.1 Estrutura do DNa
O DNa é um composto orgânico cujas moléculas contêm as 
instruções genéticas necessárias para coordenar o desenvolvimento e 
funcionamento de todos os seres vivos. 
a estrutura da molécula de DNa foi 
descoberta em 1953, por dois cientistas, 
James Watson e Francis Crick (Figura 
4), eles se basearam em parte nos 
resultados da difração de raios X, obtidos 
por Rosalin Franklin. Por esta descoberta, 
Watson e Crick receberam o Prêmio 
Nobel de Medicina em 1962, juntamente 
com Maurice Wilkins. a descoberta da 
estrutura do DNa, com todas as suas 
implicações, é considerada um dos 
maiores acontecimentos científicos do 
século XX (SILVa, 2010).
Figura 4 - Francis Crick e James Watson e o modelo da 
estrutura de DNa, construída com fios e placa de metal
Fonte: http://nitro.biosci.arizona.edu/courses/EEB195/Lecture04/
Lecture04.html
GENÉTICa12
Figura 5 - Cristalografia de raios-X do DNa
Fonte: http://www.nndb.com/people/559/000160079/
a famosa cristalografia de raios-X do DNa produzida por Rosalind 
Franklin. as manchas formando uma cruz no centro da figura são 
um indicativo de estrutura helicoidal.
Figura 6 - Rosalind Franklin
Fonte: http://www.nndb.com/people/559/000160079/
Rosalind Franklin, pesquisadora britânica que contribuiu na 
descoberta da estrutura do DNa com pesquisas sobre difração 
de Raios-X do DNa, é considerada por muitos, como injustiçada 
por não ter ganho também o prêmio Nobel de medicina de 1962 
(SILVa, 2010).
Leia e analise o artigo 
sobre a descoberta da 
dupla hélice do DNa 
no endereço: <http://
www1.folha.uol.com.
br/folha/ciencia/
ult306u8694.shtml>
Fundamentos da Biologia Molecular | UNIDaDE 1 13
a molécula de DNa é composta de polinucleotídios enrolados, ao 
longo de um mesmo eixo formando uma dupla hélice, onde os grupos 
fosfatos e as desoxirriboses estão localizados na parte externa da 
dupla hélice formando o esqueleto e as bases nitrogenadas fi cam na 
parte interna (Figura 7).
Figura 7 - Estrutura helicoidal do DNa, destacando os fosfatos e as riboses localizados na parte 
externa formando o esqueleto da dupla hélice e as bases nitrogenadas na parte interna
Fonte: Modifi cado de http://www.genome.gov/glossary/index.cfm?id=53
as bases nitrogenadas dispõem-se em forma de pares, sendo esse 
pareamento muito específi co, a adenina pareia somente com a Timina, 
enquanto que Guanina pareia com Citosina, desta forma o número de 
bases a tem que ser igual ao de T, enquanto o número de bases C será 
sempre igual ao de G, essa condição é denominada regra de Chargaff . 
Como consequência, a sequência de bases de uma fi ta é complementar 
a outra. Os pares de bases aT são mantidos por duas pontes de 
hidrogênio, e os pares GC por três destas pontes, conforme observado 
na fi gura 8 (PIERCE, 2004).
Para saber mais sobre 
difração de raios X do 
DNa veja a animação 
no endereço: <http://
www.moodle.ufba.br/
file.php/10702/aulas/
aula_03_a_05/06_
BMOL_04_05_06_Cris-
talografia%20de%20
raio%20x_ka_mari_v_
Nivea_REVISaDO.swf>
GENÉTICa14
Para a formação da molécula de DNa é necessário que os nucleotídeos 
se unam em longas cadeias por meio de ligações fosfodiéster, formando 
entre si pontes de fosfato, como pode ser observado na fi gura 8. a 
ligação fosfodiester ocorre entre o grupamento fosfato do carbono 5 da 
pentose de um nucleotídeo e a hidroxila do carbono 3 da pentose do 
nucleotídeo seguinte. Uma série de nucleotídeos ligados desta forma 
constitui um fi lamento polinucleotídico (PIERCE, 2004).
O fi lamento polinucleotídico apresenta um sentido ou polaridade, ou 
seja, em uma ponta deste há um grupamento fosfato ligado ao carbono 
5’ do açúcar do nucleotídeo, denominado extremidade 5´. a outra ponta 
do fi lamento tem uma hidroxila ligada ao carbono 3´, sendo portanto 
denominada extremidade 3´. No caso do DNa, os dois fi lamentos 
“correm” em sentidos opostos, a extremidade 5’ de um fi lamento é 
oposta à extremidade 3’ do outro, ou seja, eles têm polaridade inversa, 
como pode ser observado na Figura 8. a orientação oposta dos dois 
fi lamentos polinicleotidicos é uma propriedade do DNa chamada 
antiparalelismo.
Figura 8 - Segmento de DNa mostrando a ligação fosfodiéster e a polaridade inversa
Fonte: Modifi cado de: PIERCE, B. a. Genética: um enfoque conceitual. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara 
Koogan, 2004. 790p.
Sugestão de aula prática 
sobre a construção dos 
ácidos nucleicos no 
endereço abaixo.
http://geneticanaescola.
com.br/wp-home/
wpcontent/
uploads/2012/10/
Genetica-na-Escola-61-
artigo-05.pdf.
Fundamentos da Biologia Molecular | UNIDaDE 1 15
Veja animação sobre 
a estrutura dos ácidos 
nucleicos
http://www.moodle.
ufba.br/file.php/10702/
aulas/aula_03_a_05/
BMOL_03_04_05_
nucleotideos_
nucleosideos.swf
2.1.2 a estrutura do RNa
 
O RNa é uma molécula intermediária na síntese de proteínas, ele faz 
a intermediação entre o DNa e as proteínas, é sintetizado a partir de 
sequências de bases de DNa. assim como o DNa, o RNa também é 
formado por umacadeia de polinucleotídeos, os ribonucleotídeos, 
no entanto, cada um apresenta suas particularidades (Figura 9). Essas 
diferenças, embora consideradas sutis, fazem com que o primeiro seja 
mais estável que o segundo.
Figura 9 - Esquema apresentando as diferenças entre DNa e RNa
Fonte: Modifi cado de: http://www.gate2biotech.com/protein-p-plays-three-cancer-fi ghting-roles/
Esses ribonucleotídeos, assim como os desoxorribonucleotídeos, são 
ligados entre si através de uma ligação fosfodiéster entre a hidroxila 
do carbono 3' da ribose do nucleotídeo e o fosfato do carbono 5' do 
nucleotídeo de seguinte. 
GENÉTICA16
Os principais tipos de RNa são os RNas mensageiros (mRNas), os 
transportadores (tRNas) e os ribossômicos (rRNa), estando todos 
envolvidos na síntese de proteínas, porém cada classe tem uma função 
específica, que será vista mais adiante.
EXErCITAnDo
1. Quais são os componentes de um nucleotídeo?
2. Faça uma representação esquemática de um nucleotídeo
3. O que diferencia o DNa do RNa?
4. O que significa dizer que as fitas de DNa apresentam polaridade 
inversa?
resumo
Existem dois tipos de ácidos nucleicos: o ácido desoxirribonucleico (DNa) 
e ácido ribonucleico (RNa), ambos são formados por nucleotídeos, sendo 
estes por sua vez constituídos por três partes: açúcar (pentose), base 
nitrogenada e fosfato. Os nucleotídeos do DNa são formados por uma 
desoxirribose, uma base nitrogenada e um grupamento fosfato. Já os do 
RNa consistem de uma ribose, uma base nitrogenada e um grupamento 
fosfato. as bases mais comumente encontradas nos ribonucleotídeos 
são as purínicas, adenina e guanina, e as pirimidínicas, citosina e uracila. 
Já nos desoxirribonucleotídeos, são as purínicas, adenina e guanina, e as 
pirimidínicas, citosina e timina.
Os nucleotídeos são unidos por ligações fosfodiéster formando um 
filamento polinucleotídico. Cada filamento polinucleotídico tem um 
fosfato na extremidade 5´ e na extremidade 3´uma hidroxila. 
a estrutura do DNa consiste em 2 filamentos polinucleotídicos dispostos 
em forma de dupla hélice. Os açúcares e fosfatos estão localizados na 
parte externa da hélice e as bases empilhadas no lado interno. Os dois 
filamentos têm polaridade inversa e são complementares.
Fundamentos da Biologia Molecular | unidade 1 17
3 replicação
Quando Watson e Crick descobriram a estrutura do DNa, estes em 
virtude da natureza complementar das duas fitas de DNa, sugeriram 
um mecanismo de duplicação, no qual cada fita serviria de molde 
para a síntese de um novo filamento. assim com a especificidade 
no pareamento de bases (a-T e C-G) significaria que apenas uma 
sequência de bases pode ser especificada por molde, resultando assim 
que as duas moléculas novas seriam idênticas as duas fitas moldes. 
Esse processo foi denominado de replicação semiconservativa, pois 
cada um dos filamentos originais de polinucleotídeos da dupla fita de 
DNa permanece conservado nas novas moléculas de DNa (Figura 10) 
(GRIFFITHS et al., 2013; PIERCE,2004).
