AULA PCR BIOMED 2018

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PCR – REAÇÃO EM CADEIA DA 
POLIMERASE
Profa. Dra. Raquel Alves dos Santos
Como isolar um fragmento específico de DNA ou RNA dentro
da complexa população celular dessas macromoléculas ?
Como obter quantidade suficiente deste fragmento para
poder visualizá-lo ?
Como atingir esses objetivos de modo eficiente, rápido e
prático ?
Nas décadas posteriores à descoberta da estrutura do DNA, o progresso das
pesquisas dependia de se obter uma metodologia que contemplasse as
seguintes questões :
Método que permite o isolamento e amplificação de uma
região específica do genoma.
Bilhões de cópias a partir de uma sequencia alvo de DNA em
poucas horas
Simula uma duplicação do DNA dentro de um microtubo
(versão laboratorial da duplicação do DNA)
Ferramenta imprescindível em Biologia Molecular 
PCR
Duplicação do DNA
•Enzimas que abrem a fita
•Proteínas que mantêm a fita 
aberta
•Primase, que sintetiza o iniciador 
(primer)
•DNA pol III, que alonga o primer
•DNA pol I, que retira o primer
•Ligase, que une os fragmentos de 
Okazaki
•Nucleotídeos de DNA (dNTPs)
•Íons Mg – cofator da DNA pol
•Condições fisiológicas de 
concentração de sais e pH
•DNA molde
-Tornou possível a amplificação de segmentos específicos de DNA por meio da
utilização de uma DNA polimerase de Escherichia coli.
Kary Mullis, 1983
Três passos principais da PCR
 A base da PCR é a mudança de temperatura e o efeito que a mudança de
temperatura tem sobre o DNA
 Na reação de PCR os seguintes passos são repetidos de 20 a 40 vezes:
PASSO 1: Desnaturação do DNA - DESNATURAÇÃO
A 95C o DNA é desnaturado (a dupla fita é separada)
PASSO 2: os primers são anelados - ANELAMENTO
A 40 C -65 C os primers se anelam à sua sequencia complementar na fita simples de
DNA
PASSO 3: a DNA polimerase extende a cadeia de DNA – EXTENSÃO
A 72C a DNA polimerase adiciona nucleotídeos à extremidade 3’ dos primers
Tampão 
(sais, pH)
primers
Deoxinucleotídeos 
(dNTPs)
DNA polimeraseMgCl2 
DNA 
molde Abertura da fita, 
anelamento e extensão dos 
primers : através de 
mudanças de temperatura
PCR : reproduz in vitro a duplicação do DNA
Primers : oligonucleotídeos desenhados para flanquear uma região específica do 
genoma (ou do RNAm)
Necessidade de conhecer a sequência da região que se vai estudar
Vantagem 1 : A PCR é uma técnica altamente específica
DNA polimerase e o problema da estabilidade
Saiki et al., 1986:
-DNA polimerase termoestável 
obtida de uma bactéria de fontes 
termais (Thermus aquaticus). 
Altas temperaturas –
desnaturação da enzima 
(inativação)
Automatização da reação
3. Extensão dos iniciadores (Temperatura ótima 
da enzima: 72ºC)
Faz alternações de temperaturas, para que 
ocorram :
1. Denaturação das cadeias do DNA genômico
(94oC)
2. Associação (annealinng) dos iniciadores (45-60oC)
Na célula In vitro
Primer Primase
Sintetizados em laboratório – seqüência 
conhecida
DNA molde DNA celular DNA extraído do organismo que se vai 
estudar
Abertura da 
fita
DNA pol Taq pol (72oC)
Alongamento do 
primer
Presentes no meio 
celular
Sintetizados em laboratório (dATP, 
dCTP, dGTP, dTTP)Nucleotídeos
Presente no meio Fornecidos a partir de uma solução de 
MgCl2
Íons Mg
Presente no meio Tampão
Sais, pH
Enzimas abrem e mantêm a 
dupla fita aberta
Desnaturação pelo calor (95oC)
Eventos
Desnaturação/Associação/Extensão
N = N0 . 2
n
A quantidade de DNA final segue uma função exponencial, onde:
N = Número final de cadeias de DNA
N0 = Número inicial de DNA molde (template)
n = Número de repetições do ciclo
1 ciclo : 1x21=2
2 ciclos : 1x22=4
3 ciclos : 1x23=8
4 ciclos : 1x24=16
Ex.: N0=1
Vantagem 2 : multiplica 
exponencialmente o segmento 
alvo em pouco tempo
E = eficiência de extensão da reação
N=N0 x (1+E)
n
Eficiência da reação
Degradação dos reagentes
Esgotamento dos reagentes
Saturação da enzima
Separação incompleta das fitas
Produtos inespecíficos – competição pelos reagentes
Efeito platô na amplificação por PCR
Número de ciclos
Rendimento real
Rendimento teórico
N=N0 x (1+E)
n
100% 80% 60%No ciclos
N=1x(1+1)2=42 N=1x(1+0,8)2=3,2 N=1x(1+0,6)2=4
N=1x(1+1)1=21 N=1x(1+0,8)1=1,8 N=1x(1+0,6)1=1,6
N=1x(1+1)3=83 N=1x(1+0,8)3=6 N=1x(1+0,6)2=4
20 7,1x104 7,6x1035,2x105
35 4,8x108 8,7x1061,7x1010
Eficiência da reação depende de :
 Qualidade do DNA molde
 Qualidade do primer: sequência e composição
 Condições da reação: concentração de Mg++, DNA polimerase,
dNTPs, etc.
