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Eléia Marques dos Santos Farmacogenética: Influências sobre a farmacocinética e a farmacodinâmica São Paulo 2007 Centro Universitário das Faculdades Metropolitanas Unidas UniFMU Eléia Marques dos Santos Farmacogenética: Influências sobre a farmacocinética e a farmacodinâmica Trabalho apresentado à disciplina de Trabalho de Conclusão de Curso do curso de Farmácia da FMU sob orientação da Profª Drª Walkyria Sigler. São Paulo 2007 Eléia Marques dos Santos Farmacogenética: Influências sobre a farmacocinética e a farmacodinâmica Trabalho apresentado à disciplina de Trabalho de Conclusão de Curso do curso de Farmácia da FMU sob orientação da Profª Drª Walkyria Sigler. Aprovado pela banca examinadora constituída pelos professores: Profª Drª Walkyria Sigler FMU – orientadora Profª Drª Rogéria Maria Ventura FMU Profª Drª Maria Helena Belline Maruno FMU Agradeço meus amigos e colegas, minha família, meus pais, minha irmã, e todos que estiveram ao meu lado, antes e durante a graduação. Principalmente a meu noivo que me incentivou e me entendeu em todos os momentos. Agradeço aos professores que contribuíram para minha formação. Um agradecimento especial para minha orientadora, Walkyria, pelo apoio e compreensão, incentivo e estímulos. Muito obrigada! “A vida Para os erros há perdão; para os fracassos, chance; para os amores impossíveis, tempo... Não deixe que a saudade sufoque, que a rotina acomode, que o medo impeça de tentar. Desconfie do destino e acredite em você. Gaste mais horas realizando que sonhando, fazendo que planejando, vivendo que esperando Porque, embora quem quase morre esteja vivo, quem quase vive já morreu.” Fernando Pessoa Resumo As reações adversas a medicamentos são responsáveis por muitas hospitalizações e mesmo mortes em todo o mundo. As causas para esses efeitos podem ser: o estado de saúde do paciente, influências ambientais e características genéticas. A farmacogenética é uma área da farmacologia clinica que estuda como diferenças genéticas entre indivíduos podem afetar as respostas às drogas. Esta revisão objetiva demonstrar a importância desta ciência, trazendo uma base para o entendimento e mostrando os principais polimorfismos já estudados. As variações genéticas serão demonstradas divididas entre as que afetam a farmacocinética e a farmacodinâmica, sendo importante salientar que os polimorfismos mais comuns afetam as enzimas, existindo múltiplas cópias conhecidas de algumas delas. O conhecimento de que as pessoas respondem de formas diferentes aos mesmos medicamentos pode contribuir para a melhoria da terapêutica, aumentando sua eficácia e evitando reações. O seqüenciamento do genoma humano abriu as portas para que os cientistas e as empresas farmacêuticas trabalhassem a fim de descobrir o medicamento e as doses ideais para cada paciente, mas até agora, isso mostrou ser verdade apenas para alguns poucos paciente. Palavras-chave: Deficiência enzimática. Farmacogenética. Farmacogenômica. Farmacologia. Genética. Polimorfismo. Variação genética. Sumário 1. Introdução ............................................................................................................8 2. Fundamentos e conceitos de Genética..............................................................10 2.1. Síntese protéica ..........................................................................................14 2.2. Divisão celular.............................................................................................16 2.2.1. Mitose.......................................................................................................16 2.2.2. Meiose......................................................................................................18 2.3. Polimorfismo genético.................................................................................22 3. Anomalias cromossômicas.................................................................................24 3.1. Aberrações cromossômicas numéricas ......................................................25 3.2. Aberrações cromossômicas estruturais ......................................................27 3.2.1. Duplicação ...............................................................................................28 3.2.2. Deficiência................................................................................................28 3.2.3. Inversão ...................................................................................................29 3.2.4. Translocação............................................................................................29 3.3. Importância das alterações cromossômicas ...............................................30 4. Fundamentos e conceitos de Farmacologia ......................................................32 4.1. Farmacocinética..........................................................................................32 4.1.1. Absorção ..................................................................................................33 4.1.2. Distribuição ..............................................................................................35 4.1.3. Biotransformação .....................................................................................36 4.1.4. Excreção ..................................................................................................39 4.2. Farmacodinâmica........................................................................................40 5. Farmacogenética ...............................................................................................43 5.1. Principais variações genéticas que interferem na farmacocinética.............45 5.1.1. Sensibilidade ao suxametônio..................................................................46 5.1.2. Deficiência na hidroxilação da difenil-hidantoína .....................................48 5.1.3. Deficiência na CYP2C9............................................................................48 5.1.4. Polimorfismo na CYP2C19.......................................................................49 5.1.5. Deficiências na CYP2D6 ..........................................................................50 5.1.6. Polimorfismo da acetilação ......................................................................51 5.1.7. Polimorfismo da tiopurina metiltransferase (TPMT) .................................52 5.1.8. Acatalasemia............................................................................................53 5.1.9. Deficiência na acetaldeído-desidrogenase...............................................53 5.2. Principais variações genéticas que interferem na farmacodinâmica...........54 5.2.1.Variações no sitio de ação ........................................................................54 5.2.1.1. Sensibilidade ao propranolol .................................................................54 5.2.1.2. Polimorfismos dos receptores β2-adrenégicos ......................................54 5.2.1.3. Hipertermia maligna ..............................................................................555.2.1.4. Resistência a anticoagulantes cumarínicos ..........................................56 5.2.2. Variações que provocam reações adversas ............................................57 5.2.2.1. Deficiência na glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PD) .......................57 5.2.2.2. Deficiência de glutationa redutase ........................................................59 5.2.2.3. Deficiência de metemoglobina redutase ...............................................59 5.2.2.4. Ataques de porfirias ..............................................................................59 5.2.2.5. Glaucoma por corticosteróide ...............................................................60 5.3. Aplicações e perspectivas...........................................................................61 6. Ramos da Farmacogenética ..............................................................................62 6.1. Farmacogenética Cardiovascular................................................................62 6.2. Psicofarmacogenética.................................................................................64 6.2.1. Farmacogenética dos antidepressivos.................................................65 6.2.2. Farmacogenética dos antipsicóticos ....................................................66 7. Conclusão ..........................................................................................................67 8. Referências ........................................................................................................69 8 1. Introdução A farmacogenética é o campo de estudo que examina o modo como a diversidade genética nas populações influencia na eficácia e toxicidade de fármacos (FERREIRA, 2004). Pode abranger qualquer variação geneticamente determinada na resposta às drogas, por exemplo, o efeito dos barbitúricos no desencadeamento de episódios de porfiria em pessoas com o gene da porfiria intermitente aguda. A farmacogenética também pode ter um sentido mais restrito restringindo-se às variações genéticas reveladas apenas pela resposta às drogas ou outras substancia químicas (THOMPSON, McINNES, WILLARD, 1993a). O termo farmacogenômica pode ser, e nesta revisão será, utilizado como sinônimo de farmacogenética. Alguns autores os diferenciam, definindo farmacogenômica como um termo mais amplo que estuda o genoma e seus produtos e que objetiva o desenvolvimento de medicamentos. Podem ser diferenciados também relacionando a farmacogenética com foco em efeitos de genes isolados, enquanto que a farmacogenômica estuda simultaneamente vários genes e suas interações (METZGER; SOUZA-COSTA; TANUS-SANTOS, 2006). Nesta revisão serão abordados de forma geral alguns conceitos relacionados à farmacogenética buscando identificar genes que predisponham às doenças, modulem resposta aos medicamentos, afetem a farmacocinética e farmacodinâmica de medicamentos e estejam associados a reações adversas, ausência de efeito ou efeito tóxico de medicamentos (METZGER; SOUZA-COSTA; TANUS-SANTOS, 2006). São exemplos da influência dos fatores genéticos: • A succinilcolina que é metabolizada nos indivíduos com defeitos geneticamente determinados da pseudocolinesterase com apenas metade da rapidez com que é metabolizada nos indivíduos com a enzima funcionalmente normal. • O defeito dos acetiladores lentos da isoniazida e aminas semelhantes que é causado pela diminuição da síntese da enzima. • A ocorrência de hemólise induzida por drogas, onde ocorre deficiência da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (THOMPSON; McINNES, WILLARD, 1993; CORREIA, 2003a). 9 Esses e outros polimorfismos serão discutidos no capítulo 5 desta revisão. Antes serão revisados conceitos básicos de farmacologia e genética para facilitar a compreensão da ocorrência do aparecimento das variações genéticas e de que forma elas podem interferir na ação de um fármaco. As drogas apresentam-se em uma variedade de formas: comprimidos, cápsulas, soluções, suspensões, soluções injetáveis, entre outras. Podem ser administradas por vias de administração diferentes e após isso serão absorvidas para a corrente sangüínea a partir da via de administração, exceto as que foram injetadas diretamente no sangue. A saída da droga do sangue para os tecidos por ele perfundidos é a distribuição. Nos tecidos as drogas podem atingir outras células por vias de transporte diferentes. É chamado de metabolismo o conjunto de processos por meio dos quais as enzimas presentes dos tecidos, notadamente no fígado, catalisam a conversão química de uma droga para formas mais polares (mais solúveis em água), os metabólitos que são, geralmente, mais facilmente eliminados. Excreção é o processo que resulta na remoção da droga. Esse conjunto de processos constitui a farmacocinética, análise de todos os fatores de disposição das drogas: absorção, distribuição, metabolismo e excreção (TOFFOLETOO; MASSUD FILHO, 2007). A farmacodinâmica realiza o estudo quantitativo dos efeitos biológicos e terapêuticos das drogas, completando assim a tarefa da farmacocinética. Seus estudos demonstram o efeito terapêutico esperado da droga e, quando possível, o seu mecanismo de ação. Suas investigações pesquisam as respostas dos principais sistemas do corpo a fim de revelar efeitos de outra natureza ou mesmo tóxicos, visando especialmente efeitos adversos potenciais, tecidos particularmente atingidos e sistemas metabólicos de interesse em cada problema (SILVA, 1998b). Existem variações genéticas que atuam no transporte, na distribuição, nos sítios alvo e no metabolismo das drogas, todas são estudadas pela farmacogenética, mas as mais esclarecidas são as relacionadas ao metabolismo (GUTIÉRREZ, 2004). Para realização desta revisão foram consultados livros de farmacologia e de genética e artigos científicos extraídos de revistas e meios eletrônicos. 10 2. Fundamentos e conceitos de Genética Tudo que somos: a nossa aparência, os traços da personalidade, a maneira como reagimos nas relações com o mundo físico e outros seres, diferentes ou semelhantes, é o resultado de uma complexa interação, a nível molecular, celular e de organismo, entre o material biológico que herdamos de nossos genitores e o meio ambiente. (SALZANO, 1983, p.3) Em 1900 ocorreu o principal marco para o estudo da genética humana: a redescoberta das leis de Mendel e sua confirmação. O trabalho de Mendel foi realizado em 1865, com experimentos de cruzamentos de ervilhas, a contagem da prole e a interpretação dos resultados, em que utilizava um raciocínio combinatório. O resultado apontava para a combinação livre de unidades básicas, fundando o conceito de gene (PASTERNANK, 2002; VOGEL; MOTULSKY, 2000a). Figura 1: estrutura do DNA. Fonte: Objetivo (1996-2007) 11 Gene, a unidade da herança genética, é definido, atualmente, como uma porção determinada de DNA (ácido desoxirribonucléico), responsável pela formação de uma proteína especifica, o de DNA transporta a informação genética de célula para célula e dos pais para os filhos (OTTO;OTTO; FROTA-PESSOA,1998b; SALZANO, 1983). Define-se DNA como uma macromolécula, cujos monômeros são os nucleotídeos compostos por três tipos de unidades: a desoxirribose, que é um açúcar, um radical fosfato e uma base nitrogenada. A informação genética está contida, em código, na seqüência das bases timina (T), adenina (A), citosina (A) e guanina (G), as bases nitrogenadas que compõe o DNA. A associação entre as duas cadeias que formam o DNA ocorre através 2 pontes de hidrogênio quando A se liga com T e 3 pontesde hidrogênio quando G se liga com C (FARAH, 1997a; OTTO; OTTO; FROTA-PESSOA, 1998b; SALZANO, 1983). Nos seres humanos, assim como nos demais organismos superiores, o DNA encontra-se associado com material protéico, formando unidades chamadas de cromossomos, que são encontrados no interior do núcleo celular. Cada cromossomo contém uma única molécula helicoidal, uma dupla-fita de DNA, enrolada em torno desse material protéico, que são moléculas de proteínas chamadas histonas. Um cromossomo apresenta uma constrição primaria, chamada de centrômero, que o divide em dois braços, sendo um mais curto, chamado de “p” e outro mais longo, chamado de “q”. São denominados telômeros as extremidades terminais de cada cromossomo e têm a função de lacrar as pontas dos braços, mantendo a estabilidade e integridade da estrutura. Os telômeros são formados de seqüências repetidas de DNA na forma TTAGGG e possuem também, como função, agir como um relógio do ciclo celular, controlando o número de mitoses que a célula deve sofrer. A cada ciclo mitótico, o cromossomo perde uma seqüência TTAGGG (BORGES-OSÓRIO; ROBINSON, 2001; PASTERNAK, 2002; GRIFFITHS et al., 2002a; OTTO; OTTO; FROTA-PESSOA,1998b; SALZANO, 1983). 12 Figura 2. Cromossomo. Fonte: LALUCE et al. [2006?] Os cromossomos são classificados morfologicamente quanto à posição do centrômero como: • Metacêntrico – centrômero localizado centralmente • Aerocêntrico - localizado próximo à extremidade • Sub-metacêntrico – em posição intermediária • Telocêntrico – posição terminal. Essa morfologia não é encontrada nos cromossomos humanos (BORGES-OSÓRIO; ROBINSON, 2001). Figura 3 – Tipos de cromossomo quanto a posição do centrômero. Fonte: TASSO, et. al.(1995) É chamada de lócus a localização precisa em um cromossomo, podendo ser ocupada por um gene ou uma seqüência de DNA não codificada (CARVALHO, 1987b FARAH, 1997a). 13 O genoma humano, conjunto total dos genes existentes em todos os 23 cromossomos, apresenta cerca de 100.000 genes funcionais diferentes e entre eles existem grandes regiões de DNA inativo, não sendo utilizado para codificação de proteínas. Essas regiões são chamadas de íntrons; as porções de DNA com a informação codificada são os éxons (FARAH, 1997b; OTTO; OTTO; FROTA- PESSOA, 1998b). A constituição genética, determinada no momento da fecundação é chamada de genótipo, sendo designada por letras, por exemplo, Aa. Onde a letra em maiúsculo representa gene dominante e a letra minúscula representa gene recessividade. Em indivíduos heterozigotos (Aa), que possuem determinado par de genes diferentes, é denominado dominante o gene que se manifesta. Os genes recessivos para expressar sua característica precisam se apresentar em homozigose, ou seja, dois genes iguais em determinado par (CARVALHO, 1987a FARAH, 1997a). O conjunto de características observadas no ser vivo, podendo ser composto por milhares delas, em níveis bioquímico, fisiológico ou morfológico é chamado de Fenótipo (CARVALHO, 1987b FARAH, 1997a). Outro ácido nucléico importante para as células é o RNA, ácido ribonucléico que é semelhante ao DNA, mas apresenta funções distintas. No RNA as bases nitrogenadas são Adenina, Guanina, Citosina e Uracila. O açúcar, uma pentose, é a ribose que difere da desoxirribose por apresentar uma hidroxila ligada ao carbono 2’. Outra diferença entre as duas moléculas e apresentação em fita simples no RNA, enquanto no DHA forma-se uma dupla-fita (CARVALHO, 1987b; FARAH, 1997a). São funções do RNA: • Copiar a informação contida no DNA e transportá-la para o citoplasma. Realizada pelo RNA mensageiro (mRNA) • Ligar-se a proteínas para compor os ribossomos, organelas nas quais acontece a síntese protéica. Função desempenha pelo RNA ribossômico (rRNA) • Carregar, no citoplasma, os aminoácidos que se juntarão para formar uma nova cadeia dipeptídica, função cujo responsável é o RNA transportador (tRNA) (CARVALHO, 1987b FARAH, 1997b). 