O modelo de replicação semiconservativo não foi o único proposto, 
tendo sido igualmente apresentados outros dois mecanismos 
(PIERCE, 2004):
- mecanismo conservativo: toda a dupla fita do DNa serve como molde 
para toda molécula nova de DNa, desta forma a molécula original é 
totalmente conservada durante a replicação;
- mecanismo dispersivo: os dois filamentos de nucleotídeos se 
fragmentam, e estes servem de moldes para a síntese de novos 
fragmentos de DNa, que se reúnem em duas moléculas completas 
de DNa. Por esse mecanismo cada molécula resultante é intercalada 
de fragmentos novos e velhos.
Figura 10 - Modelos de replicação do DNa
Fonte: PIERCE, B. a. Genética: um enfoque conceitual. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
GENÉTICa18
3.1 Experimento de Meselson-stahl
O mecanismo de replicação semiconservativa do DNa foi comprovado 
por Meselson e Stahl em 1958 em um experimento com a bactéria E. coli 
(Figura 11).
Eles cultivaram as bactérias em um meio de cultura contendo nitrogênio 
pesado 15N, de densidade superior ao nitrogênio14N, usual nas 
moléculas de DNa. Eles imaginaram que, se no processo da duplicação 
as duas fi tas do DNa fossem marcadas por 15N, seria possível prever o 
que ocorreria com elas nas próximas gerações em um meio contendo o 
14N. assim, após uma duplicação, as duas fi tas fi lhas estariam marcadas 
e cada uma delas teria metade da marcação da fi ta parental. E, após duas 
duplicações, metade das moléculas estaria marcada e a outra metade 
não (PIERCE, 2004).
Figura 11 - Experimento de Meselson e Stahl
Fonte: PIERCE, B. a. Genética: um enfoque conceitual. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
Esse mecanismo de replicação é encontrado em todos os organismos, 
eucariontes ou procariontes. Mas há diferenças, por exemplo nos 
segundos como existe apenas uma molécula de DNa e seu comprimento 
é muito menor que o do DNa eucarionte, a replicação inicia-se num 
único ponto da cadeia de nucleotídeos e contínua até o término desta, 
Veja animação do 
experimento de 
MeselsonStahl no 
endereço abaixo
http://www.moodle.
ufba.br/file.php/10702/
aulas/aula_09/exp_
meselsom.swf
Fundamentos da Biologia Molecular | unidade 1 19
já nos eucariontes a replicação inicia em múltiplos pontos ao longo da 
dupla fita de DNa, como a molécula de DNa é muito comprida, os vários 
pontos de início possibilitam uma replicação mais rápida.
3.2 Mecanismo da replicação
Os componentes básicos para o processo da replicação podem ser 
agrupados em 3 grupos: um molde de DNa unifilamentar; os trifosfatos 
de desoxirribonucleosídeos (dNTPs), que são as matérias primas, a 
serem utilizadas na síntese do novo filamento polinucleotídeo; e a as 
enzimas.
Na síntese de DNa, os novos nucleotídeos são adicionados ao 
grupo ao grupo 3´-OH do filamento crescente de polinucleotídios. 
O grupo 3´-OH do último nucleotídeo no filamento liga-se ao grupo 
5´-fosfato do dNTP que chega (Figura 12b). Nesse processo ocorre 
uma ligação fosfodiéster entre os dois nucleotídeos (Figura 12c) 
(PIERCE, 2004).
Figura 12 - Na replicação, o novo filamento de DNa é sintetizado a partir de dNTPs
Fonte: PIERCE, B. a. Genética: um enfoque conceitual. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
a) b) c)
GENÉTICA20
O ponto no qual ocorre a replicação do DNa se assemelha a uma 
bifurcação, sendo que a parte aberta da dupla hélice é denominada 
forquilha de replicação (Figura 13).
Figura 13 - Os dois filamentos de DNa são sintetizados em sentidos opostos
 Fonte: PIERCE, B. a. Genética: um enfoque conceitual. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
No mecanismo da replicação as enzimas que sintetizam o DNa, 
denominadas DNa polimerases, só podem adicionar nucleotídeos à 
ponta 3´do filamento crescente, de tal forma que novos filamentos de 
DNa sempre crescem na mesma direção 5´para 3´(5´à3´). Uma vez que 
os dois filamentos moldes são de polaridade inversa e a fita de DNa 
sempre cresce no sentido 5à3´, se a síntese em um molde for da direita 
para a esquerda, no outro molde será no sentido oposto, da esquerda 
para a direita, conforme observado na Figura 13 (PIERCE, 2004).
Para que a replicação seja realizada, é necessária a ação de uma série de 
enzimas que seguem os passos listados abaixo (PIERCE, 2004 e LEWIS, 
2004), que podem ser acompanhados na Figura 14.
1. Para que o processo se inicie, a dupla hélice de DNa precisa girar 
e desenrolar-se. as DnA-topoisomerases (girases) são capazes de 
“fazer o DNa girar”. após essa etapa, entram em ação as helicases que 
promovem a abertura da hélice de DNa, separando-o em dois filamentos 
simples para que possa ocorrer a replicação.2. Para prevenir a degradação dos filamentos que ficam abertas e 
expostas atuam as ssBs, proteínas que se ligam aos filamentos simples 
de DNa, evitando a formação de pontes de hidrogênio.
Fundamentos da Biologia Molecular | UNIDaDE 1 21
3. a primase, enzima que sintetiza pequenas sequências de nucleotídeos 
de RNa, chamadas primers de RNa,no começo de cada segmento de 
DNa a ser duplicado. O primer de RNa é necessário porque as DNa 
polimerases precisam de nucleotídeo com grupo 3´-OH livre, ao qual 
será adicionado um novo nucleotídeo. Portanto, esses fragmentos 
iniciadores serão o local de início da nova fi ta.
4. as DnA polimerases, enzimas que sintetizam o DNa, partindo dos 
fragmentos depositados pela primase, vão adicionando nucleotídeos e 
construindo dois novos fi lamentos ou cadeias, cada uma complementar 
a um fi lamento antigo, lembrando que as DNa polimerases só trabalham 
no sentido 5’ para 3’ da cadeia nascente, pois necessitam de uma hidroxila 
livre para poderem adicionar os nucleotídeos. Como essas enzimas atuam 
em ambos os lados da origem de replicação, existirão duas direções de 
duplicação. Um fi lamento é sintetizado de modo contínuo, fi lamento ou 
cadeia leading ou líder e na outra fi ta molde a direção da replicação é 
contrária à direção da síntese, sendo esta sintetizada descontinuamente, 
denominado cadeia lagging ou atrasada precisando que a primase 
sintetize vários primers ao longo da fi ta. Os fragmentos formados pela 
síntese descontínua são chamados de fragmentos de Okazaki.
a DNa polimerase também atua como “revisora” a medida que avança, 
retirando bases pareadas erroneamente e inserindo as corretas. Há ainda 
a atividade de exonuclease desempenhada por outra DNa polimerase, 
que retira os fragmentos inciadores (primers) e sintetiza fragmentos de 
DNa nos espaços deixados por eles que são posteriormente selados 
pela ação da ligase.
Figura 14 - Representação da forquilha de replicação, onde estão mostradas as principais 
enzimas que formam o complexo de replicação
Fonte: Modifi cado de:http://www.vanderbilt.edu/vicb/images/discoveries%20
images%22011/dnareplication_ipond_fi g1.jpg
Veja animação sobre 
replicação do DNa 
no endereço: <http://
www.moodle.ufba.br/
file.php/10702/aulas/
aula_09/introducao.swf>
GENÉTICA22
resumo
a replicação, isto é, a síntese de novos filamentos de DNa dupla hélice, 
ocorre de forma semiconservativa, nesse mecanismo os dois filamentos 
de nucleotídeos se separam e cada um serve como molde a partir do 
qual é sintetizado um novo filamento.
a síntese de DNa ocorre no sentido 5´à 3´, ou seja, vai do grupo fosfato 
ligado ao carbono 5’ do açúcar de um nucleotídeo para o grupo hidroxila 
ligado ao carbono 3’ do açúcar de outro nucleotídeo. Em virtude da 
polaridade inversa dos filamentos de DNa, a replicação ocorre de modo 
contínuo em um filamento, chamado filamento líder e descontínuo no 
oposto, o filamento atrasado. a fita retardada é formada aos poucos, e 
cada fragmento formado é denominado fragmento de Okazaki.
O primeiro passo da replicação é a quebra das pontes de hidrogênio entre 
as bases nitrogenadas dos nucleotídeos, pela enzima helicase, permitindo 
a separação em dois filamentos. a primase sintetiza primers curtos de 
RNa, fornecendo assim um grupo 3´-OH, ao qual as DNa polimerases 
adicionaram nucleotídeos de DNa, obedecendo às regras de pareamento 
entre as bases nitrogenadas, a ponta 3´ do filamento crescente. as DNa 
polimerases possuem também uma atividade revisora, na qual verificam 
se ocorreram erros e os corrige, e uma atividade exonuclease, pela qual 
retira os ribonucleotídeos dos primers e adiciona nucleotídeos de DNa 
que são unidos pela ligase, criando o novo filamento.
