EXP 10: DETERMINAÇÃO DA PARÂMETROS CINÉTICOS DE REAÇÕES CATALISADAS POR ENZIMAS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA 
 
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA 
 
Curso: Farmácia 
Disciplina: Físico-Química Experimental - QMC 5453 Turma: 3102C 
Professor: Nito Angelo Debacher 
Data da experiência: 08/05/2018 
Alunos: Joscelin Esther Kunze, Luiz Gustavo Branco Bellini, Silvestre Lacerda de Aguiar, 
Tayna Gonçalves 
 
EXPERIMENTO 10: DETERMINAÇÃO DA PARÂMETROS CINÉTICOS DE REAÇÕES 
CATALISADAS POR ENZIMAS 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
Enzimas são, em sua grande maioria, proteínas que catalisam reações químicas e biológicas. Os 
catalisadores apresentam como função a redução da energia de ativação, e por consequência 
o aumento da velocidade da reação. Para que essa ligação ocorra, a conformação da estrutura 
da enzima e de seus componentes adicionais são muito importantes, os quais dependem de: 
pH, temperatura, concentração do substrato e presença ou não de inibidores. 
 
Quando a enzima se liga ao seu substrato formando o complexo enzima-substrato, há um 
grande aumento da velocidade de reação, garantindo uma eficácia de ação enzimática. 
 
Nas reações com enzimas alguns aspectos físico-químicos são de grande relevância, como a 
medida da velocidade inicial (V0) da reação e sua variação de velocidade (ΔV), além da variação 
da concentração do substrato ([S]) ao longo do tempo (t) após a adição de uma determinada 
concentração de enzima (E0). Com isso pode-se analisar a velocidade máxima e a constante de 
Michaelis-Menten (Km) que mostram as características de cada enzima para o seu substrato. 
Por exemplo, enzima polifenoloxidade pode ser extraída de vegetais (como a batata), de 
microorganismos (como fungos), e de alguns animais. Ela é classificada no grupo das 
oxirredutases e contem o cobre como grupo prostético (cofator). Essa enzima tem como ação 
indesejável o escurecimento de vegetais, como da batata e da maçã. 
 
OBJETIVOS 
Determinar os parâmetros cinéticos da reação enzimática da batata através da técnica de 
espectrofotometria. 
 
 
MATERIAIS E PROCEDIMENTOS 
 
4 cubetas de 3 mL para espectrofotômetro, 1 béquer de 100 mL, 1 pipeta graduada de 1 mL, 1 
pipeta graduada de 2 mL, 1 pipeta graduada de 5 mL, proveta de 10mL, funil pequeno, ¼ de 
batata crua, solução aquosa 0,05 mol L-1 de catecol, água deionizada, peróxido de hidrogênio 
10%, cubos de gelo, cronômetro, termômetro, espectrofotômetro UV-Visível, balança, 1 
ralador/amassador de batatas, 1 faca para legumes, 1 recipiente para banho de gelo, frascos 
lavadores com água deionizada. 
PROCEDIMENTOS 
Primeira parte: Preparar 100 mL de catecol 0,05 mol/L. Preparar o extrato de batata, ralando e 
espremendo a batata. Recolher o líquido numa proveta de 10 mL. Colocar a proveta com o 
líquido em um banho de gelo, para impedir a oxidação. Ligar o espectrofotômetro, acertar o 
zero de absorbância no comprimento de onda máximo de absorção da quinona (λmax = 458 
nm). 
Segunda parte: Dispor 4 experimentos variando a concentração de catecol e mantendo 
constante os demais componentes. Na primeira cubeta colocar 0,5 mL de catecol 0,05 mol/L + 
2,5 mL de água, na segunda cubeta colocar 0,75 mL de catecol 0,05 mol/L + 2,25 mL de água, 
na terceira cubeta colocar 1,0 mL de catecol 0,05 mol/L + 2,0 mL de água, na quarta cubeta 
colocar 1,5 mL de catecol 0,05 mol/L + 1,5 mL de água. 
 