14 Em todos os seres vivos a molécula de DNA participa de dois processos distintos, a duplicação, formando outra molécula idêntica, ou a transcrição, formando RNA, ácido ribonucléico (SALZANO, 1983). 2.1. Síntese protéica As células percebem a necessidade de síntese de alguma proteína em particular por meio de um sinal intra ou extracelular. Um dos controles para a célula perceber o momento no qual um determinado gene deve ser expresso e em que intensidade é feito por seqüências promotoras e genes reguladores (FARAH, 1997b; GRIFFITHS et al., 2001b). Um gene é um segmento de DNA com a informação completa sobre a seqüência de aminoácidos para síntese de uma cadeia polipeptídica especifica. Uma proteína pode ser codificada por um ou mais genes (GRIFFITHS et al., 2001a). A síntese de proteínas ocorre através de três etapas: transcrição, processamento e tradução. Mas antes da transferência da informação para o RNA é necessária a abertura da dupla hélice do DNA para separar as cadeias de polinucleotídeos. A partir daí ocorre a formação de uma cadeia de RNA, com as bases nitrogenadas unindo-se de forma complementar e se emparelhando com a seqüência da cadeia de DNA. Essa síntese do RNA a partir de um molde de DNA é denominada transcrição. Considerando-se a diferença entre esses dois ácidos nucléicos com relação às bases nitrogenadas conclui-se que um segmento de DNA que serve de molde e apresenta, por exemplo, a seqüência TCAGGTAGTGAATTA, resulta em um RNA transcrito com a seqüência AGUCCAUCACUUAAU. Esta etapa ocorre em três estágios, iniciação, alongamento e finalização, sendo um processo catalisado pela enzima RNA polimerase (BEIGUELMANN, 1982; FARAH, 1997b; GRIFFITHS et al., 2001b). Na etapa denominada processamento ocorre a retirada das porções correspondentes aos íntrons, a adição de um revestimento denominado Cap, de uma seqüência de bases AAUAAA na extremidade 3’ e de uma seqüência de 150 a 200 nucleotídeos de adenina, formando o RNA mensageiro maduro, efetivamente capaz de carregar a mensagem para o citoplasma (FARAH, 1997b; GRIFFITHS et al., 2001b). 15 Figura 4 – síntese protéica. Fonte: BARROS (2003) A tradução ocorre no citoplasma, após ligação do RNA mensageiro ao ribossomo, com a participação do RNA transportador, que traduz o código genético em aminoácidos, onde cada conjunto com três bases determina a entrada de um aminoácido especifico, formando uma nova cadeia peptídica (figura 5). Quando está completa a cadeia se desprende do ribossomo (FARAH, 1997b; GRIFFITHS et al., 2001b). Figura 5: Código Genético. Cada trinca de bases é traduzida para um diferente aminoácido (UFPE, 2003). 16 Os 26 mil genes que possuem funções moleculares produzem outras tantas proteínas, das quais 41% têm funções desconhecidas ainda. Já estão identificadas milhares de proteínas com funções específicas: 2308 enzimas de ácidos nucléicos; 902 protooncogenes; 1543 proteínas receptoras de membranas; 876 proteínas cito esqueléticas e 264 imunoglobulinas (CRUZ-COKE, 2001). 2.2. Divisão celular Mitose e meiose são dois mecanismos de divisão diferentes usados pelas células para se dividirem (BORGES-OSÓRIO; ROBINSON, 2001). 2.2.1. Mitose Mitose é a divisão nuclear associada à divisão das células somáticas, células dos corpos dos eucariontes que não são destinadas a se tornarem células sexuais. Ela garante o crescimento dos organismos e a reposição das células mortas com transmissão do material genético de modo constante. Neste processo os núcleos das células filhas são exatamente iguaisaos da célula mãe, com o mesmo número de cromossomos e a mesma informação genética (BORGES-OSÓRIO; ROBINSON, 2001; CARVALHO, 1987b; FARAH, 1997b; GRIFFITHS et al., 2001c). Para ocorrer a divisão, a molécula de DNA precisa duplicar-se, por isso, o processo inicia-se com a separação das cadeias que servem de molde para a produção de uma cadeia complementar formando, agora, as cromátides-irmãs que ficam ligadas pelo centrômero. O centrômero divide-se e as cromátides se separam e cada uma delas dirige-se a uma das células que se originarão. Este processo é contínuo, mas seu estudo é feito por fases (BORGES-OSÓRIO; ROBINSON, 2001; CARVALHO, 1987b; FARAH, 1997b; GRIFFITHS et al., 2002c). • Prófase: Ocorre duplicação do centro celular no citoplasma, condensação das cromátides-irmãs, dissolução da membrana nuclear e formação do fuso acromático. 17 • Metáfase: Nesta etapa as cromátides estão na zona equatorial da célula com o máximo de condensação, sendo a melhor fase para visualização do material genético. O fuso acromático também está mais visível e tem-se início a separação das cromátides. • Anáfase: Os centrômeros se dividem, ocorre separação total das cromátides que passam a se chamar cromossomos-filhos. Os centrômeros estão ligados aos microtúbulos do fuso e auxiliam os cromossomos-filhos a migrarem cada um para um pólo. • Telófase: Fase em que ocorre a descondensação dos cromossomos, a desintegração dos fusos, a formação de novas membranas nucleares e a divisão da célula com distribuição das organelas entre as duas novas células formadas. Posteriormente, nas fases G1 e S do ciclo seguinte o único centríolo fora de cada núcleo determina a produção de um segundo centríolo (BORGES-OSÓRIO; ROBINSON, 2001; CARVALHO, 1987b; FARAH, 1997b; GRIFFITHS et al., 2001c, PASTERNAK, 2002). O período entre duas divisões é chamado de Interfase, onde o núcleo possui DNA difuso e uniformemente distribuído, onde os cromossomos não são visíveis. Esta fase divide-se em G1, S e G2. G1 - fase em que a célula está com intensa atividade metabólica, com muita síntese de proteínas, RNA e produção de mais organelas. Ocorre aumento de tamanho do núcleo e do citoplasma. S - Continua a síntese de proteínas e RNA, mas esta etapa é caracterizada pela síntese de DNA. G2 – Ocorre síntese de RNA e proteínas (CARVALHO, 1987b; LIMA, 1996a) Erros ocasionais no processo mitótico podem resultar em células com alterações numéricas, como veremos no capítulo 3 desta revisão (OTTO; OTTO; FROTA-PESSOA, 1998a). 18 2.2.2. Meiose Os seres humanos possuem 46 cromossomos em cada núcleo de célula somática, sob a forma de 23 pares que na meiose é reduzido a um de cada par, ou seja, 23 cromossomos, para a formação das células sexuais, espermatozóide e óvulo. Pode-se dizer que, através da meiose, o número cromossômico diplóide (simbolizado por 2n) das células somáticas é reduzido a um número haplóide (representado por n) nos gametas. Estas células também são chamadas de meiócitos. Na espécie humana 2n=46 e n=23 (BEIGUELMAN, 1982; FARAH, 1997b). Este tipo de divisão ocorre com as células de todos os organismos com reprodução sexuada, onde o individuo é formado a partir de uma célula ovo, que resulta da fusão de dois gametas, sendo um de origem materna e outro de origem paterna (FARAH, 1997b; GRIFFITHS et al., 2001c). Na meiose ocorrem dois ciclos sucessivos de divisão celular denominados Meiose I e Meiose II, onde ocorre uma divisão cromossômica para duas divisões celulares, e dão origem a quatro células-filhas, denominadas produtos da meiose. Antes da meiose ocorre a Interfase, chamada de Fase S, onde ocorre a duplicação do DNA, formando-se, no núcleo celular, as cromátides-irmãs (BORGES-OSÓRIO; ROBINSON, 2001; GRIFFITHS et al., 2001c; PASTERNAK, 2002). A Meiose I, chamada de Segregação reducional, pode ser subdividida em quatro fases, denominadas: Prófase I, Metáfase I, Anáfase I e Telófase I. • Prófase I É a fase mais longa e complicada de todo o processo, durante o qual é possível a distinção de cinco estágios que são designados por nomes gregos e sugerem o aspecto que os cromossomos vão adquirindo durante o desenrolar dessa fase. Os estágios são: o Leptóteno: ocorre condensação dos cromossomos duplicados; o Zigóteno: emparelhamento entre os cromossomos homólogos que estão unidos em regiões chamadas Sinapses. Dois centrômeros dão origem a quatro cromátides, duas de cada cromossomo – cromossomos bivalentes; 19 o Paquíteno: a condensação continua, ocorre permuta, isto é, troca de pedaços iguais de cromátides homólogas, também chamada de crossing over; o Diplóteno: afastamento dos cromossomos homólogos que ficam presos pelos quiasmas, regiões onde ocorreram permutas, estes migram para a zona terminal do cromossomo; o Diacinese: os quiasmas completam seu movimento de terminalização, os bivalentes migram para a zona equatorial do núcleo e ocorre o desaparecimento do nucléolo. • Metáfase I Desaparecimento da membrana nuclear, a condensação dos cromossomos bivalentes continua e eles se alinham na região equatorial presos ao fuso. • Anáfase I Separação dos cromossomos homólogos que se dirigem para pólos opostos. • Telófase I Reconstrução da membrana nuclear. Cada cromossomo tem duas cromátides. Ocorre citocinese formando duas células filhas, em caso de células humanas, com cada núcleo contendo 23 cromossomos duplicados (BEIGUELMAN, 1982; BORGES-OSÓRIO; ROBINSON, 2001; CARVALHO, 1987b). A passagem para a Meiose II, chamada de Segregação equatorial, ocorre diretamente, sem interfase. A prófase II é praticamente inexistente, pois os cromossomos permanecem condensados ao final da Telófase I. • Metáfase II Migração dos cromossomos para o plano equatorial da célula, onde se prendem ao fuso pelo centrômero. 