EXErCITAnDo
1. O que é replicação?
2. Quais enzimas participam deste processo? Cite suas funções.
3. Por que no processo da replicação, a síntese da nova fita de DNa 
não ocorre de forma contínua nas duas fitas do DNa molde?
Fundamentos da Biologia Molecular | unidade 1 23
4 Transcrição
Como já comentado, a informação genética que especifica as proteínas 
está contida no DNa, no entanto este não é o molde direto da síntese de 
proteínas. O DNa localiza-se no núcleo e a produção de proteínas ocorre 
nos ribossomos, localizados no citoplasma. Há, portanto a necessidade 
das informações contidas na sequência nucleotídica do DNa sejam 
transferidas para o citoplasma. Esse processo ocorre por meio do RNa, 
que é a molécula intermediária entre o código genético e o produto 
gênico.
4.1 Dogma Central da Biologia
O Dogma Central da Biologia Molecular, descrito em 1958 por Francis 
Crick, objetivou relacionar o DNa, o RNa e as proteínas, de forma 
unidirecional. O DNa se duplica, originando a novas moléculas de 
DNa, ele também pode ser transcrito em RNa, e este por sua vez 
traduz o código genético em proteínas (polipeptídeo) (WaTSON, 
2006) (Figura 15).
Figura 15 – Dogma central da Biologia Molecular
Fonte: Elaborada pela autora
Uma exceção a esta regra é a dos retrovírus, cujo material hereditário 
é RNa em vez de DNa. Eles apresentam uma enzima denominada 
transcriptase reversa, que permite transcrever a informação no sentido 
GENÉTICA24
RNa para DNa e depois novamente RNa e por fim proteína (Figura 16). 
assim, a transferência de informação de ácido nucleico para outro ácido 
nucleico e deste para proteína pode ser possível, mas não acontece de 
proteína para proteína ou desta para o ácido nucleico. 
Figura 16 – Dogma central da Biologia Molecular modificado
Fonte: Elaborada pela autora
4.2 processo da transcrição
a transcrição se processa no interior do núcleo das células e consiste 
na síntese de uma molécula de RNa a partir da leitura da informação 
contida numa molécula de DNa. a maior parte dos RNas pode ser 
agrupada em três grandes grupos, que apesar de apresentarem funções 
particulares, estão todos envolvidos no processo de tradução, isto é, 
síntese de proteínas de acordo com as instruções do RNa mensageiro 
(GRIFFITHS et al., 2013; PIERCE, 2004).
RNa mensageiros (mRNas): são moléculas que atuam como 
intermediários transportando a informação genética do DNa para 
a proteína no citosol, são eles que codificam as proteínas e têm seus 
códons lidos durante a tradução.
RNa ribossômicos (rRNas): são moléculas que fazem parte da estrutura 
dos ribossomos (máquinas complexas que traduzem sequências de 
nucleotídeos de RNam em sequências de aminoácidos). 
RNa transportadores (tRNas): são moléculas responsáveis pelo 
transporte de aminoácidos corretos para o mRNa, onde ocorrerá a 
síntese de proteínas junto aos ribossomos, ou seja, fazem a conexão 
códon-aminoácido.
Fundamentos da Biologia Molecular | unidade 1 25
4.2.1 Componentes da transcrição
São necessários três componentes principais para ocorrer a transcrição: 
molde de DNa; ribonucleotídeos trifosfatados e o aparelho de transcrição 
(WaTSON, 2006; PIERCE,2004 e LEWIS, 2004).
1 - Molde de DNa: o RNa é sintetizado sobre um dos filamentos da dupla 
hélice de DNa. ao contrário da replicação, a transcrição geralmente 
ocorre em apenas um dos filamentos de nucleotídeos de DNa, 
seguindo as mesmas regras de complementaridade e antiparalelismo 
da duplicação, exceto pelo pareamento de adenina (a) com uracila (U), 
em vez de timina (T). 
2 – Ribonucleotídeos trifosfatados: são os substratos necessários para 
construir uma molécula de RNa, constituem a matéria-prima da transcrição. 
Os novos nucleotídeos são adicionados um de cada vez ao grupo 3´-OH da 
molécula nascente de RNa. O sentido da transcrição é o mesmo da síntese 
de DNa durante a duplicação, ou seja, 5´à 3´. 
3 - aparelhode transcrição: formado pela enzima RNa polimerase e várias 
proteínas acessórias que auxiliam e regulam o processo da transcrição.
a transcrição em eucariotos é mais complexa que em procariotos, mas 
no geral segue o mesmo padrão da transcrição em procariotos. Mas, há 
detalhes próprios como o fato que a RNa polimerase nos procariotos ser 
única, enquanto nos eucariontes existem três.
4.2.2 Etapas da transcrição 
São três as etapas de transcrição: iniciação, alongamento e término 
(GRIFFITHS et al., 2013; PIERCE, 2004 e LEWIS, 2004), que podem ser 
observadas na Figura 17.
GENÉTICA26
1 Iniciação
a síntese do RNa tem seu início em regiões do DNa chamadas de regiões 
promotoras, que são sequências de bases específicas reconhecidas pela 
RNa polimerase e que direcionam a transcrição de genes, em outras 
palavras que indicam o começo do gene.
Em eucariotos para que a RNa polimerase identifique a região promotora 
é necessário que um fator de transcrição esteja ligado aos elementos da 
região promotora. Fatores de transcrição são proteínas que controlam, 
quando, onde e como os genes serão transcritos, sendo a base para o 
controle da expressão gênica.
a RNa polimerase se liga a dupla fita do DNa na região promotora, 
desenrolando a dupla-hélice e separando os filamentos. a RNa 
polimerase ligada à região denominada promotora inicia o processo 
de transcrição, adicionando os primeiros nucleotídeos da sequência de 
RNa. 
2 Alongamento
após a produção dos primeiros nucleotídeos, a RNa polimerase 
passa a se deslocar pela molécula de DNa, desenrolando sua hélice e 
produzindo uma molécula de RNa, cada vez mais alongada. O DNa já 
transcrito volta a ser enrolado, quase que imediatamente, recompondo 
a sua dupla-hélice.
3 Término
a transcrição finaliza quando a RNa polimerase encontra a sequência 
de parada, o RNa então para de ser transcrito. Neste momento, o 
Fundamentos da Biologia Molecular | UNIDaDE 1 27
aparelho de transcrição se desprende, liberando uma molécula de RNa 
e imediatamente a molécula de DNa se enrola completamente.
Figura 17 - Esquema simplifi cado das etapas da transcrição
Fonte: Modifi cado de: LEWIS, Ricki. Genética Humana. Conceitos e aplicações. 5. ed. Rio de Janeiro: 
Guanabara Koogan, 2004.
Em procariotos, a síntese do RNa e a síntese da proteína a partir dele pode 
ocorrer, simultaneamente, ou seja, à medida que um RNa é sintetizado, 
a síntese proteica pode ser iniciada nessa molécula. Já em eucariotos, a 
síntese do RNa intermediário ocorre no núcleo e a utilização desse RNa, 
como molde para a síntese proteica, ocorre no citoplasma.
Os RNas sintetizados no processo de transcrição são chamados de 
transcritos primários, RNas precursores ou ainda pré-RNas. Na maioria 
das vezes, esses transcritos primários não representam uma molécula 
de RNa madura, aquela cuja sequência e estrutura correspondem à 
forma fi nal do RNa funcional. Tais transcritos primários precisam sofrer 
uma série de modifi cações, chamadas de splicing ou processamento de 
RNa. assim, quando se olha o DNa, percebe-se que este possui mais 
nucleotídeos do que aqueles encontrados no RNa maduro.
Veja animação no 
endereço abaixo
http://www.johnkyrk.
com/DNatranscription.
pt.html
- Veja animação 
da transcrição em 
procariotos no endereço 
a abaixo
http://www.moodle.
ufba.br/file.php/10702/
aulas/aula_20/inicio_
transcricao.swf
Veja animação da 
transcrição em 
eucariotos no endereço 
a abaixo
http://www.moodle.
ufba.br/file.php/10702/
aulas/aula_21/
transcricao.swf
GENÉTICa28
4.3 Splicing ou processamento do rnA
No ano de 1977, pesquisadores descobriram que a estrutura dos genes 
em organismos eucarióticos não é contínua, mas apresenta interrupções 
(WaIZBORT e SOLHa, 2007). Os genes de organismos eucariontes são 
divididos em porções chamadas de íntrons, regiões sem sentido, ou 
seja, partes do DNa que não são expressas em RNa ou em proteínas, e 
pelas regiões da sequência do DNa que são convertidas em produtos 
funcionais, os exons. 
Em procariotos os transcritos, geralmente, passam por pouca ou 
nenhuma alteração, após sua síntese, sendo em geral traduzidos ainda 
durante sua produção.
Desta forma, splicing é um tipo de processamento de um pré-RNa no 
qual determinadas sequências, introns, são removidas, enquanto as 
sequências que persistem, exons, são unidas formando assim um RNa 
maduro (Figura 18) (PIERCE, 2004). Esse processamento inclui alterações 
do tipo adição, deleção ou modifi cação de nucleotídeos (GRIFFITHS et 
al., 2013; PIERCE, 2004).