Pôr nas 4 cubetas uma gota de peróxido de hidrogênio (H2O2) 10%. Com a primeira cubeta 
zera-se a absorbância do espectrofotômetro. Após, adiciona-se uma gota de extrato de batata 
na tampa da cubeta e agita-se a solução. Arrumar no aparelho, fazendo a primeira leitura de 
absorbância disparando simultaneamente o cronômetro, fazendo leituras de 20 em 20 
segundos até aproximadamente 6 minutos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Resultados e Discussão (cálculos e gráficos em anexo) 
 
Tratamento de dados 
 
Tabela 1. Faça 4 experimentos conforme abaixo, variando os volumes de catecol 0,05 molL-1, 
complete o volume na cubeta para 3 mL com água e adicione uma gota de H2O2 10 % em 
volume. 
 
 0,5 mL de catecol 
0,05 molL-1 
+ 2,5 mL de água 
0,75 mL de catecol 
0,05 mol L-1 
+ 2,25 mL de água 
1,0 mL de catecol 
0,05 mol L-1 
+ 2,0 mL de água 
1,5 mL de catecol 
0,05 mol L-1 
+ 1,5 mL de água 
Tempo, s Abs Abs Abs Abs 
0 0,174 0,182 0,115 
20 0,300 0,400 0,434 0,415 
40 0,307 0,420 0,574 0,409 
60 0,429 0,489 0,632 0,539 
80 0,470 0,531 0,699 0,575 
100 0,500 0,579 0,750 0,600 
120 0,523 0,612 0,784 0,619 
140 0,540 0,640 0,801 0,631 
160 0,554 0,663 0,824 0,640 
180 0,563 0,683 0,834 0,645 
200 0,571 0,695 0,850 0,649 
220 0,579 0,709 0,860 0,654 
240 0,581 0,711 0,861 0,654 
260 0,581 0,724 0,870 0,655 
280 0,590 0,731 0,874 0,659 
300 0,593 0,731 0,879 0,660 
320 0,595 0,735 0,883 0,661 
340 0,599 0,744 0,885 0,661 
360 0,601 0,749 0,890 0,663 
 
 
4.1) Calcule as concentrações de catecol usadas nos 4 diferentes experimentos, ou seja, as 
concentrações finais dentro da cubeta de 3 mL. Lembre-se: M1V1 = M2V2. Use esta relação 
nos cálculos. 
 
Obtivemos as seguintes concentrações de catecol nas cubetas: 1) 0,0083 mol/L; 2) 0,0125 
mol/L; 3) 0,0166 mol/L 4) 0,025 mol/L 
 
Diferentes concentrações de catecol foram necessárias para notar a quantidade do produto 
quinona que era formado através da sua absorção no com no comprimento de onda de 458 
nm (que é a faixa de máxima absorção da quinona). Além disso observamos o Vo em 
diferentes concentrações do substrato. 
 
 
 
4.2) Faça os quatro gráficos (Figura 4) e calcule as velocidades iniciais (V0, coeficiente 
angular) para cada uma das 4 cinéticas realizadas. ∆A/∆t = V0 
 
 Vo cubeta 1 
 (0,0083 mol/L) 
 Vo Cubeta 2 
 (0,0125 mol/L) 
 Vo Cubeta 3 
 (0,0166 mol/L) 
 Vo Cubeta 4 
 (0,025 m ol/L) 
 
 
Como observado conforme aumenta a concentração de substrato aumenta-se a velocidade 
inicial, mas isso só é válido enquanto ainda há sítios ativos vagos nas enzimas, uma vez que as 
reações catalisadas por enzimas chegam há um limite quando então saturam. A partir daí sua 
velocidade de catálise não mais indica uma resposta linear face o aumento de substrato. 
 