 Presença de inibidores da reação
 Condições de amplificação: temperatura de annealing, número
de ciclos, tempos de annealing e extensão, etc.
Controles da reação
 Certificar-se de que se está amplificando o DNA alvo, não 
um DNA estranho : o “branco”
 Certificar-se de que o resultado negativo é devido à 
ausência do alvo no DNA de estudo e não um problema de 
reação : o gene controle (-globina, -actina, GAPDH, etc)
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
Identificação dos produtos das reações...
DNA marcado com Brometo de Etídio e 
visualizado num transluminador,
aparelho que emite raios UV.
Gel na cuba sendo submetido à 
um campo elétrico
Vantagens e desvantagens
- Rápida e simples
- Alta sensibilidade 
- Muito específica
- Necessita pouco material 
biológico
- Várias adaptações
- Aquisição de reagentes,
equipamento e treinamento de
pessoal (?)
- Alta sensibilidade – falso-
positivo (necessidade de
controles)
PCR é uma ferramenta poderosa na biologia
molecular
 Um único espermatozóide, ou o bulbo de um único fio de
cabelo pode servir para amplificar uma determinada região
do genoma.
 A amplificação depende da escolha correta do par de primers
 A especifidade da PCR depende dos primers
Primers
 Primers de PCR são sequencias curtas de fita simples de DNA (15-40
pb)
 São manufaturados e comercialmente adquiridos (basta informar a
sequencia)
 Primers são sequencia específicos e se ligam a uma sequencia
específica no genoma
 Quanto mais longos, mais seletivos(15 → 40 pb)
 A DNA polimerase necessita de um primer para iniciar a
polimerização da cadeia de DNA
Temperatura de melting
 É a temperatura na qual metade das fitas de DNA está na forma de
fitas simples e a outra metade na forma de dupla hélice.
 A Tm é dependente da composição do DNA, de modo que o
aumento no conteúdo G+C no DNA gera um incremento na Tm
ocasionado pelo maior número de ligações de H.
Os cálculos básicos para o cálculo da Tm consideram apenas a composição
do primer, ou seja, apenas a quantidade de cada base que compõe o primer.
Marmur e Doty (1962) propuseram a seguinte fórmula para o cálculo da Tm :
(1) Tm = 64.9 + 41.0*(|G| + |C| - 16.4) / (|A| + |T| + |G| + |C|).
A fórmula sugerida por Wallace e colaboradores (1979) é:
(2) Tm = 2*(|A| + |T|) + 4*(|C| + |G|).
 Ambas as equações (1) e (2) assumem que o pareamento ocorre em
condições padrão de 50 nM de concentração de primers, 50mM de
concentração de sal (Na+ ) e pH próximo de 7.0. Em ambas, |A|, |C|, |T| e
|G| representam a quantidade de bases Adenina, Citosina, Timina e Guanina,
respectivamente.
Temperatura de anelamento do primer
É a temperatura na qual os primers se pareiam ao DNA 
molde. Ela pode ser calculada a partir da Tm.