Figura 18 - Esquema simplifi cado demonstrando o processamento do RNa
Fonte: Elaborada pela autora
No processamento conhecido por splicing alternativo (Figura 19), 
diferentes exons de um mesmo pré-RNa podem ser utilizados na 
produção de diferentes RNas maduros, podendo assim sintetizar 
proteínas distintas a partir de um único gene. a partir desse processo, 
Veja nos endereços 
abaixo animações de 
um processamento de 
RNa.
<http://www.moodle.
ufba.br/file.php/10702/
aulas/aula_21/edicao.
swf>
<http://www.dnalc.org/
resources/animations/
rna-splicing.html>
Fundamentos da Biologia Molecular | UNIDaDE 1 29
o splicing alternativo proporciona um grande aumento na variedade de 
proteínas, sendo considerado a base para explicar a discrepância que 
existe entre o número de genes que codifi cam proteínas no genoma e a 
quantidade de proteínas geradas a partir destes.
Figura 19 - Esquema simplifi cado demonstrando o splicing alternativo produzindo 
diferentes RNam maduros
Fonte: Elaborada pela autora
resumo
Transcrição é o processo de síntese de uma molécula de RNa a partir do 
DNa. O dogma central da biologia molecular estabelece que a informação 
fl ui em uma única direção, do DNa para o RNa para a proteína. No entanto, 
há exceções onde a direção é RNa àDNa voltando para RNa à proteína.
a RNa Polimerase se liga a uma sequência de nucleotídeos denominada 
região promotora do gene, separando os dois fi lamentos do DNa. O molde 
para a síntese de RNa é unifi lamentar. a RNa polimerase se desloca ao longo 
do fi lamento encaixando os ribonucleotídeos. a medida que o RNa vai 
sendo formado, vai se separando do DNa que vai se pareando novamente 
e se fechando. a síntese fi naliza quando a RNa polimerase encontra a 
sequência de parada, ocorre então a liberação da molécula de RNa. 
O fi lamento transcrito, denominado transcrito primário, passa por 
um processamento pós-transcricional no qual partes da molécula são 
removidas, denominadas íntrons, e as sequências de nucleotídeos que 
permanecem são chamadas éxons. 
Para saber mais sobre 
splicing, leia o texto no 
endereço: <http://www.
educacaopublica.rj.gov.
br/oficinas/ed_ciencias/
genetica/roxa/splicing.
pdf>
GENÉTICA30
EXErCITADo
1. O que é transcrição?
2. Comente sobre o dogma central da Biologia Molecular.
3. Quais as fases do processo de transcrição de RNa? Comente cada 
uma delas.
4. O que é splicing?
5 síntese de proteínas
as proteínas são as moléculas orgânicas mais abundantes e importantes 
nas células, praticamente todos os processos vitais dependem desta 
classe de moléculas. apresentam uma incrível diversidade de funções. 
Ressalta-se ainda que a maior parte da informação genética é expressa 
em proteínas.
a síntese proteica é o mais complexo dos mecanismos biossintéticos 
que ocorre nos organismos, se desenvolvendo no interior das células. 
Este processo tem duas fases, a transcrição (já apresentada) e a tradução, 
que será vista nessa parte.
5.1 Código Genético
O código genético é o conjunto de regras pelas quais a informação 
armazenada no materialgenético é traduzida em proteínas. Este sistema 
permite que sequências de nucleotídeos sejam convertidas numa 
sequência de aminoácidos que formarão as proteínas. 
Fundamentos da Biologia Molecular | unidade 1 31
Na tradução sequências de 3 nucleotídeos de uma molécula de mRNa, 
denominada códons ou trincas, são traduzidas numa sequência 
apropriada de aminoácidos de acordo com as determinações do 
código genético. Combinando os 4 nucleotídeos (a, U, C e G), existem 
64 trincas possíveis, sendo que três, Uaa, UGa e UaG, indicam o fim de 
um gene, e são conhecidas como códons finalizadores (ou de término) 
porque designam o término da tradução do mRNa neste ponto. as 
outras 61 trincas especificam aminoácidos, destas um (aUG) além de 
codificar a metionina, sinaliza o início da tradução (GRIFFITHS et al., 
2010) (Quadro 1).
Quadro 1 - Código genetico
2ª BaSE
  U C a G  
1ª
 B
a
SE
U
UUU - Fen 
UUC - Fen 
UUa - Leu 
UUG – Leu
UCU - Ser 
UCC - Ser 
UCa - Ser 
UCG – Ser
UaU - Tir 
UaC - Tir 
Uaa - Término 
UaG - Término
UGU - Cis 
UGC - Cis 
UGa - Término
UGG - Trp
U 
C 
a 
G
3ª Ba
SE
C
CUU - Leu 
CUC - Leu 
CUa - Leu 
CUG – Leu
CCU - Pro 
CCC - Pro 
CCa - Pro 
CCG – Pro
CaU - His 
CaC - His 
Caa - Gln 
CaG - Gln
CGU - arg 
CGC - arg 
CGa - arg 
CGG - arg
U 
C 
a 
G
a
aUU - Ile 
aUC - Ile 
aUa - Ile 
aUG - MetInício
aCU - Tre 
aCC - Tre 
aCa - Tre 
aCG – Ter
aaU - asn 
aaC - asn 
aaa - Lis 
aaG - Lis
aGU - Ser 
aGC - Ser 
aGa - arg 
aGG - arg
U 
C 
a 
G
G
GUU - Val 
GUC - Val 
GUa - Val 
GUG – Val
GCU - ala 
GCC - ala 
GCa - ala 
GCG – ala
GaU - asp 
GaC - asp 
Gaa - Glu 
GaG - Glu
GGU - Gli 
GGC - Gli 
GGa - Gli 
GGG - Gli
U 
C 
a
Fonte: Elaborado pela autora
Como existem apenas 20 aminoácidos essenciais, há aminoácidos 
que são especificados por mais de um códon como por exemplo, a 
leucina e a arginina que são especificadas por seis códons. a metionina 
e o triptofano, por outro lado, são especificados por um único códon, 
cada um deles. Desta forma, o código genético é dito “redundante” (ou 
GENÉTICa32
degenerado). No entanto, embora um determinado aminoácido possa 
ser especifi cado por mais de um códon, nenhum códon indica mais de 
um aminoácido.
O código genético é lido pelos tRNas, sendo que cada tRNa se liga, em 
uma de suas extremidades, a um aminoácido específi co, apresentando 
em sua extremidade uma sequência também específi ca de três 
nucleotídeos, denominada anticódon, que o permite reconhecer, via 
pareamento de bases, um códon no mRNa (Figura 20).
Figura 20 - Estrutura do tRNa, mostrando o anticódon ligando-se ao códon 
complementar no mRNa
Fonte: http://www.wiley.com/college/boyer/0470003790/structure/tRNa/trna_intro.htm
5.1.1 Universalidade do Código genético
Quando o código genético foi completado em 1966, supunha-se que 
ele era universal, signifi cando que cada códon especifi ca o mesmo 
aminoácido em todos os seres vivos. No entanto, já se sabe que o código 
genético é quase universal. Foram encontradas algumas raras exceções, 
a maioria em genes mitocondriais, também já foram constatadas em 
genes nucleares de protozoários e no DNa de bactérias.
a universalidade do 
código genético é 
considerada uma 
evidência de que toda 
a vida compartilha uma 
origem única, ou seja, 
todos somos parentes 
em maior ou menor 
grau (RIDLEY, 2006).
Fundamentos da Biologia Molecular | UNIDaDE 1 33
5.2 o processo de Tradução
a tradução ocorre no citoplasma, mais precisamente nos ribossomos, 
e consiste na leitura das mensagens do RNa mensageiro, resultando 
na produção de uma sequência de aminoácidos, que constituem a 
proteína. O processo da tradução compreende três etapas: iniciação, 
alongamento e fi nalização, detalhadas abaixo (GRIFFITHS et al., 2013; 
PIERCE, 2004), conforme observado na Figura 21.
5.2.1 Etapas da tradução
Iniciação
O início da síntese de proteínas envolve a reunião dos seguintes 
componentes para formar o complexo de iniciação: RNam a ser 
traduzido; as subunidades maior e menor do ribossomo; o RNa 
transportador iniciador (códon aUG); os fatores de iniciação (IF) que 
facilitam a montagem deste complexo; e trifosfato de guanosina (GTP), 
que fornece energia ao processo.
a subunidade menor do ribossomo liga-se à extremidade 5’ do mRNa, 
se desloca ao longo da molécula do mRNa até encontrar o códon de 
iniciação (aUG) na mensagem, se ligando ao sítio P do ribossomo. O tRNa 
transporta o aminoácido metionina em seu sítio de ligação, esta então 
se liga ao códon de iniciação por complementaridade. a subunidade 
maior liga-se à subunidade menor do ribossomo.
Alongamento
Nesta fase, os aminoácidos são unidos para formar a cadeia polipeptídica. 
O alongamento requer os ribossomos, os RNa transportadores com seus 
respectivos aminoácidos e vários fatores de alongamento.