20 • Anáfase II Divisão dos centrômeros, separando os cromossomos e cada cromátide migra para uma extremidade da célula. Os cromossomos filhos se reúnem e desespiralizam. • Telófase II Formação de membrana nuclear ao redor de cada conjunto haplóide. Ocorre a citocinese resultando em quatro células com metade do numero de cromossomos das células somáticas do individuo (BEIGUELMAN, 1982; BORGES-OSÓRIO; ROBINSON, 2001; CARVALHO, 1987b). 21 Figura 6: Comparação entre mitose e meiose. Fonte: SOUZA (2007) 22 2.3. Polimorfismo genético A ocorrência de múltiplos alelos num lócus, onde pelo menos dois alelos aparecem com freqüência superior a 1% é chamada de polimorfismo genético. Quando esses alelos apresentam freqüência inferior a !% denominam-se variantes raras (LIMA, 1996a). Considerando-se que entre os indivíduos de uma mesma espécie percebe-se mais semelhanças do que diferenças, podemos erroneamente acreditar que as variações ocorridas com as mutações são escassas. Considerando que possuímos 100.000 genes produtores de proteínas e acreditando existir pelo menos dois alelos diferentes conclui-se que pode existir um número inimaginável de combinações entre eles. O polimorfismo reflete o acúmulo de mutações ao longo de milhares de gerações, sendo considerado um conjunto de pequenas variações normais na seqüência de nucleotídeos espalhadas em centenas de milhares de posições diferentes através do genoma (FARAH, 1982b; LIMA, 1996a). O genoma humano possui cerca de 30.000 genes, com um total de 3,12 bilhões de nucleotídeos, os quais apresentam mais de dois milhões de polimorfismo que podemocorrer com freqüência de 1 a cada 1.250 pares de bases (METZGER; SOUZA-COSTA; TANUS-SANTOS, 2006). Segundo Thompson, McInnes e Willard (1993b) o polimorfismo é um fenômeno difuso e universal documentado em muitos lócus, sendo responsável pela codificação de muitos tipos diferentes de produtos protéicos. Em muitas proteínas existentes em população variada verifica-se a existência de alelos mutantes, por isso apresentam diversas formas distinguíveis. A variação genética e os polimorfismos ajudam a elucidar o considerável grau de diversidade individual que deve existir entre os membros de uma população em sua constituição de enzimas e outros produtos gênicos. Considerando-se que os diferentes genótipos que refletem cada um dos milhares de polimorfismos existentes são herdados de modo mais ou menos independente uns dos outros, é claro que deve existir um número quase infinito de combinações de genótipos, e fenótipos. Como os produtos de muitas vias metabólicas codificadas interagem, pode-se concluir plausivelmente que cada indivíduo, seja qual for seu estado de saúde, possui uma constituição química geneticamente singular e assim responde de 23 maneira única a influencias ambientais, alimentares e farmacológicas (THOMPSON; MCINNES; WILLARD; 1993b). As diferenças quanto às respostas terapêuticas entre os indivíduos geralmente estão associadas com polimorfismos genéticos presentes em genes que afetam a farmacocinética ou a farmacodinâmica. Estes polimorfismos podem alterar a expressão e/ou a atividade de sítios de ligação de medicamentos, por afetarem a estabilidade do RNA mensageiro correspondente, ou modificarem a estrutura conformacional da proteína correspondente (METZGER; SOUZA-COSTA; TANUS- SANTOS, 2006). Existem polimorfismos identificados em mais de 30 enzimas que metabolizam drogas em seres humanos. Varias delas com marcantes diferenças étnicas e muitas das quais, causam alterações funcionais nas proteínas que codificam e portanto no metabolismo de drogas (GUTIÉRREZ, 2004). 24 3. Anomalias cromossômicas Os processos explicados anteriormente são sempre iniciados com a duplicação do DNA e ocorrem repetidamente por inúmeras vezes, por isso, estão sujeitos a erros que tendem a ser reparados pelo sistema de reparo do DNA. (FARAH, 1997b) Anomalias, também chamadas de mutações ou aberrações, ocorrem quando algum erro, eventualmente, escapam desse sistema e são responsáveis por abortos espontâneos, óbitos perinatais e por uma incidência de 0,54 % entre os recém nascidos, sendo a maior parte aberrações associadas a anomalias do desenvolvimento físico e/ou mental (RUDAK et al., 1978 apud BEIGUELMAN, 1982). Define-se mutação por modificação súbita e hereditária no material genético, considerando-se também o processo pelo qual essa modificação ocorreu. É considerada a fonte básica para a variabilidade genética, fornecendo matéria-prima para a evolução (GARDNER; SNUSTAD, 1986). Uma mutação pode ocorrer, por exemplo, se durante a duplicação do DNA uma base Adenina, se alinha com uma base Citosina, quando o correto seria com uma Timina. Isso ocorrendo em um gene é possível que a posição correspondente na proteína seja ocupada por um aminoácido diferente, resultando em uma molécula com a forma alterada, que pode ser incapaz de desenvolver sua função, seja ela uma ação enzimática ou estrutural. A região onde ocorre a mutação pode interferir no resultado, tornando-a mais evidente, gerando um polipeptídio totalmente incorreto quando ocorre no início da molécula. Um cromossomo com alteração no final da seqüência forma um polipeptídio menos aberrante (FARAH, 1997b). Os principais processos que podem gerar mutação são: • A substituição de uma base por outra; • Ocorrência de análogos de bases – são compostos com estrutura molecular muito semelhante aos de uma das bases que podem se incorporar ao DNA; • Remoções ou adições de bases; • Modificações tautoméricas – são alterações raras nas formas das bases que desencadeiam pareamentos errados (THOMPSON; MCINNES; WILLARD, 1993c). 25 Pode ocorrer uma alteração no gene muito pequena, não afetando os cromossomos de maneira visível, sendo chamada de mutação gênica ou mutação de ponto. São chamadas de mutações cromossômicas as alterações visíveis ao microscópio óptico, alterando seu número ou estrutura. Costuma-se usar o termo mutação para designar a mutação de ponto e os termos aberração ou alteração cromossômica para as que envolvem alterações maiores (CARVALHO, 1987c). Quando ocorre uma mutação com ou sem uma causa conhecida ela é chamada de mutação espontânea, sendo resultante de um baixo nível de erros metabólicos herdados ou ser normalmente causada por agentes mutagênicos presentes no ambiente. Mutação induzida é aquela que resulta da exposição de organismos a agentes mutagênicos, tais como radiação ionizante, a luz ultravioleta ou outros agentes químicos que reagem com o DNA (GARDNER, SNUSTAD, 1986). As aberrações cromossômicas podem ser classificadas conforme o modo pelo qual se originaram, formando dois outros grupos: pré-zigóticas, que são decorrentes de erros na gametogênese, e pós-zigóticas acontecidos depois da formação do zigoto por erros mitóticos (BEIGUELMAN, 1982). Existe outra classificação em numéricas, que incluem casos em que há aumento ou diminuição do número cariotípico normal da espécie humana, ou estruturais, que são relacionadas a alterações na estrutura de um ou mais cromossomos (BEIGUELMAN, 1982). 3.1. Aberrações cromossômicas numéricas A ocorrência de qualquer número cromossômico diferente do normal na espécie e chamado de heteroploidia. Aberrações cromossômicas relacionadas ao aumento ou diminuição de todos os pares cromossômicos são chamadas aneuploidias, euploidias são alterações numéricas em pelo menos um conjunto cromossômico haplóide (BEIGUELMAN, 1982; THOMPSON; MCINNES; WILLARD, 1993c). As aneuploidias são causadas pela não separação de um ou mais cromossomos para as células filhas durante a meiose ou as mitoses do zigoto e podem ser classificadas como (BEIGUELMAN, 1982; LIMA, 1996b): 26 • Hipodiploidia: diminuição do numero cromossômico. Quando determinado cromossomo não possui homologo na célula trata-se de uma monossomia. A ausência dos dois elementos do para é chamada de nulissomia. • Hiperdiploidia: aumento do numero de cromossomos homólogos, subdivida conforme a quantidade de homólogos em trissomia, tetrassomia, etc. (BEIGUELMAN, 1982). Figura 7: Aneuploidas. Fonte: TASSO (1995) Em todos os tipos de aneuploidia as alterações fenotípicas são tão drásticas que os aneuploides humanos apresentam valor adaptativo muito baixo ou mesmo nulo (CARVALHO, 1987d). Nas euploidias as células podem apresentar numero cromossômico 3n, 4n, 8n, etc. sendo, então, classificada em triploides, tetraploides, octoploides, etc. Para que ocorra é necessária a perda ou ganho de genomas completos (BEIGUELMAN, 1982; LIMA, 1996b). Raramente verifica-se euploidias em animais que, por se reproduzirem de forma sexuada na qual a ocorrência do processo de meiose para produção dos gametas é obrigatória. No homem, em casos de aborto, é possível observar presença de células 3n e 4n. Outras células poliplóides são verificadas na medula óssea, no fígado e em rins normais ou em células de tumores sólidos e em leucemias (CARVALHO, 1987d). 27 Em outros seres vivos, como as plantas, por exemplo, as euploidias são bastante comuns e importantes para os mecanismos evolutivos (LIMA, 1996b). 