Meios de cultura, colorações e ensaios bioquímicos manuais

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Microbiologia Clínica
Rotina no setor de bacteriologia: Meios de cultura, técnicas 
de semeio, colorações e série bioquímica
João Marcelo de Oliveira, Biomédico
Cronograma da aula...
• Meios de cultura inespecíficos.
• Meios de cultura específicos.
• Diferenciação das características da parede celular: Gram ou viscosidade (KOH).
• Técnicas de semeio.
• Caracterização bioquímica por meios de cultura.
Meios de cultura inespecíficos
Agar Sangue:
• Isolamento não específico.
• Prova da hemólise: Streptococcus sp x Staphylococcus sp.
• Meio base (MH, BHI... Sangue de cavalo a 50°C – 5ml x 100ml de base).
Agar Chocolate:
• Isolamento não específico para microrganismos exigentes.
• Meio base (MH, BHI... Sangue de cavalo a 80°C – 5ml x 100ml de base).
• 80°C libera hemina e hematina.
Meios de cultura inespecíficos
Prova da hemólise em Agar Sangue: Staphylococcus x Estreptococcus
Alfa hemólise Beta hemólise Gama hemólise
Carct. Colônia
halo esverdeado ao 
redor das colônias 
semeadas
halo transparente 
ao redor das 
colônias semeadas
Sem halo
Reação
Lise parcial dos 
eritrócitos
Lise total dos 
eritrócitos
Não há lise dos 
eritrócitos
Meios de cultura inespecíficos
Agar Chocolate:
• Isolamento não específico para microrganismos exigentes.
Colônias pequenas e delicadas, com
pigmento creme claro: sugestivo
de Haemophilus spp.
Colônias de tamanho pequeno a médio, com
pigmento amarelo: sugestivo de Neisseria
spp, Branhamella catarrhalis ou Moraxella
spp.
Meios de cultura inespecíficos
Agar Sabouraud (c/s antibiótico):
• Isolamento não específico de fungos filamentosos e leveduras.
Meios de cultura inespecíficos
Agar CLED (CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT):
• Para isolamento quantificação de bactérias e leveduras em amostra de urina.
• Identificação de fermentação da lactose pela característica da colônia.
Lactose positiva Lactose negativa Sem reação da lactose
Meios de cultura específicos
Agar MacConkey:
• Para isolamento específicos (cristal violeta) de bacilos G-, enterobactérias e não
fermentadores.
• Verifica a fermentação da lactose.
Lactose positiva Lactose negativa
Meios de cultura específicos
Agar Salmonella-Shigella:
• Possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem
microrganismos Gram positivos.
• Permite verificar formação de H2S (sulfeto de hidrogênio).
Lactose positiva
Lactose negativaH2S
Meios de cultura específicos
Agar Manitol Salgado:
• Isolamento específicos para espécies do gênero Staphylococcus.
• Alta concentração de sal e indicadorde pH.
• Staphylococcus aureus fermentadores de manitol produzem colônias grandes e
rodeadas de uma zona amarela.
• Os estafilococos não-patogênicos produzem colônias pequenas e rodeadas de uma
zona vermelha.
• O Staphylococcus epidermidis e Bacillus subtillis produzem colônias brancas.
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Meios de cultura específicos
Agar Löwenstein Jensen:
• Meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das
micobactérias, especialmente Mycobacterium tuberculosis.
• Tempo de incubação longo.
• Fazer um esfregaço do crescimento e corar pela técnica de Ziehl para confirmar
ser um Bacilo Álcool Ácido Resistente.
Colônias amareladas
Meios de cultura específicos
Agar Mueller-Hinton:
• Meio para crescimento de microrganismos diversos: enterobactérias,
não fermentadores, Staphylococcus, Enterococcus sp.
• Utilizado para manter culturas pré-repique.
• Utilizado para antibiograma.
Características da parede celular (morfotintoriais)
Gram Positivas:
• Ácido tecóico.
Gram Negativas:
• Lipídeos.
• Complexo corado em
azul intenso.
• Não é removido pelo
álcool-acetona.
• Não retém a coloração
do cristal violeta.
• Coradas pelo contraste
da fuccina.
Coloração de Gram Gram por viscosidade
Gram Positivas:
• Ácido tecóico.
Gram Negativas:
• Lipídeos.
Bactéria + KOH 1% na lâmina
Tem liga?
G -
Sem liga?
G +
Quebra parece, expõe DNA
DÚVIDA 
NA 
MICROS
COPIA?
Sem quebra e sem expõe do DNA
Coloração de Ziehl-Neelsen (BAAR)
• Baciloscopia direta pra diagnóstico da
tuberculose.
• Mycobacterium tuberculosis e M. leprae.
• Mais forte que o Gram – Bacilos-Álcool-
Resistentes (BAAR).
• Alto teor de lipídios em sua parede celular.