Um segundo tRNa leva um aminoácido específi co de acordo com 
o códon. Estabelece-se uma ligação peptídica entre o aminoácido 
recém chegado e a metionina. O ribossomo avança três bases ao longo 
O artigo abaixo 
apresenta o 
entendimento de 
alunos do ensino médio 
sobre o termo código 
genético.
http://geneticanaescola.
com.br/wphome/
wpcontent/
uploads/2014/03/
VersPress/
RevtaGenEsc_9_01_ 
art02_Press.pdf
GENÉTICa34
do mRNa no sentido 5’ → 3’. Os tRNas que já se ligaram inicialmente, 
desprendem-se do mRNa sucessivamente. No decorrer do processo, as 
moléculas de tRNa ligam-se numa primeira fase ao sítio a, sendo depois 
deslocadas para o sítio P e, fi nalmente para o E. Este processo de adição 
de aminoácido se repete várias vezes, até que a cadeia completa se 
forme.
Terminação
Essa sequência de eventos ocorre até que o ribossomo encontre um dos 
três códons de terminação: UaG, Uaa ou UGa. Para cada um dos referidos 
códons não existe correspondência para nenhum dos aminoácidos e, 
portanto, a síntese proteica é bloqueada. a terminação requer um fator 
proteico de dissociação (RF), que se liga ao ribossomo. O polipeptídeo 
é liberado do ribossomo, as subunidades maior e menor dissociam-se e 
há liberação do RNam. 
Figura 21 - Etapas do processo de tradução proteica
Fonte: Modifi cado de PIERCE, B. a. Genética: um enfoque conceitual. 1. ed. R. Janeiro: Guanabara 
Koogan, 2004. 790p.
Sugestões de atividades 
práticas
- Jogo código genético 
degenerado
http://geneticanaescola.
com.br/wp-home/
wpcontent/
uploads/2012/10/
Genetica-na-Escola-62-
artigo-11.pdf
- Jogo da síntese 
proteica.
http://portaldoprofessor.
mec.gov.br/
fichaTecnicaaula.
html?aula=904
- Construção de 
modelos que permitem 
representar a replicação 
da informação genética 
(DNa–DNa) assim como 
o seu fluxo em duas 
etapas: a transcrição 
(DNa-RNa) e a tradução 
(RNa-peptídeo). 
http://www.bteduc.bio.
br/guias/115_DNa_
RNa_e_informacao.pdf
http://geneticanaescola.
com.br/wp-home/
wpcontent/
uploads/2012/10/
Genetica-na-Escola-62-
artigo-02.pdf
Fundamentos da Biologia Molecular | unidade 1 35
resumo
O código genético do DNa se expressa por trincas de nucleotídeos, 
os códons, cada um correspondendo a um determinado aminoácido. 
Há alguns códons que não codificam aminoácidos - três códons que 
determinam o término da síntese proteica (Uaa, UaG e UGa) e um 
códon que determina, além da metionina, o início da tradução (aUG). O 
código genético é dito degenerado porque vários aminoácidos podem 
ser codificados por mais de uma trinca de bases nitrogenadas, também 
é considerado universal. 
a tradução é formada de três etapas: iniciação, alongamento e finalização. 
Na iniciação o ribossomo se une a uma molécula de mRNa. Quandoo ribossomo encontra o códon de início de tradução, uma molécula 
de RNa transportador, carregando a metionina, liga-se ao códon. No 
alongamento os ribossomos deslocam-se ao longo do filamento de 
mRNa mensageiro. a cada códon, uma molécula de tRNa, carregando 
um aminoácido, liga-se momentaneamente, se houver pareamento o 
ribossomo encaixa o tRNa, que traz o aminoácido. O ribossomo continua 
fazendo esse processo, e estabelecendo ligações peptídicas entre os 
aminoácidos até encontrar um dos 3 códons de término, quando então 
o polipeptídeo é liberado finalizando o processo.
EXErCITAnDo 
1. O que significa dizer que o código é redundante?
2. O que são códons e anticódons?
3. O que é síntese proteica?
GENÉTICA36
referências
aLBERTS, Bruce et al. Biologia Molecular da Célula. 4. ed. Porto 
alegre:artmed, 2004.
aZEVEDO, M. O. et al. Técnicas básicas em biologia molecular. Brasília, 
DF: Editora Universidade de Brasília, 2003.
GRIFFITHS aJF; WESSLER SR; CaRROLL SB; DOEBLEY J..Introdução à 
Genética. 10. ed. Guanabara Koogan, 2013.
LEWIS, Ricki. Genética Humana. Conceitos e aplicações. 5. ed. Rio de 
Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
MaIa, C.e LaNNES, D. Genética e Biologia Molecular para o Ensino 
Médio e Fundamental: Curso de Extensão na Área de Biologia Para 
Professores do Ensino Médio e Fundamental. Disponível em: <http://
www.educacaopublica.rj.gov.br/oficinas/ed_ciencias/genetica/arqs/
apostila_biomol.pdf>. acesso em: 20 jul. 2014.
PIERCE, B. a. Genética: um enfoque conceitual. 1. ed. Rio de Janeiro: 
Guanabara Koogan, 2004.
RIDLEY, Mark. Evolução. 3. ed. Porto alegre, artmed, 2006.
SILVa, M. as controvérsias a respeito da participação de Rosalind Franklin 
na construção do modelo da dupla hélice. scientiaestudia, São Paulo, 
v. 8, n. 1, p. 69-92, 2010. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.
php?pid=S1678-31662010000100004&script=sci_arttext>. acesso em: 
20 jun. 2014.
THIEMaNN, Otávio Henrique. a descoberta da estrutura do DNa: de 
Mendel a Watson e Crick. Química nova na Escola, São Paulo, n. 17, p. 
13-19, Maio 2003. ISSN: 0104-8899. Disponível em: <http://qnesc.sbq.
org.br/online/qnesc17/17-a04.pdf>. acesso em: 20 jun. 2014.
WaIZBORT, R. e SOLHa, G. C. Os genes interrompidos: o impacto da 
descoberta dos íntrons sobre a definição de gene molecular clássico. 
rEVIsTA DA sBHC, Rio de Janeiro, v. 5, n. 1, p. 63-84, jan./jul. 2007.
WaTSON, JD. Biologia molecular do gene. 5. ed. Porto alegre, artmed, 
2006.
U
ni
d
a
d
e
objetivo
TÉCnICAs BÁsICAs DA 
EnGEnHArIA GEnÉTICA
•	 Compreender as técnicas básicas da Engenharia 
Genética e suas aplicabilidades.
1 Introdução
Existem muitas técnicas na engenharia genética e com amplas 
aplicações, nesta unidade apresentaremos as técnicas básicas e mais 
comuns nos laboratórios de pesquisas e de diagnósticos, tais como: 
a extração de DNa, que pode ser considerada a base para as demais 
técnicas; a eletroforese que consiste na migração e separação de 
partículas em um suporte; a amplificação do DNa pelo processo 
da reação em cadeia da polimerase (PCR), considerada uma das 
técnicas mais importantes usadas na biologia molecular; e a técnica 
do sequenciamento do DNa cujo resultado mais conhecido é o 
Projeto Genoma Humano.
2 Extração de DnA
a extração de DNa inclui, basicamente, os procedimentos de líse 
das células (citólise) e a purificação do DNa, separando este de 
macromoléculas contaminantes, tais como proteínas e RNa, por 
digestão enzimática e/ou processos físico-químicos.
Existem muitos tipos de protocolos e kits comerciais para a 
extração de DNa que se adaptam a diversos tipos de amostras. Os 
GENÉTICA38
kits comerciais embora considerados práticos e eficientes têm gastos 
relativamente elevados o que geralmente dificulta sua aquisição 
(OLIVEIRa et al., 2007). 
2.1 Etapas da extração de DnA
primeira etapa – líse Celular
a primeira etapa é a extração propriamente dita e consiste no 
rompimento das membranas celulares e nucleares. as células são então 
submetidas a um tampão de extração, contendo algum detergente, 
visando a solubilização de membranas lipoproteicas e desnaturação 
de proteínas. O detergente também inativa as nucleases (enzimas que 
degradam nucleotídeos) deixando o DNa protegido.
segunda etapa – purificação do DnA
Nessa fase será separado o DNa dos constituintes celulares 
(polissacarídeos, lipídios e proteínas). Existem vários métodos descritos, 
a escolha depende da relação praticidade, qualidade requerida e a 
finalidade de uso do DNa. Pode ser extração com um solvente orgânico 
(por exemplo clorofórmio-álcool isoamílico); extração inorgânica com 
sal (NaCl) ou utilizando kits comerciais. alguns protocolos incorporam 
proteases (proteinase K) para facilitar a separação do DNa das proteínas 
da cromatina.
Terceira etapa - precipitação do DnA
a precipitação do DNa é feita com o uso de etanol ou isopropanol, 
que atua levando as moléculas do ácido nucleico se agregarem, com 
posterior precipitação.
Técnicas Básicas da Engenharia Genética | UNIDaDE 2 39
Quarta etapa – reidratação do DnA
O precipitado de DNa/RNa é ressuspendido em um tampão TrisEDTa 
(ou água ultra pura), em alguns protocolos usa-se RNase para degradar 
o RNa, restando apenas o DNa desejado. a suspensão pode ser 
acondicionada em freezer até sua utilização.