3.2. Aberraçõescromossômicas estruturais Um cromossomo que sofre uma ruptura em sua estrutura pode ser reparado com uma re-ligação ou desencadear alterações morfológicas. Essas quebras podem ser causadas por fatores externos, como, radiação, infecção (principalmente por vírus), produtos químicos (como medicamentos, por exemplo), alterações metabólicas presentes em tecidos tumorais e por diversas variações do metabolismo (BEIGUELMAN, 1982). Quando essas rupturas ocorrem antes do período S da Interfase são chamadas de quebras isocromatídicas e dão origem a duas cromátides com fraturas. As quebras cromatídicas são as que ocorreram depois do período S e afetam apenas uma das cromátides (CARVALHO, 1987e). Durante uma análise microscópica de cromossomos corados com as técnicas de coloração clássica pode-se verificar descontinuidades, chamadas de falhas acromáticas, que são consideradas por alguns pesquisadores como aberrações cromossômicas estruturais, sendo locais com fraturas ou predispostos a essas lesões. Outros pesquisadores acreditam que são apenas falhas na coloração (BEIGUELMAN, 1982). As quebras podem ser diferenciadas das falhas através da largura e da posição em relação ao eixo do cromossomo. Para ser considerada uma quebra a descontinuidade precisa ser mais larga que a espessura de uma cromátide ou possuir os fragmentos deslocados do eixo cromossômico (BEIGUELMAN, 1982). As aberrações estruturais são divididas em dois grupos principais. Um com as modificações nos números de genes, incluindo as deficiências e as duplicações. Outro com as alterações no arranjo dos genes, sendo inversão e translocação os tipos existentes (CARVALHO, 1987e). 28 3.2.1. Duplicação Tipos mais comuns de aberrações e também os menos prejudiciais, sendo um mecanismo evolutivo importante, onde um gene duplicado pode sofrer mutação e os novos genes criados podem adquirir novas funções (LIMA, 1996b). 3.2.2. Deficiência Figura 8: Deficiência cromossômica. Fonte: TASSO (1995). Alteração na qual ocorre perda de material genético, sendo também chamada de deleção. É conseqüência de ocorrência de duas fraturas, ocorrendo perda de um segmento, e resultando em um cromossomo com braço mais curto (BELGUEMAN, 1982; LIMA, 1996b). Pode ser classificada como intercalar, que gera monossomia parcial, ou terminal, que resulta em monossomia completa quando não ocorre re-soldadura do fragmento. Os fragmentos sem centrômero não podem se prender ao fuso, não se movimentam na anáfase e provavelmente se perdem (BELGUEMAN, 1982; GRIFFITHS et al., 2001c; LIMA, 1996b). Suas conseqüências dependem da quantidade e qualidade do material perdido, mas, geralmente são danosas com efeitos severos. Pode ser subdivida, quanto quantidade de material perdida, em deleção intragênica ou multigênica. Deleção intragênica é pequena, podendo inativar o gene ou raramente ser viável. Na deleção multigênica ocorre remoção de dois ou mais genes, sendo geralmente letal (GRIFFITHS et al., 2001c). 29 A ocorrência de deficiência terminal em dois braços de um cromossomo pode originar um cromossomo em anel, onde as extremidades livres fraturadas se unem. Outra alteração estrutural resultante da deficiência é o isocromossomo que possui deficiência total de um dos braços e duplicação completa do outro, apresentando-se com aspecto metacêntrico, Forma-se quando durante a divisão celular o centrômero se divide transversalmente (BEIGUELMAN, 1982). 3.2.3. Inversão Soldadura de um segmento cromossômico em posição invertida. É classificada como paracêntrica quando ocorre em um mesmo braço ou pericêntrica quando o centrômero está no fragmento invertido. Quando um cromossomo com inversão se emparelha com seu homologo, para realização da gametogênese, é necessária a formação de alças. A ocorrência de permuta entre os homólogos pode originar cromossomos gaméticos normais, invertidos ou anormais – dicêntrico, acêntrico, com deficiência ou com duplicação (BEIGUELMAN, 1982). 3.2.4. Translocação Soldadura de um segmento cromossômico em uma região fraturada de outro cromossomo, sendo necessário que dois cromossomos sofram quebras para que isso ocorra. É classificada em quatro grupos: inserção, translocação recíproca, translocação robertsoniana ou translocação em tandem (LIMA, 1996b). • Inserção Ocorre quando um dos cromossomos sofre duas quebras e o fragmento une- se em um cromossomo que sofre uma quebra. Pode ser invertida ou direta, de acordo com a posição do fragmento. Quando ocorre em cromossomos mitóticos não devem provocar manifestações celulares alteradas, pois não há perda de material genético, sendo chamada de translocação equilibrada. Se ocorrer a transferência de um segmento entre cromátides homologas a inserção resultará em um cromossomo deficiente e outro com duplicação, sendo chamada de translocação desequilibrada (BEIGUELMAN, 1982). 30 • Translocação recíproca Para ocorrer necessita apenas de uma quebra em cada cromossomo e da re- ligação de forma cruzada, podendo originar, principalmente, cromossomos que se degenerarão. Excepcionalmente, um cromossomo dicentrico formado não se degenera porque apenas um de seus centrômeros é funcional. Quando esse tipo de translocação origina um cromossomo monocêntrico ele poderá apresentar alteração na sua forma original, mas, nesse caso, é viável, pois as alterações cromossômicas afetam apenas a distribuição do material genético nos cromossomos, que continuam monocêntricos (BEIGUELMAN, 1982; LIMA, 1996b). • Translocação robertsoniana Também é chamada de fusão centrica, ocorre entre autossomos acrocêntricos, onde aconteceram fraturas em regiões muito próximas ao centrômero. Ocorre formação de um pequeno fragmento acêntrico que se perde, havendo, perda dos braços curtos. O portador dessa alteração pode apresentar fenótipo normal (LIMA, 1996b). • Translocação em tandem Trata-se de um tipo de translocação recíproca em que os braços maiores de dois autossomos aerocêntricos são afetados, sendo que um sofre quebra na região proximal e outro numa região distal do centrômero (BEIGUELMAN, 1982). ; 3.3. Importância das alterações cromossômicas As alterações cromossômicas em que ocorrem duplicações ou deficiências podem gerar proteínas com seqüência completamente incorreta porque, a partir do ponto onde ocorreu, a leitura das trincas será alterada. Mesmo a alteração em um único nucleotídeo na fita de DNA pode causar uma doença porque a proteína formada a partir desse material genético terá um aminoácido diferente, tornando-se um produto diferente do necessário. Esse é o mecanismo da anemia falciforme (FARAH, 1982b). 31 Cerca de 25% das alterações em gene permitem a codificação correta dos aminoácidos correspondentes, sendo chamadas de mutações silenciosas (CARVALHO, 1987c). As mutações ocorrem ao acaso, sem qualquer planejamento e podem ser, na maioria dos casos, prejudiciais, ou benéficas para a célula, para o indivíduo ou mesmo para a espécie, sendo que podem ser transmitidas para as novas gerações. Um benefício pode ser, por exemplo, a síntese de uma nova enzima na célula, tornando um organismo ainda mais eficiente para sobreviver num determinado meio ambiente (FARAH, 1982b). 32 4. Fundamentos e conceitos de Farmacologia A Farmacologia é o estudo do modo pelo qual a função dos sistemas biológicos é afetada por agentes químicos, através dela são estudados aspectos bioquímicos e fisiológicos dos efeitos dos fármacos, incluindo a fonte, absorção, distribuição, metabolismo,eliminação, toxicidade e mecanismos específicos. Compreende duas áreas principais: a Farmacocinética e a Farmacodinâmica, que descrevem a relação entre a dose administrada a um paciente e a utilidade que esta droga tem no tratamento da doença (BENET, 1996; JACOB, 1998; RANG; DALE; RITTER, 2001a; ZANINI; OGA, 1994). Uma de suas funções é o estudo de novos medicamentos, desvendando sua atuação e movimentação no organismo, demonstrando efeitos farmacológicos em diversos modelos, apontando os prováveis efeitos terapêuticos e os potencialmente adversos (FUCHS; WANNAMACHER, 1998a). Além do estudo da movimentação do fármaco no organismo e de sua ação, a farmacologia abrange o conhecimento da história, da origem, das propriedades físico-químicas, da composição, dos efeitos bioquímicos e fisiológicos e dos mecanismos de ação dos fármacos. Sendo fármaco definido como qualquer agente químico que afeta os processos da vida, modificando ou explorando os sistemas fisiológicos ou estados patológicos para o benefício do receptor (BENET, 1996; ZANINI; OGA, 1994). O conjunto das principais características físicas e químicas do medicamento, relacionadas com a sua aparência e outros aspectos ligados à liberação do princípio ativo, é chamado de forma farmacêutica. São exemplos de forma farmacêutica: comprimido, drágea, cápsula, xarope, suspensão, solução, creme, pomada, pó, emulsão, etc. (ZANINI; OGA, 1994). 4.1. Farmacocinética Farmacocinética é o estudo do que o organismo faz com a droga, o destino e o processamento, incluindo a administração, a absorção, a distribuição e a excreção. Essas características são muito utilizadas para a elaboração dos esquemas racionais de posologia, utilizando modelos e cálculos matemáticos para 33 quantificação (JACOB; 1998; FUCHS; WANNAMACHER, 1998b, ZANINI; OGA, 1994). A administração pode ocorrer por diferentes vias que são determinadas pelas propriedades do fármaco e pelos objetivos terapêuticos. As principais vias são: • Enteral: compreendendo via oral, sublingual, retal, entre outras. • Parenteral: onde vias intravasculares, intramusculares e subcutâneas são as principais. • Outras vias utilizadas: inalação, via intranasal, intratecal, tópica e transdérmicas (GIESBRECHT; ZYNGIER, 1994; HOWLAND; MYCEK, 2007). 