T anneal = Tm(primer) – 4ºC
EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS 
NUCLEICOS
Profa. Dra. Raquel Alves dos Santos
Extração de ácidos nucleicos
1) Romper a membrana celular
2) Retirar as proteínas (histonas) e debris celulares
3) Precipitar o ácido nucleico
4) Retirar os traçosde reagentes do precipitado
5) Diluir o ácido nucleico
Objetivo : Liberar DNA/RNA em grandes quantidades, sem
prejudicar a ação da Taq polimerase
Eliminar debris celulares
Eliminar proteínas
Eliminar restos de reagentes
Impedir a ação das nucleases
Evitar contaminação com DNA/RNA de fontes estranhas
Evitar contaminação DNA/RNA
Fontes : qualquer célula nucleada (DNA)
Célula do sangue
Células bucais
Células bacterianas, fungos, vegetais
Células cultivadas
Biópsias
Material incluído em parafina
Amostras forenses : fluídos corporais, folículos capilares, ossos,
etc
Extraindo DNA de células do sangue
Anticoagulante - EDTA
2) Rompimento das hemáceas
(sol. hipotônica-sacarose)
1) Obtenção da amostra
3) Lise celular
Solução de lise contém :
NaCl : estabiliza a dupla hélice (impede denaturação)
EDTA : quelante do Mg++ e Ca++- cofatores da DNAse
 pH em torno de 8,0 (nucleases : pH ótimo = 7,0)
SDS : detergente aniônico que :
rompe a membrana lípidica
recobre as cargas positivas das histonas – DNA é liberado
Ação de protease (proteinase K) : digere proteínas (56oC)
4) Extração das proteínas
4.1) Solvente orgânico
 Fenol e/ou clorofórmio : desnaturam proteínas, tornando-
as insolúveis
Fenol :
pH 7,0 : DNA e RNA ficam na fase aquosa
pH <7,0 : DNA é precipitado, ficando só o RNA na fase 
aquosa 
Porção polar : interagem com grupos polares das proteínas,
competindo pela água
Grupo hidrofóbico : pode quebrar ligações internas das proteínas,
desestabilizando-as
Fase aquosa
Contém ácidos nucleicos
Fase orgânica :
Lipídeos, grandes polissacarídeos e proteínas 
complexadas ao SDS permanecem na fase fenólica. 
Fenol : clorofórmio : álcool isoamílico = para retirar excesso de 
fenol
4.2) Solução com alta concentração de sais (salting out)
Cargas da superfície da proteína 
interagem com as moléculas de 
água
Sais “sequestram” as moléculas de 
água
Aumenta interação proteína-
proteína : agregação e precipitação
5) Precipitação do DNA
Álcool (etanol ou isopropanol)
+
Sal (acetato de sódio ou outro)
Só quando usa-se etanol
 Álcool : muda a estrutura do DNA de modo que essas
moléculas se agregam;
Facilita a interação do Na+ com o fosfato do DNA
 Sal : dissocia-se e o cátion interage com o grupo 
fosfato do DNA, tornando a molécula menos hidrofílica
6) Lavagem do material em etanol 70%
Por conter mais água, permite que os sais se dissolvam,
enquanto mantém o DNA precipitado
7) Dissolução do DNA em água ou tampão (tris/edta-TE)
Quantificação
Estimativas de pureza :
260/280 nm : contaminação com proteína (1,8-2,0)
DNA e RNA
• Zerar o espectrofotômetro
• Diluir uma pequena alíquota do DNA (anotar fator de diluição)
• Fazer a leitura a 230, 260, 280 nm proteína
260/230 nm : contaminação com fenol ou urea (1,9-2,0)
325 nm : contaminação por partículas e sujeira na cubeta
Onde : S = tamanho do DNA em Kb
N = número de resíduos de bases A, G, C ou T
(cada base possui uma absorbância)
Para determinar a concentração (C), usar a leitura a A260 nas 
seguintes equações :
www.invitrogen.com (ver ítem “protocols”)
EXTRAÇÃO POR KITS COMERCIAIS
Sequenciamento de nucleotídeos
Método de Sanger
Tampão (sais, 
pH)
primers
Deoxinucleotídeos (dNTPs)
DNA polimerase
MgCl2 
DNA molde
ddATP
ddCTP
ddGTP
ddTTP
ddATP
AGGTCTGACTGAATGC
AGGTCTGACTGAddA
AGGTCTGACTGddA
AGGTCTGddA
AddA
AGGTCTGACTGAATGddC
AGGTCTGAddC
AGGTddC
AGGTCTGACTGAATddG
AGGTCTGACTddG
AGGTCTddG
AGddG
AddG
AGGTCTGACTGAAddT
AGGTCTGACddT
AGGTCddT
AGGddT
AddA
AddG
AGddG
A C G T
AGGddT
AGGTddC
AGGTCddT
AGGTCTddG
AGGTCTGddA
AGGTCTGAddC
AGGTCTGACddT
AGGTCTGACTddG
AGGTCTGACTGddA
AGGTCTGACTGAddA
AGGTCTGACTGAAddT
AGGTCTGACTGAATddG
AGGTCTGACTGAATGddC