2.2 Aplicações da técnica de extração de DnA
a técnica de extração de DNa é a base de quase todas as outras técnicas 
aqui apresentadas. Para podermos trabalhar com o material genético 
dos seres vivos, seja ele qual for, o primeiro passo é extrair e purifi car o 
DNa. após a obtenção, este pode ter diversas utilizações, por exemplo: 
nos estudos e diagnósticos de várias doenças, tais como o câncer; em 
estudos de processos evolutivos, para se saber o grau de parentesco 
entre espécies e entre grupos; no conhecimento de genomas; em 
investigações forenses e de paternidade, entre outros. 
sugestões de atividades práticas
EXTrAção DE DnA DE MUCosA BUCAl
objetivos
Extrair DNa das células da mucosa bucal, compreendendo os 
procedimentos utilizados
Material
Copo descartável
Espátula de madeira ou palito de sorvete
Tubo de ensaio
GENÉTICA40
Álcool etílico gelado (álcool comum 90 G.L.)
Estantes para tubos de ensaio
açúcar
Sal
Detergente
Filtro
Papel de filtro
procedimento:
1. higienizar a boca fazendo bochechos com água pura;
2. colocar aproximadamente 15mL de água com açúcar na boca 
(1 colher de chá de açúcar em meio copo de água);
3. bochechar vigorosamente por 30 segundos;
4. recolher o volume obtido do bochecho num copo descartável;
5. delicadamente raspar a mucosa bucal com uma espátula de 
madeira (para obter uma quantidade maior de células);
6.mergulhar a espátula usada na raspagem da mucosa no volume 
obtido do bochecho;
7. adicionar 5ml de detergente (duas colheres de café);
8. adicionar uma colher de café de sal;
9. homogeneizar e aguardar cerca de 10 minutos;
10. filtrar a mistura;
11. transferir cerca de 5 ml do volume filtrado;
12. adicionar álcool gelado (absoluto se possível) pelas bordas 
do tubo lentamente, até que se alcance pelo menos 1cm de 
espessura.
Técnicas Básicas da Engenharia Genética | UnidadE 2 41
obs.: o DNa surgirá como uma massa esbranquiçada, formando 
um aglomerado.
EXTrAção DE DnA Do ToMATE
Material
Tomate
Tubo de ensaio
Álcool etílico gelado (álcool comum 90 G.L.)
Estantes para tubos de ensaio
Sal
Detergente
Saco plástico
Filtro
Papel de filtro
procedimento:
Solução de lise
Em um béquer ou copo de vidro colocar 50 mL de água + 1 colher 
de sopa de detergente +1 colher de café de sal de cozinha.
passos:
1. cortarum tomate em fatias e colocar em um saco de plástico e 
amassar bem até obter uma solução liquefeita;
2. acrescentar ao saco plástico a solução de lise;
GENÉTICA42
3. misturar durante cerca de 10 minutos;
4. filtrar 5 ml da mistura diretamente no tubo de ensaio;
5. acrescentar lentamente o álcool gelado, até pelo menos 1cm 
do tubo de ensaio.
obs.: 
Na extração de DNa de vegetais alguns materiais podem não 
ser a melhor escolha devido apresentarem alta concentração 
de pectinas, um açúcar que é extraído juntamente com o DNa 
e fica misturado a ele, sendo geralmente confundido com essa 
molécula (FURLaN et al., 2011). 
Dica para conseguir diferenciar DNa de pectina: na camada 
de pectina há formação de bolhas, além disso ela apresenta 
consistência de geleia quando retirada com um bastão de vidro 
ou palito de madeira; já o DNa forma filamentos muito finos, 
semelhantes a fios de algodão.
resumo
a extração de DNa inclui os seguintes passos básicos: a quebra ou 
líse das células (citólise); a purificação do DNa, separando este dos 
componentes celulares, proteínas e restos celulares; a concentração de 
DNa, que é feita pela precipitação do mesmo com álcool; e a reidratação, 
que é a solubilização do DNa. 
Em pesquisa e na medicina, os usos da extração de DNa incluem 
sequenciamento de DNa, detecção de vírus e bactérias e a investigação 
de doenças de origem genética; identificação de indivíduos, entre 
outros.
Técnicas Básicas da Engenharia Genética | UnidadE 2 43
EXErCITAnDo
1. Descreva os passos da técnica de extração de DNa.
2. Qual a função do detergente na extração do DNa?
3 Eletroforese
a Eletroforese, uma das técnicas fundamentais nos laboratórios 
de pesquisa e diagnósticos, consiste na migração de moléculas 
de acordo com suas cargas elétricas e massas em campo elétrico. 
Moléculas com carga negativa migram para o polo positivo (ânodo) e 
moléculas com carga positiva migram para o polo negativo (cátodo). 
Em alguns casos, o formato também influi, pois algumas terão maior 
facilidade para migrar pelo gel. a velocidade da migração no gel 
depende do tamanho da molécula, quanto maior a molécula menor 
a velocidade de deslocamento ao longo do gel e vice-versa. Por 
isso, em um dado momento da eletroforese moléculas de tamanhos 
distintos se encontram em diferentes pontos da matriz. 
a eletroforese pode ser usada para separar, identificar e purificar 
moléculas de proteínas e ácidos nucleicos (DNa e RNa).
Os suportes (matriz) para eletroforese mais utilizados são os géis 
(materiais porosos e inertes semelhantes a gelatina) de agarose ou 
de poliacrilamida. as duas substâncias formam tramas de poros de 
tamanhos variáveis, possibilitando a separação dos fragmentos, que 
terá sua eficiência dependente da concentração do polímero e da 
intensidade da voltagem. O gel de agarose é utilizado para os ácidos 
nucleicos e o gel de poliacrilamida é empregado tanto para proteínas 
como ácidos nucleicos.
GENÉTICA44
3.1 Eletroforese de DnA
O princípio da eletroforese de DNa se baseia na carga negativa global 
de uma fita de DNa. Portanto, moléculas de DNa ou fragmentos 
de DNa em uma solução podem ser separados aplicando-se certa 
voltagem. ao final do processo as cadeias de DNa estarão próximas 
ao polo positivo que atrai, devido à polaridade, as moléculas de carga 
negativa. 
Na eletroforese de DNa a escolha do tipo de matriz (agarose ou 
poliacrilamida) vai depender do tamanho dos fragmentos de DNa que 
se pretende separar e visualizar. Geralmente utiliza-se o gel de agarose 
para a separação de fragmentos com tamanhos variando de 0,2 kb a 50 
kb e o gel de poliacrilamida para separação de fragmentos pequenos, 
de até 1kb.
O gel de poliacrilamida, mesmo sendo o gel mais efetivo para separar 
fragmentos pequenos, apresenta algumas desvantagens, tais como: a 
poliacrilamida ser neurotóxica quando em solução, a preparação ser 
mais trabalhosa e cuidadosa, levar mais tempo para polimerizar. Já a 
agarose, não apresenta toxidade, o seu preparo é mais simples e pode 
ser reutilizada, sendo por essas vantagens o gel normalmente mais 
utilizado.
3.1.1 Eletroforese de DNa em gel de agarose
Eletroforese em gel de agarose é o método mais escolhido para separação, 
purificação e identificação de DNa e RNa, pelas vantagens já descritas. 
O DNa ou o RNa podem ser facilmente visualizados pela coloração com 
brometo de etídio (EthB) em baixas concentrações. O brometo de etídio 
é um corante fluorescente, excitado por luz ultravioleta, que se intercala 
Técnicas Básicas da Engenharia Genética | UnidadE 2 45
entre as fitas da dupla hélice de DNa ou de segmentos antiparalelos 
complementares dentro de uma mesma molécula de RNa (que é fita 
simples).
Para realização de uma eletroforese, prepara-se o gel de agarose (o 
pó de agarose é dissolvido em água fervente e gelifica quando esfria, 
semelhante a gelatina,) acrescentando-se brometo de etídio, cuja 
função é revelar os ácidos nucleicos ao ser exposto a luz ultravioleta. É 
importante ressaltar que o brometo de etídio é um corante mutagênico e 
que atualmente há outros corantes alternativos não mutagênicos, como 
por exemplo o GelRed e o SYBR Green. ainda sobre a preparação do gel 
um detalhe, é a colocação do pente no gel durante o endurecimento, 
para formar os poços que serão utilizados para a colocação das amostras 
(Figura 1).
Figura 1 - Preparação do gel de agarose
Fonte: Modificado de: http://www.nslc.wustl.edu/courses/Bio2960/labs/07DNa/Gel/
após o endurecimento do gel as amostras de DNa são então 
colocadas nos poços e, uma corrente elétrica é aplicada através do 
gel. Relembrando: como o DNa tem carga negativa, ele é atraído pelo 
eletrodo positivo e para chegar ao eletrodo positivo deve migrar através 
do gel. assim, os fragmentos de DNa menores migram através do gel 
mais rapidamente que os fragmentos maiores. após a eletroforese o 
gel é levado ao transiluminador, aparelho com luz ultravioleta, para 
visualização das bandas (Figura 2).
GENÉTICA46
Figura 2 - Esquema demonstrando o processo da realização de uma eletroforese
Fonte: PIERCE, B. a. Genética: um enfoque conceitual. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
3.2 Aplicações da técnica de eletroforese
a eletroforese é uma técnica com variadas aplicações que também é 
realizada em associação com outras técnicas, como a extração de DNa, 
o uso de enzimas de restrição, PCR, sequenciamento.