• Cobrir a lâmina, previamente fixada pelo calor, com fuscina
fenicada. Aquecer até a emissão de vapores, sem deixar o 
corante secar, por 3 a 5 minutos; 
• Lavar em água corrente; - Em seguida descorar completamente 
com álcool-ácido; - Lavar em água corrente novamente; 
• Contracorar com azul de metileno por 30 segundos; 
• Lavar em água corrente novamente; 
• Examinar a lâmina ao microscópio com objetiva de imersão.
Técnicas de semeio em meios de cultura (placa)
ESTRIAMENTO
ESTRIAMENTO POR 
ESCOTAMENTO
ESTRIAMENTO PARA 
AMOSTRAS 
POSSIVELMENTE MISTA
PIQUE CENTRAL
BACTÉRIAS E LEVEDURAS FUNGOS FILAMENTOSOS
Técnicas de semeio em meios de cultura (placa)
https://www.youtube.com/watch?v=qIoPo4wSnWk
Técnicas de semeio em meios de cultura (tubo)
FLAMBAGEM DO TUBOSEMEIO EM TUBO
• Evita contaminação.
• Usado em caracterização bioquímica.
• Bactérias e leveduras.
Caracterização/série bioquímica
Organizando o uso dos testes e pensamentos:
• Usar após isolamento e identificação morfotintorial prévia.
• Auxilia na identificação das bactérias e leveduras baseado na produção de gás, fermentação de
carboidratos, indol, reação da catalase, coagulase e outros.
• Deve respeitar fluxogramas de identificação baseado em testes anteriores.
Caracterização/série bioquímica
Como se caracteriza a série bioquímica?
• Algumas bactérias são identificadas analisando-se seu
metabolismo e estudo da capacidade de degradação de
determinados substratos.
• Capacidade de utilização de diferentes fontes de carbono.
• Capacidade de utilização de diferentes fontes de nitrogênio.
• Produção de enzimas.
• Capacidade de motilidade.
Caracterização/série bioquímica
Agar TSI (Triple Sugar Iron Agar):
• Identificação de BG- com base na fermentação de carboidratos, produção de
H2S e Gás.
Composição:
• Açucares: glicose, lactose e sacarose.
• Vermelho de fenol.
• Tiossulfato de ferro.
Caracterização/série bioquímica
Reações ápice/base
Caracterização/série bioquímica
Ureia:
• Para BG -, não fermentadores Staphylococcus e Haemophilus.
• Identifica o microrganismo capaz de quebrar a ureia em duas moléculas de
amônia, CO2 e H2O; sob ação da uréase.
• Amonia reage com o carbonato de amônia, alcalinizando o meio.
• Vermelho de fenol (pH) deixa o meio rosa.
Caracterização/série bioquímica
Ágar SIM (Sulfeto Indol Motilidade) – semi-sólido:
• Determinam a habilidade do microrganismo de metabolizar o triptofano em indol (gás tóxico
invisível) adicionando-se reagentes de Erlich ou Kovacs (torna o indol visível).
• Teste de motilidade com pite produto central.
• Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias, não fermentadores, Haemophilus e
anaeróbios.
Motilidade +
Caracterização/série bioquímica
Ágar Fenilalanina:
• Verifica a capacidade da bactéria de produzir ácido
fenilpirúvico a partir da fenilalanina por ação da
fenilalanina desaminase.
• O ácido fenilpirúvico acidifica o meio.
• Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias.
• Adicionar Cloreto férrico (ação imediata).
• Quando positivo, deixa o bisel esverdeado.
Cloreto férrico 10%
Caracterização/série bioquímica
Ágar Citrato de Simmons:
• Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como única
fonte de carbono (prod. Energia),juntamente com sais de amônia,
alcalinizando o meio.
• Diferencia gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores.
• Considera-se citrato positivo quando apresenta cor azul ou crescimento no
local do inóculo.
CaldoMalonato:
• Determina a habilidade do microrganismo de utilizar malonato
de sódio como única fonte de carbono.
• Diferencia gêneros e espécies de enterobactérias e não
fermentadores.
Caracterização/série bioquímica
Agar Base Moeller + aminoácidos
• As descarboxilases são um grupo de enzimas com substrato específico, capazes de reagir com
o grupo carboxila dos aminoácidos para formarem aminas alcalinas.
• A descarboxilação do aminoácido origina dióxido de carbono como produto secundário.
CONTROLE LISINA ORNITINA ARGININA
Reação bioquímica Sem aminoácido.
Descarboxilação da 
lisina
Descarboxilação da 
ornitina
Descarboxilação da 
arginina
Composição 1% glicose
1% lisina + 1% 
glicose
1% ornitina + 1% 
glicose
1% arginina + 1% 
glicose
Resultado Ac. o meio = amarelo
Acidifica e depois 
alcaliniza = roxo
Acidifica e depois 
alcaliniza = roxo
Acidifica e depois 
alcaliniza = roxo