4.1.1. Absorção Processo que corresponde à transferência de um fármaco do seu local de administração para a corrente sangüínea, influenciando no início e na magnitude do efeito farmacológico. Para realização desse transporte são importantes várias propriedades físico-químicas do fármaco, tais como solubilidade, grau de ionização, coeficiente de partição óleo/água e tamanho da molécula (FUCHS; WANNAMACHER, 1998b; GIESBRECHT; ZYNGIER, 1994, HOWLAND; MYCEK, 2007). Quando ocorre administração por via intravascular não ocorre absorção, já que a droga é colocada diretamente na corrente sangüínea. A maioria das administrações ocorre por via oral, sendo no estômago e, principalmente, no intestino que a absorção acontece com maior intensidade (GIESBRECHT; ZYNGIER, 1994). A absorção depende dos movimentos através das membranas, e os principais mecanismos para realização desse processo são (FUCHS; WANNAMACHER, 1998b): • Difusão passiva: Mecanismo no qual as substâncias penetram nas células, na forma não ionizada, através da membrana lipídica, dependendo, principalmente, do gradiente de concentração entre os dois meios. Pode ser realizada de duas formas: a difusão simples e a filtração. Na difusão simples a passagem depende do pH do meio. Na filtração as moléculas de baixo peso molecular, polares ou apolares, se difundem 34 através da membrana por poros ou canais. Nos dois tipos de difusão passiva a movimentação cessa quando a concentração da substância permeante for igual nos dois lados da membrana (FUCHS; WANNAMACHER, 1998b; GIESBRECHT; ZYNGIER, 1994). Nesse processo não existe ação de transportadores, não ocorre saturação e apresenta baixa especificidade (HOWLAND; MYCEK, 2007). • Difusão facilitada Mecanismo de transferência da membrana mediada por transportadores, onde para atravessar a membrana a substância liga-se a proteínas carregadoras, formando um complexo. Este processo ocorre a favor do gradiente de concentração, por isso sem dispêndio de energia. A velocidade da passagem é maior do que na difusão simples (FUCHS; WANNAMACHER, 1998b). Trata-se de um processo saturável, podendo existir aumento das concentrações externas sem aumentar a velocidade do fluxo, pois depende da quantidade de transportadores presentes (JACOB, 1998). • Difusão por troca Processo semelhante à difusão facilitada onde também existe a participação de carreadores que retornam ao lado original para transportar outra molécula (FUCHS; WANNAMACHER, 1998b). • Transporte ativo Tipo de movimentação contra o gradiente de concentração, gradiente elétrico ou a combinação de ambos. Ocorre gasto de energia na forma de hidrólise de ATP. Esse mecanismo apresenta alto grau de seletividade entre fármaco e carregador, podendo ocorrer competição entre substâncias endógenas ou exógenas similares ao fármaco ou ser bloqueado por inibidores metabólicos que interferem na produção de energia. O transporte ativo também é saturável (FUCHS; WANNAMACHER, 1998b; GIESBRECHT; ZYNGIER, 1994). A endocitose é outro tipo de processo ativo, que acontece quando a membrana engloba partículas, que podem ser sólidas ou líquidas, sofre invaginação 35 e estrangulamento. No interior da célula forma-se vacúolos que permanecem na própria membrana ou aloja-se no citoplasma. É considerado processo ativo por exigir energia celular para sua execução (SILVA, 1998a). 4.1.2. Distribuição Processo pelo qual um fármaco, reversivelmente, abandona o leito vascular e entra no interstício (liquido extracelular) ou nas células dos tecidos. Após a distribuição, apenas uma fração do fármaco estará no seu local de administração. O fármaco estará, então, em diferentes tecidos, classificados funcionalmente como suscetíveis, ativos, indiferentes e emunctórios. • Suscetíveis: tecidos que sofrem ação farmacológica; • Ativos: tecidos que metabolizam o fármaco; • Indiferentes: servem como reservatórios temporários; • Emunctórios: responsáveis pela eliminação do fármaco (GIESBRECHT; ZYNGIER, 1994; HOWLAND; MYCEK, 2007). São interferentes dessa passagem: o fluxo sanguíneo, a permeabilidade capilar e a ligação de fármacos a proteínas plasmáticas (HOWLAND; MYCEK, 2007). A quantificação da distribuição do fármaco nos tecidos geralmente não é possível diretamente. Para comparação da distribuição do fármaco com os volumes dos compartimentos de água no organismo usa-se o Volume de Distribuição, que é um volume hipotético de líquido no qual o fármaco se dissemina. Podendo ser definido como volume de plasma que deveria conter o conteúdo corporal total da droga numa concentração igual à do plasma (FUCHS; WANNAMACHER, 1998b; RANG; DALE; RITTER, 2001b). Os principais compartimentos de água no organismo são o extracelular, o intracelular e o transcelular. O compartimento extracelular compreende o plasma, o interstício e a linfa. O compartimento transcelular é formado pelos líquidos cefalorraquidiano, intra-ocular, peritoneal, pleural, sinovial e secreções digestivas (FUCHS; WANNAMACHER, 1998b; HOWLAND; MYCEK, 2007; RANG; DALE; RITTER, 2001c). 36 4.1.3. Biotransformação Também chamada de metabolismo, é a alteração química que o fármaco sofre no organismo, sendo convertido em um composto diferente do originalmenteadministrado, geralmente, é mediada por enzimas (FUCHS; WANNAMACHER, 1998b; OGA, YASAKA, 1994). A aceleração da biotransformação reduz a concentração do fármaco no sangue, diminuindo a ação farmacológica. Sua inibição, contrariamente, prolonga o tempo de permanência do fármaco no organismo. O fígado é o principal local de biotransformação, mas esse processo pode ocorrer também em outros tecidos (HOWLAND; MYCEK, 2007; OGA; YASAKA, 1994). Alguns fármacos chamados de pró-fármacos ou pró-drogas são administrados na forma inativa e precisam ser biotransformados para suas formas ativas. Pode ocorrer, também, do produto do metabolismo exibir atividade aumentada ou suas propriedades tóxicas, como citotoxicidade, mutagenicidade, teratogenicidade e carcinogenicidade. Mas isso não é o que ocorre com a maioria dos casos, pois geralmente a biotransformação gera compostos menos tóxicos, mais polares e com menor atividade farmacológica portanto mais solúveis em água, facilitando a excreção (CORREIA, 2003; HOWLAND; MYCEK, 2007; OGA; YASAKA, 1994). O processo de metabolismo das drogas ocorre, na maioria das vezes, em algum ponto entre a absorção da droga e a sua eliminação, podendo iniciar na luz ou parede intestinais ou no sangue e ocorrer em diversos órgãos como rins, pulmões e tecido nervoso, mas o metabolismo hepático é o principal responsável pela ação de muitos fármacos. O fígado possui uma grande concentração de enzimas subdivididas em três frações: mitocondrial, microssômica e solúvel (CORREIA, 2003; OGA; YASAKA, 1994). A biotransformação das drogas envolve dois tipos de reações bioquímicas conhecidas como reações de fase I e de fase II. As reações de fase I incluem oxidação, redução e hidrólise, geralmente convertem a droga original num metabólito mais polar, introduzindo um grupo funcional. Seus produtos podem ser polares suficientes para serem excretados, mas a maioria precisa sofrer novas reações. As reações de fase II compreendem acetilações e conjugações, que 37 formam conjugados altamente polares que são mais facilmente eliminados (FUCHS; WANNAMACHER, 1998b; RANG; DALE; RITTER, 2001c). • Oxidação: é um tipo de reação dos mais freqüentes, sendo realizado por várias enzimas, e têm grande importância as enzimas microssomais e particularmente as monoxigenases, também chamadas de oxidases de função mista (OFM). São exemplos dessas enzimas a NADPH-citocromo c redutase e uma hemoproteína chamada P450 que atua como oxidase terminal e está presente na membrana microssômica em múltiplas formas diferentes. As enzimas do citocromo P450 são capazes de metabolizar diversos substratos diferentes, possuindo baixa especificidade. Outra característica importante dessas enzimas é possuir atividade influenciada pelos substratos, podendo ser induzidas ou inibidas por certos substratos farmacológicos. As oxidações por enzimas não microssômicas são menos variadas, ocorrendo com aminas, álcoois e aldeídos a ácidos (CORREIA, 2003; OGA, YASAKA, 1994). O citocromo P450 é uma superfamília de isoenzimas que inclui mais de 50 hemoproteínas, que catalisam o metabolismo de muitas drogas por processos oxidativos. O sistema CYP450 é composto por diversas isoenzimas, codificadas pela superfamília de genes CYP. Essa superfamília é dividida em famílias e subfamílias, sendo que as principais subfamílias envolvidas com o metabolismo de fármacos são as CYP 1A, 2A-F e 3 A. (OLIVEIRA; COSTA; FONSECA, 2006). • Redução: também ocorre sobre ação do sistema enzimático microssômico, é bem menos comum, mas existem algumas importantes como a inativação da varfarina pelo CYP2A6, enzima do citocromo P450 (CORREIA, 2003; OGA; YASAKA, 1994). • Hidrólise: ocorre no plasma e na fração solúvel de muitos tecidos, principalmente no fígado. As principais ligações sujeitas a hidrólise são os ésteres, mas as amidas também estão sujeitas a essa reação (CORREIA, 2003; OGA; YASAKA, 1994). 