Técnicas Básicas da Engenharia Genética | UNIDaDE 2 47
Entre as diversas aplicações cita-se: testes de paternidade, comparando 
o DNa do suposto pai, da mãe e do fi lho; a identifi cação de criminosos; a 
síntese de novos antibióticos e também a determinação da sensibilidade 
bacteriana aos antibióticos; a análise, purifi cação e processamento de 
vacinas; determinação do peso molecular de proteínas; estudos da 
relação patógeno-hospedeiro; caracterização de moléculas de ácidos 
nucleicos; estudos de resistências a doenças; entre outros.
resumo
Eletroforese é uma técnica que consiste na migração e separação de 
moléculas ionizadas em um determinado gel, de acordo com suas 
cargas e massas quando submetidos a uma corrente elétrica. Moléculas 
com carga negativa migram para o polo positivo (ânodo) e moléculas 
com carga positiva migram para o polo negativo (cátodo). a eletroforese 
é utilizada para separação de proteínas, RNa e DNa. O princípio da 
eletroforese utilizada para separação de DNa se baseia na carga negativa 
global de uma fi ta de DNa. O campo elétrico faz com que as moléculas 
de DNa se movam em direção ao polo positivo de modo a se separem e 
serem distinguidas umas das outras.
a eletroforese é utilizadaem: testes de paternidade, comparando o 
DNa do suposto pai, da mãe e do fi lho; a identifi cação de criminosos; a 
síntese de novos antibióticos; a análise, purifi cação e processamento de 
vacinas; entre outros.
EXErCITAnDo
1. O que é eletroforese?
2. No que se baseia a técnica da eletroforese?
3. Por que na eletroforese de DNa, a amostra migra pra o lado positivo 
do gel?
sugestões de 
atividades práticas
Sugestão de aula prática 
sobre eletroforese 
em gel no endereço: 
http://educar.sc.usp.
br/licenciatura/2003/
siteprojeto/2003/6_
eletroforese_gel_rot_
prof.pdf
GENÉTICa48
4 Endonucleases de restrição (ou Enzimas de 
restrição)
No fi nal da década de 60 foram descobertas bactérias que produzem 
enzimas capazes de degradar DNa viral, fragmentando-o em partes 
inofensivas, denominadas enzimas de restrição (Figura 3). O nome 
dessas enzimas refere-se à sua função, uma vez que elas restringem 
a multiplicação do vírus que poderia interferir no funcionamento da 
bactéria. O DNa da bactéria invadida não é atacado porque os sítios 
vulneráveis as suas próprias enzimas são protegidos por um processo 
denominado metilação do DNa.
Figura 3 - Esquema demonstrando a ação das enzimas de restrição em bactérias
Fonte: Modifi cado de: http://bcs.whfreeman.com/thelifewire8e/content/cat_020/16020-01.htm?v=cha
pter&i=16020.01&s=16000&n=00020&o=%7C16000%7C
as enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são enzimas 
que atuam como tesouras moleculares, reconhecendo sequências de 
pares de bases específi cas em moléculas de DNa, cortando-as nesses 
pontos. Existem centenas de enzimas de restrição, produzidas por 
muitas bactérias diferentes. Cada enzima é designada de acordo com 
o organismo do qual é derivada. a Eco R1, por exemplo, é uma enzima 
obtida de Escherichia coli cepa R e foi a primeira enzima desse tipo 
isolada (PIERCE, 2004).
a primeira enzima de 
restrição foi isolada por 
Werner arber, Hamilton 
Smith, e Daniel 
Nathans, nos Estados 
Unidos. Em 1978 os 
três receberam juntos o 
prêmio Nobel.
Técnicas Básicas da Engenharia Genética | UnidadE 2 49
a maioria das enzimas de restrição reconhece sequências específicas de 
4, 5 ou 6 nucleotídeos, clivando em seguida as duas cadeias de DNa nesse 
mesmo ponto; essas sequências conhecidas como sítio de restrição, são 
normalmente palindrômicas, isto é, a sequência do sítio de restrição é 
a mesma em ambas as cadeias quando estas são “lidas” no sentido 5’ 
– 3’. as diferentes enzimas de restrição apresentam especificidade para 
diferentes sequências. 
Muitas enzimas de restrição, como a Eco R1 produzem cortes em 
ziguezague nos sítios de restrição das cadeias de DNa, originando 
fragmentos com extremidades coesivas (Figura 4). Essas extremidades 
de ambos os lados, são complementares às de todos os outros 
fragmentos gerados pela mesma enzima de restrição.
Figura 4 - Clivagem de DNa pela EcoRI. Esta enzima de restrição proveniente da E. 
colicliva o DNa na sequência palindrômica GaaTTC (6pb), originando fragmentos com 
extremidades coesivas
Fonte: Elaborada pela autora
Outras enzimas de restrição, como a Alu1 e Sma1, clivam ambas as 
cadeias de DNa no mesmo ponto do sítio de restrição, originando 
extremidades abruptas (Figura 5), nas quais todos os nucleotídeos das 
extremidades do fragmento se encontram emparelhados.
GENÉTICa50
Figura 5 - Clivagem de DNa pela SmaI. Esta enzima de restrição proveniente da 
Serratiamarcescens cliva o DNa na sequência palindrômica CCCGGG (6pb), originando 
fragmentos com extremidades abruptas
Fonte: Elaborada pela autora
Já foram isoladas diversas enzimas de restrição, conforme pode ser 
observado na Tabela 1.
Tabela 1 - Listas de enzimas de restrição e seus sítios e as bactérias de onde foram isoladas
Fonte: Modifi cado de PIERCE, B. a. Genética: um enfoque conceitual. 1. ed. R. Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
Técnicas Básicas da Engenharia Genética | UnidadE 2 51
4.1 Aplicações das enzimas de restrição
as enzimas de restrição são consideradas ferramentas indispensáveis 
na manipulação do DNa. Podemos citar como exemplos em que 
estas são utilizadas o desenvolvimento de organismos transgênicos; 
a clonagem molecular, as identificações de indivíduos utilizando 
fragmentos de DNa (gerados pelo uso das enzimas de restrição) como 
nos casos de identificação de criminosos ou de testes de paternidades; 
nos diagnósticos de doenças genéticas como por exemplo a anemia 
falciforme; nas análises de divergências genéticas entre genomas 
(CORDEIRO, 2003; LIMa, 2008).
resumo
Enzimas de restrição são enzimas que clivam uma sequência curta e 
específica de nucleotídeos ao longo da molécula de DNa, chamados 
sítios de restrição. as enzimas de restrição são produzidas por bactérias 
atuando como um sistema defesa contra DNa de vírus de bactérias, 
funcionando como “tesouras” cortando-o e inativando-o.
Entre as aplicações das enzimas de restrição pode-se citar a utilização 
destas no desenvolvimento de organismos transgênicos e na clonagem 
molecular.
EXErCITAnDo
1. Por que as enzimas de restrição são conhecidas como tesouras 
moleculares?
2. O que são sítios de restrição?
GENÉTICa52
4 pCr
a Polymerase Chain Reaction (PCR), em português, reação em cadeia 
da polimerase, foi desenvolvida pelo americano Kary Mullis em 1983, 
prêmio Nobel em 1993 (SaIKI et al., 1985in Cox et al., 2012). Mullis 
desenvolveu um processo pelo qual o DNa poderia ser multiplicado 
artifi cialmente através de uma reação de ciclos repetidos de duplicação 
catalisada pela enzima DNa polimerase. Esta reação corresponderia a 
uma imitação do processo da replicação do DNa.
PCR é uma metodologia in vitro que possibilita a reprodução de 
milhares de cópias de um determinado fragmento de DNa, resolvendo 
o problema da baixa quantidade de DNa que difi cultava ou mesmo 
impossibilitava que este fosse detectado e manuseado, revolucionando 
as pesquisas em biologia molecular, pois até então demorava-se muito 
tempo para a amplifi cação do DNa. Uma vez que a molécula de DNa 
apresenta dois fi lamentos de nucleotídeos e cada um destes pode ser 
um molde para produção de nova fi ta, a quantidade de DNa duplica a 
cada ciclo (PIERCE, 2004).
4.2 Componentes da pCr
Para realizar uma PCR faz-se uma solução que inclui: o DNa de interesse 
(a ser amplifi cado), um tampão, uma enzima especial resistente ao 
calor, chamada Taq polimerase, que promove a síntese de DNa; íons 
de magnésio, os quais estimulam a Taq polimerase; primers, que são 
pequenos segmentos de DNa de fi ta simples e complementares a cada 
uma das extremidades da sequência do DNa de interesse, e os quatro 
trifosfatos de desoxinucleótideos (dNTPs). Essa mistura é colocada em 
tubo de reação e levada a um aparelho denominado termociclador, no 
qual é submetida a vários ciclos de amplifi cação que consistem em 3 
etapas básicas (Figura 6).
Em 1957 Kornberg e 
Littauer realizaram 
a primeira síntese in 
vitro de DNa. Eles 
utilizaram a enzima 
polimerase isolada da 
bactéria Escherichia coli 
(LITTaUER; KOMBERG, 
1957).
a Taq polimerase 
utilizada no processo de 
PCR foi isolada em 1980 
da bactéria extremofi la 
Thermusaquaticus, 
que vive em águas 
quentes de gêiseres 
e vulcões submersos. 
Essa enzima resiste 
a impressionantes 
temperaturas, se 
mantendo estável em 
temperaturas próximas 
a 117ºC e tem como 
temperatura ótima 
72ºC(PIERCE, 2004).
Técnicas Básicas da Engenharia Genética | UnidadE 2 53
4.3 Etapas da pCr
Etapa 1 
Desnaturação do DNa pela alta temperatura (1 minuto a 94-96ºC), que 
leva ao rompimento das pontes de hidrogênio que unem as duas fitas, 
permitindo o anelamento dos primers.
Etapa2
anelamento dos primers em posições específicas.do DNa alvo. Essa 
reação ocorre em temperatura mais brandas, variando entre 50 e 65ºC 
de acordo com composição do primer, durante 1 minuto.
Etapa 3
Extensão da sequência a ser amplificada pela ação da Taq polimerase, 
normalmente durante 1minuto a 72ºC. Nessa etapa ocorre a adição de 
nucleotídeos utilizando como molde a sequência-alvo.
Figura 6 - Etapas básicas da técnica de PCR
Fonte: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html
GENÉTICA54
a cada ciclo, as fitas complementares de DNa são copiadas pela extensão 
dos primers que se anelam em posições opostas. Desta forma, cada fita 
de DNa, recém amplificada, é usada como molde no ciclo seguinte, 
resultando no acúmulo exponencial do fragmento de DNa flanqueado 
pelos dois primers. ao final de 30 ciclos de amplificação existem mais de 
1 bilhão de cópias do segmento de DNa de interesse para cada molécula 
molde original da amostra inicial (Figura 7).
Figura 7 - amplificação exponencial do DNa pela técnica da PCR
Fonte: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html
4.4 pCr em Tempo real
a PCR em tempo real (PCR RT) é uma outra técnica que permite detectar 
e quantificar, em tempo real, os ácidos nucleicos produzidos a cada ciclo 
da PCR (NOVaIS, 2004).
a PCR RT associa a metodologia da PCR convencional a um sistema de 
detecção e quantificação de fluorescência produzida durante os ciclos 
de amplificação. Essa metodologia possibilita amplificar, detectar e 
quantificar o DNa numa única etapa, sendo considerada mais precisa 
e rápida na obtenção de resultados, uma vez que não mais requer a 
detecção em gel de eletroforese
Técnicas Básicas da Engenharia Genética | UnidadE 2 55
Para realizar a PCR em tempo real, utiliza-se um termociclador associado 
a um detector de fluorescência capaz de medir a luz fluorescente 
proveniente de uma reação de amplificação. 
Na PCR em tempo real existem dois métodos de quantificação: a 
detecção não-específica e a específica. O Syber Green é o exemplo mais 
utilizado de detecção não-específica, no qual fluoróforos (moléculas 
que absorvem e emitem luz em um comprimento de onda específico) 
se ligam à fita-dupla de DNa e emitem uma fluorescência verde. Quanto 
ao segundo, existem o TaqMan e o Molecular Beacon, que são sondas 
(fragmentos de DNa marcado usados para hibridizar outras moléculas 
de DNa) altamente específicas a sequência alvo, liberando fluorescência 
apenas na presença do produto de PCR de interesse (MaCIEL e PEREIRa, 
2004; NOVaIS et al., 2004).
a PCR em tempo real apresenta uma série de vantagens, tais como: 
requer concentrações de DNa 1000 vezes menor que a técnica 
convencional; tem um tempo de reação reduzido; apresenta maior 
reprodutibilidade, sensibilidade e precisão. Como desvantagem pode-
se citar o alto custo do equipamento.
4.5 Aplicações da técnica da pCr
a PCR é geralmente utilizada na detecção de polimorfismos, mutações 
pontuais e infecção por micro-organismos bacterianos ou virais, 
devido à sua capacidade em detectar agentes infecciosos com maior 
sensibilidade e especificidade, sem necessidade de encontrar parasitas 
na amostra biológica (PaIVa-CaVaLCaNTI, 2008). 
a identificação de pessoas com a doenças de Chagas pode ser realizada 
de forma mais eficiente pela PCR, por meio da amplificação de sequências 
específicas de Tripanosoma cruzi. Devido a sua alta sensibilidade e 
por levar menos tempo que a cultura, a PCR também é utilizada para 
pesquisar a presença de Mycobacterium tuberculosis, bacilo causador da 
tuberculose (CaMaRGO; SILVa, sd; PaIVa-CaVaLCaNTI, 2008).
GENÉTICa56
No caso de patologias causadas por vírus, onde pode-se destacar o 
caso da aIDS, uma vez que pela PCR consegue-se detectar o vírus HIV 
nas primeiras semanas após a infecção e mais rapidamente do que o 
método normalmente utilizado, o teste ELISa. O diagnóstico e tipagem 
de vírus da dengue, do HPV (CaMaRGO; SILVa, sd).
Também é utilizada em diagnósticos de doenças genéticas como: 
distrofi a muscular de Duchenne; doença de Huntington; anemia 
falciforme, além da detecção de aberrações cromossómicas, como a 
síndrome de Down (trissomia do cromossomo 21)
Há ainda a aplicação da PCR em investigação de paternidade e em 
específi co na área criminalista, onde a possibilidade de amplifi car um 
pequeno trecho de DNa milhões de vezes permite amplifi car uma 
pequena amostra biológica (mancha de sangue, bulbo de cabelo, 
fragmentos de pele) em DNa sufi ciente para uma análise (KOCH; 
aNDRaDE, 2008).
a técnica da PCR também permite a detecção de organismos 
geneticamente modifi cados (OGM) (CONCEIÇÃO et al., 2006).
resumo
a PCR é uma técnica que é permite que um fragmento específi co da 
molécula de DNa seja amplifi cado milhões de vezes. PCR apresenta 
três etapas básicas, estimuladas pelo calor, que são repetidas por várias 
vezes, em ciclos: a abertura da fi ta de DNa que servirá de molde, por 
desnaturação térmica; o pareamento de oligonucleotídeos sintéticos, 
que funcionam como os iniciadores da reação de polimerização; e a 
amplifi cação por meio da enzima Taq polimerase, das novas fi tas de 
DNa a partir de cada um dos iniciadores. a cada ciclo a quantidade de 
DNa dobra.
a PCR em tempo real é uma variante da PCR convencional que possibilita 
quantifi car o número de moléculas produzidas a cada ciclo, sendo 
considerada mais precisa e rápida na obtenção de resultados.
Sugestão de aula prática 
de simulação da PCR no 
endereço abaixo:
http://geneticanaescola.
com.br/wp-home/
wpcontent/
uploads/2012/10/
Genetica-na-Escola-12-
artigo-07.pdf
Para melhor 
entendimento da PCR, 
acesse as animações 
abaixo:
<http://www.dnalc.org/
resources/animations/
pcr.html>
<http://highered.
mcgraw-hill.com/
sites/0072552980/
student_view0/
chapter10/animation_ 
quiz_2.html>
Técnicas Básicas da Engenharia Genética | UnidadE 2 57
a partir da técnica da PCR, quantidades mínimas de material genético 
podem ser multiplicadas, permitindo a detecção rápida de marcadores 
genéticos de doenças infecciosas, doenças genéticas e de identificação 
de indivíduos.
EXErCITAnDo
1. Compare as etapas da PCR e a replicação do DNa na célula.
2. Qual importância da desnaturação do DNa pelo aumento da 
temperatura?
5 sequenciamento de DnA
Sequenciamento de DNa é uma técnica utilizada para determinar 
a ordem das bases nitrogenadas adenina, guanina, citosina etimina 
da molécula de DNa. Quando se fala que determinado genoma foi 
sequenciado, significa que foi determinada a ordem que os genes estão 
no genoma.
No final da década de 70 foram desenvolvidos dois métodos de 
determinação da sequência de nucleotídeos da DNa: o método de 
Maxam e Gilbert ou de degradação química e o método de Sanger - 
método enzimático, dideoxi ou de término da cadeia, sendo este o mais 
utilizado.
5.1 Método sanger
O método desenvolvido por Frederick Sanger, em 1977, é baseado na 
incorporação de deoxinucleotídeos (dNTPs) e de dideoxinucleotídeos 
(ddNTPs) marcados a uma cadeia de DNa em crescimento. Sua estratégia 
GENÉTICa58
consiste em identifi car, continua e sequencialmente, durante o processo, 
o último nucleotídeo incorporado na extremidade de alongamento 
da cadeia. Lembrando que deoxinucleotídeo é o precursor normal da 
síntese de DNa apresentando uma hidroxila na posição 3´, sendo que é 
a partir desta que a fi ta crescente é estendida. Já o dideoxinucleotídeos 
não tem esta hidroxila, portanto ao ser incorporado a uma fi ta de DNa, 
interrompe a extensão desta (ZaROS; SILVa; NINOV, 2008; CaRVaLHO e 
SILVa, 2010) (Figura 8).
Figura 8 - Princípio da interrupção da cadeia crescente de DNa pela incorporação