38 As reações de fase II podem ocorrer com ou sem a reação de fase I ter ocorrido. Necessitam apenas da presença de um grupo apropriado na molécula da droga original ou do produto formado após a fase I, podendo ser uma hidroxila, um tiol ou uma amina. Os produtos dessas reações de síntese são quase sempre farmacologicamente inativos e menos lipossolúveis que seus precursores, mas certos conjugados formados podem apresentar hepatotoxicidade. Para realização dessas reações são necessários intermediários ricos em energia e a ação de enzimas de transferência específicas que estão localizadas nos microssomos ou no citosol (CORREIA, 2003; FUCHS; WANNAMACHER, 1998b; RANG; DALE; RITTER, 2001c). Essas reações, também chamadas de reações de síntese ocorrem principalmente no fígado podendo ocorrer também em outros órgãos como pulmão e rins. Os grupos mais freqüentes na formação de conjugados são: ácido glicurônico, acetil, sulfato, metil, glicina e glutationa (RANG; DALE; RITTER, 2001c; OGA; YASAKA, 1994). A conjugação com o ácido glicurônico é a mais comum, ocorrendo freqüentemente com fenóis, álcoois e ácidos carboxílicos. Esta reação é catalisada por enzimas microssomais, como a urinodifosfatoglicose pirofosforilase e a urinodifosfato-pirofosforilase, após a ativação do ácido glicurônico, da seguinte forma: UDP-glicuronídio + ROH → RO-glicuronídio + UDP Onde ROH é o fármaco ou seu metabólito (JACOB, 1998). As demais reações de conjugação são catalisadas por enzimas não microssomais. Quando o doador é o Acetil Coa, doando o grupo acetil ocorre a N- acetilação. Na O-, S- ou N-metilação o grupo metil é doado pela S-adenosilmetiona. As reações de acetilação ocorrem por meio de acetiltransferase. As reações de metilação são catalisadas pelas enzimas catecol-O-metiltransferase (COMT), S- metiltransferase ou N-metiltransferase (JACOB, 1998; MELLO, 1998). A biotransformação pode sofrer influência de diversos fatores como idade, uso de indutores ou inibidores enzimáticos, dieta, sexo e fatores individuais; mas os 39 mais importantes, que serão detalhadamente estudados nesse trabalho, são os fatores genéticos. A farmacogenética estuda as variações que podem aumentar ou diminuir a quantidade de enzima ou modificar sua estrutura e/ou atividade. Uma característica genética que afeta a biotransformação de drogas, e será discutida mais detalhadamente, é a velocidade de acetilação durante o metabolismo de alguns fármacos com grupo amino, como a isoniazida. Alguns pacientes conseguem metabolizar essa droga rapidamente e outros muito lentamente, subdividindo a população em dois grupos diferentes de acordo com os distintos fenótipos: o de acetiladores rápidos e o de acetiladores lentos (OGA, YASAKA, 1994). A presença de variantes polimórficas do gene CYP2D6 interfere no metabolismo do fármaco debrisoquina, através de diferenças na seqüência do DNA da proteína codificada, enzima debrisoquina hidroxilase. Essa determinação confirmou que o efeito de cada medicamento é determinado pela interação de muitos genes que codificam inúmeras vias metabólicas de drogas (CRUZ-COKE, 2001). Os polimorfismos genéticos podem afetar também as oxidações de drogas, envolvendo, principalmente, enzimas especificas do citocromo P450, mas podendo ocorrer com outras. Estudaremos a diante mais detalhadamente alguns polimorfismos já descobertos e estudados pela farmacogenética (CORREIA, 2003). 4.1.4. Excreção De acordo com as propriedades físico-químicas das drogas inalteradas ou de seus metabólitos ocorre sua excreção por diferentes vias. Define-se excreção como a remoção dos compostos doorganismo para a o meio externo, processo no qual um fármaco ou seu metabólito é eliminado. As principais vias de excreção são a pulmonar, a biliar, juntamente com secreções como salivar, lacrimal, sudorípara ou leite; mas a mais importante é a renal (JACOB, 1998; OGA; YASAKA, 1994). A eliminação dos fármacos através da urina envolve três processos: a filtração, a secreção tubular ativa e a reabsorção tubular passiva (JACOB, 1998; RANG; DALE; RITTER, 2001d). Drogas com peso molecular inferior a cerca de 20.000, hidrossolúveis e polares são capazes de atravessar por difusão os capilares glomerulares, esse 40 processo é chamado de filtração glomerular. As drogas sofrerão este processo se estiverem livres no sangue; as que estão ligadas às proteínas plasmáticas e as que possuem elevado peso molecular não são filtradas (JACOB, 1998; SILVA, 1998b). Na secreção tubular ativa ocorre a participação de dois mecanismos de transporte independentes e relativamente não seletivos, um para drogas ácidas e outro para bases orgânicas. Esses transportadores, presentes no túbulo contorcido proximal, podem transferir essas moléculas mesmo contra o gradiente de concentração, sendo capazes de depurar quase totalmente as drogas, inclusive as ligadas às proteínas plasmáticas (RANG; DALE; RITTER, 2001d). A reabsorção tubular passiva, também chamada de difusão através do túbulo renal, é o mecanismo através do qual drogas com alta lipossolubilidade são reabsorvidas passivamente quando o túbulo for livremente permeável à droga e a concentração da droga no filtrado encontra-se próxima à do plasma. Devido à reabsorção tubular, esse tipo de fármaco, lipossolúvel, não é excretado eficientemente pela urina (RANG; DALE; RITTER, 2001d). O fígado, por sua capacidade metabolizadora, ocupa lugar estratégico na distribuição e destino de drogas. Suas células transferem diversas substancias do plasma para a bile através de sistemas de transportes semelhantes aos do túbulo renal. Drogas na forma de conjugados são levados pela bile ao intestino, onde podem ser reabsorvidas, após ficar na forma livre, ou serem eliminadas através das fezes (OGA; YASAKA, 1994). 4.2. Farmacodinâmica Estudo das ações da droga no organismo, através dos efeitos bioquímicos e fisiológicos dos fármacos e dos seus mecanismos de ação. Estuda a ação dos fármacos, assim como os efeitos objetivos e subjetivos que eles provocam em organismos sãos e doentes, de modo a obter elementos que orientem o seu uso, sendo o estudo do mecanismo de ação um de seus aspectos fundamentais (BENET, 1996; JACOB, 1998; ZANINI; OGA, 1994). As ações farmacológicas estão relacionadas à eficácia dos medicamentos e ao surgimento de reações adversas. Os efeitos de um fármaco são conseqüência de sua ação, mas são influenciados por fatores concomitantes como a dieta, a prática 41 de atividade física e a condição farmacocinética do indivíduo, por exemplo, (WANNAMACHER; THADDEU, 1998). O tempo decorrido entre a administração e o início da ação do fármaco é chamado de tempo de latência. Um segundo tempo de latência é percebido entre o início da ação e a observação dos efeitos (KOROLKOVAS, 1998). O componente de um organismo, ou de uma célula, que interage com o fármaco e desencadeia os eventos bioquímicos que levam aos efeitos observados é chamado de receptor. (BOURNE; ZASTROW, 2003). Segundo Korolkovas (1994), receptor é o “componente celular cuja interação com o fármaco provoca estímulo que se traduz por efeito biológico observável”. Outros autores, como Rang, Dale e Ritter (2001b), restringem o termo receptor para as macromoléculas que formam elementos sensores no sistema de comunicações químicas que coordena a função de todas as diferentes células do corpo, sendo os mensageiros químicos representados por hormônios, substâncias transmissoras ou outros mediadores, como as citocinas e os fatores de crescimento. Nesse caso, usa-se a expressão alvo para ação das drogas ou sítios alvos para agrupar todas as proteínas capazes de interagir com o fármaco. Geralmente os receptores nos quais atuam os fármacos são, fisiologicamente utilizados por substâncias endógenas. Os fármacos que se ligam a receptores fisiológicos e simulam os efeitos de compostos reguladores endógenos são chamados de agonistas. Antagonistas são fármacos que não simulam e sim interferem na ligação dos agonistas endógenos evitando sua ação, não possuindo atividade reguladora intrínseca. Os agonistas podem ser totais (que podem produzir efeitos máximos) ou parciais (que só podem produzir efeitos reduzidos). Existem ainda, menos comuns, os agonistas inversos que exibem seletividade pelo estado em repouso do receptor, impedindo que mude sua configuração produtiva (RANG; DALE; RITTER, 2001a; ROSS, 1996; WANNAMACHER; THADDEU, 1998) Canais iônicos, proteínas transportadoras, enzimas e receptores são os principais grupos de alvos protéicos (WANNAMACHER; THADDEU, 1998). A ligação a canais iônicos pode ocorrer direta ou indiretamente, controlando sua abertura. A ação indireta envolve a interação com uma proteína G e outros intermediários chamados segundos mensageiros, que são substâncias moduladoras de inúmeras funções celulares, como excitabilidade, mediante abertura ou 42 fechamento dos canais iônicos (RANG; DALE; RITTER, 2001b; WANNAMACHER, THADDEU, 1998). As proteínas transportadoras também podem ser utilizadas como sítios de ação para drogas, agindo bloqueando o sistema de transporte fisiológico. São exemplos dessa interação os glicosídeos digitálicos cardioativos cujo receptor é a Na+/K+ ATPase, responsável pelo transporte de íons (BOURNE; ZASTROW, 2003). Enzimas são proteínas que servem como alvo para muitas drogas, podendo ser inibidas ou, mais raramente, ativadas pela competição da droga com o substrato endógeno. Essa competição pode ser reversível ou irreversível (BOURNE; ZASTROW, 2003; RANG; DALE; RITTER, 2001b). De acordo com a estrutura e os mecanismos de transdução de sinais após a ligação com o fármaco, os receptores podem ser agrupados em quatro superfamílias: • Receptores ligados a canais • Receptores acoplados à proteína G • Receptores ligados à quinase • Receptores que regulam a transcrição de genes (JACOB, 1998; RANG; DALE; RITTER, 2001b). A última família compreende receptores que estão localizados no citosol ou núcleo e as demais famílias agrupam receptores de membrana (JACOB, 1998). A ligação entre fármacos e receptores ocorre por diferentes forças de interação, que podem ser fracas, como nas ligações iônicas, polares, pontes de hidrogênio e forças de Van der Waals ou mais fortes que são as que ocorrem por ligação covalente (KOROLKOVAS; FERREIRA, 1998). Nem todos os fármacos dependem da interação com receptores, alguns propiciam reações apenas a partir de sua presença na biofase (local de ação), como, por exemplo, os antiácidos, os diuréticos osmóticos e anestésicos gerais inalatórios (WANNAMACHER; THADDEU, 1998). 43 5. Farmacogenética A individualidade bioquímica pode explicar reações incomuns a drogas e alimentos. O estudo dos fatores genéticos que alteram a farmacocinética e o efeito das drogas é chamado de farmacogenética, que também pode ser definida como o estudo dos distúrbios provenientes de diferenças genéticas na distribuição das drogas que podem provocar variações na resposta (BRODY, 1997; OGA; YASAKA, 1994; VOGEL; MOTULSKY, 2000b). Lima (1996c) define a farmacogenética como o estudo dos transtornos hereditários cujos sintomas são revelados ou agravados quando pessoas sensíveis a determinadasdrogas as usam como medicamento ou alimento. Pitágoras, matemático grego, foi o responsável pela primeira referência à variabilidade em reposta farmacológica quando descreve, em 510 a.C., uma intoxicação provocada por determinadas favas em alguns, mas não em todos, os indivíduos que as ingeriam (SUAREZ-KURTZ, 2004). A farmacogenética possui suas raízes na época de 1850, onde fisiologistas europeus já conheciam a capacidade do organismo humano de metabolizar medicamentos e compostos exógenos ingeridos. Na segunda metade desse século houve a descoberta das leis da hereditariedade e o desenvolvimento do conceito de receptor, de modo a justificar a especificidade de ação de princípios ativos nos tecidos. Mas foi no século XX que houveram marcos para seu desenvolvimento: a descoberta da influência exercida pelo material genético sobre a metabolização de compostos exógenos, as evidências indicadoras da individualidade do ser humano e, a partir de 1950, a fixação da importância da variação genética sobre as conseqüências do uso de medicamentos. Até 1990, cerca de 100 características monogênicas e polimórficas de interesse farmacogenético haviam sido identificadas. O desenvolvimento da biologia molecular e de técnicas de DNA recombinante tornaram possíveis a investigação por meio de clonagem e o seqüenciamento do material genético, localizando os genes e determinando sua importância no desenvolvimento do fenótipo (FERREIRA; WANNAMACHER; OSÓRIO-DE- CASTRO, 2004). Podem ser citados como marcos históricos da evolução da farmacogenética, a partir de 1950: a identificação das alterações genéticas responsáveis pela apnéia 44 prolongada provocada pela succinilcolina, em 1956; a explicação sobre as diferenças étnicas nos casos de anemia hemolítica provocada por primaquina, em 1960; a associação entre polimorfismos da enzima N-acetiltransferase, metabolização e toxicidade da isoniazida, em 1961; a descrição da hipertermia maligna provocada pela succinilcolina e por anestésicos gerais, em 1966; e no Brasil, o início dos estudos de farmacogenética na população brasileira, em 2001 (REFARGEN, 200?). Em 2003 foi criada, no Brasil, uma rede nacional de farmacogenética/ farmacodinâmica, formada por pesquisadores distribuídos nas cinco regiões do país, com o objetivo de criar um arquivo de dados farmacogenômicos para a população brasileira, promover a interação científica entre os membros da rede e incentivar a pesquisa de fármacos direcionados à genética da população brasileira (SUAREZ- KURTZ, 2004). Inicialmente, a farmacogenética estudou processos farmacocinéticos, principalmente a biotransformação dos fármacos. Em um segundo momento, passou a incluir a farmacodinâmica (SUAREZ-KURTZ, 2004). Os fatores genéticos são os principais determinantes da variabilidade normal dos efeitos de fármacos. Dentro de uma população considerada homogênea é esperada a variação contínua de respostas e da farmacocinética das drogas, a ponto de a meia-vida de um fármaco e sua potência serem determinadas pela concentração e efeito verificados em 50% da população. A variação relacionada à atividade enzimática associada a biotransformação de drogas especifica é o principal mecanismo encontrado na farmacogenética (BRODY, 1997; OGA; YASAKA, 1994; RANG; DALE; RITTER, 2001e). Em alguns casos pode aparecer uma resposta inesperada anormal, que, quando sua origem é devida a alteração genética, é chamada de idiossincrasia. Sua causa pode ser ausência ou alteração de enzima ou deficiência de um mecanismo bioquímico. Esses fatores são determinados pela supressão ou imperfeição dos genes correspondentes (OGA; YASAKA, 1994). O estudo da farmacogenética possui grande importância na avaliação de pacientes com respostas anômalas às drogas. Estudos com gêmeos demonstram que a herdabilidade da reação às drogas é muito alta e os estudos das famílias mostram que muitas dessas reações são herdadas segundo padrões mendelianos 45 simples caracterizando os distúrbios farmacogenéticos como sendo variações individuais de origem genética na resposta às drogas (BRODY, 1997; LIMA, 1996c). A exposição de um grupo de indivíduos à mesma dose de medicamento nos mostra que a maioria deles apresenta uma determinada concentração do fármaco no sangue sendo a ideal para o tratamento. Porém outras pessoas, em menor número, apresentam no plasma concentrações muito elevadas, apresentando mais efeitos tóxicos, ou muito baixas, podendo tornar o tratamento ineficaz. Essas variações podem estar relacionadas com velocidade de absorção, excreção, ligação a proteínas plasmáticas, distribuição da droga nos tecidos, etc. (LIMA, 1996c). Alguns distúrbios são assintomáticos, como a excreção de betanina na urina (pigmento da beterraba), outros apresentam transtornos leves, mas alguns podem ser fatais, como a sensibilidade ao anestésico suxametônio (MOTTA, 2000). A origem dos polimorfismos para a resposta às drogas e os mecanismos pelos quais eles se mantêm levantam um problema: obviamente não surgiram em resposta a drogas, pois precedem as drogas implicadas. O metabolismo e a resposta às drogas exigem muitas reações bioquímicas e as enzimas envolvidas podem participar do metabolismo de substâncias alimentares comuns (THOMPSON; McINNES; WILLARD, 1993b). A manutenção de algumas variações em seguidas gerações de uma população pode ser justificada por alguma vantagem que elas oferecem, como por exemplo, a deficiência na atividade da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), visto que as pessoas com essa característica são mais resistentes à malária (LIMA, 1996c). 5.1. Principais variações genéticas que interferem na farmacocinética A metabolização de uma droga é, pelo menos em parte, geneticamente determinada. Esse fato é evidente a partir dos estudos realizados em gêmeos idênticos e não-idênticos, nos quais se verifica que os gêmeos idênticos (monozigóticos) metabolizam as drogas de forma semelhante, enquanto os dizigóticos, freqüentemente, não o fazem. Serão estudados detalhadamente adiante 46 exemplos de variações que alteram a farmacocinética dos fármacos, principalmente afetando o metabolismo (GRAHAME-SMITH; ARONSON, 2004). Alterações em outras etapas da farmacocinética também são estudadas, sendo possível ocorrer na absorção e distribuição, por exemplo. Os transportadores ativos na membrana celular podem ser responsáveis pela absorção e eliminação de vários medicamentos e podem apresentar polimorfismos genéticos que alterem sua expressão ou conformação, afetando a afinidade com o substrato. A glicoproteína-P, por exemplo, tem sido bastante estudada e já foram identificados mais de 28 variantes genéticas que afetam a expressão e função desses transportadores, que são utilizados por inibidores de proteases, fármacos utilizados no tratamento do HIV (METZGER, 2006). 5.1.1. Sensibilidade ao suxametônio A colinesterase plasmática, também chamada de pseudocolinesterase, é uma enzima existente no plasma que hidrolisa ésteres de colina, como a acetilcolina. É um tetrâmero que consiste em 4 subunidades monoméricas idênticas que não apresenta papel fisiológico importante, tanto que sua ausência é tolerada pelo organismo, porque outra enzima, a acetilcolinesterase, destrói a acetilcolina nas sinapses colinérgicas e junções musculares (LIMA, 1996c; THOMPSON; McINNES; WILLARD, 1993a; VOGEL; MOTULSKY, 2000c). Uma importante deficiência, no entanto, é verificada quando alguns indivíduos são submetidos à succinilcolina (também chamada de suxametônio), que é um bloqueador neuromuscular, agindo na pós-sinapse por
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