“Em concentrações relativamente baixas de substrato Vo aumenta quase linearmente com o 
aumento da [S]. Em altas concentrações de substrato, Vo aumenta em pequenas quantidades 
em resposta ao aumento da [S]. Finalmente, é atingido um ponto além do qual um aumento 
em Vo é insignificantemente pequeno com o aumento de [S]. Esta região de Vo tipo platô está 
próxima à velocidade máxima, Vmáx.”, LEHNINGER, A.L – Princípios de Bioquímica 
 
4.3 Determine Km e Vmax graficamente (Equação 2 e Figura 2). Verifique as unidades e 
discuta os resultados obtidos de Km e Vmax. 
 
Km = concentração de substrato necessária para que a reação atinja ½ Vmáx. É a concentração de 
substrato para a qual a velocidade da reação enzimática é metade de Vmáx 
 
↑Km ↓Afinidade da enzima pelo substrato 
↓Km ↑Afinidade da enzima pelo substrato 
 
Vmáx = à medida que aumenta a [S] a enzima satura-se e a velocidade atinge seu valor máximo 
 
4.4 Faça um gráfico com os dados obtidos no item 3.2.7, absorbância vs. comprimento de 
onda (Fig 3) e discuta o resultado. 
 
Comprimento de onda Absorbância 
400 0,820 
410 0,679 
420 0,541 
430 0,494 
440 0,559 
450 0,641 
460 0,651 
470 0,549 
480 0,421 
490 0,301 
500 0,224 
510 0,165 
520 0,149 
530 0,165 
 
Com o auxílio do espectrofotômetro medimos a absorbância de uma solução de catecol + 
polifenoloxidase que teve como produtofinal quinona e água. 
 
Notou-se que nos comprimentos de onda 400, 410 e 460 houve picos de absorbância, sendo 
que, segundo a literatura, o comprimento de onda máximo de absorção da quinona é 458 nm. 
 
Notou-se que a partir de comprimentos de onda acima de 460 nm (valor próximo do 
comprimento de onda máximo de absorção da quinona), houve diminuição dos valores de 
absorbância da solução. 
 
5. Questionário 
5.1. Defina as enzimas? O que é substrato? 
Enzimas são grupos de substâncias orgânicas de natureza proteica que têm funções 
catalisadoras de reações químicas. Isso é conseguido através do abaixamento da 
energia de ativação necessária para que se dê uma reação química, resultando no 
aumento da velocidade da reação. 
As enzimas convertem uma substância, chamada de substrato, noutra denominada 
produto, e são extremamente específicas para a reação que catalisam. Isso significa 
que, em geral, uma enzima catalisa um e só um tipo de reação química. 
5.2. Que fatores podem explicar a alta eficiência das enzimas como catalisadores? 
Catalisadores são substâncias que aceleram a velocidade de certas reações químicas. 
As enzimas são altamente eficientes como catalisadores por diminuírem a energia de 
ativação necessária para que a reação aconteça. A interação entre substrato e enzima 
é mediada pelas mesmas forças que estabilizam a estrutura da proteína, incluindo 
ligações de hidrogênio, e interações hidrofóbicas e iônicas. A formação de cada 
interação fraca no complexo enzima-substrato é acompanhada pela liberação de uma 
pequena quantidade de energia livre que estabiliza a interação. Além disso, as enzimas 
são altamente específicas uma vez que no seu sítio ativo há grupos funcionais 
arranjados para formar interações fracas de uma forma ótima com um ou alguns 
determinados substrato. 
5.3. Defina Km e Vmax e discuta seu significado (Veja Equação 2). Quais as unidades de 
Km e Vmax. 
Km ou constante de Michaelis Menten, equivale a concentração do substrato 
necessária para atingir a metade da velocidade máxima da reação (Vmáx). Dessa forma, 
o Km pode indicar a afinidade da enzima pelo substrato. Assim, quanto maior o valor de 
Km menor a afinidade da enzima pelo substrato, ou seja, maior concentração de 
substrato é necessária para atingir metade da velocidade máxima. As unidades 
utilizadas para representar o Km são unidades de concentração como g/L ou mol/L. 
 
Vmáx significa a velocidade máxima da reação, que é atingida quando praticamente 
todas as moléculas estão na forma do complexo enzima-substrato, e a concentração 
de enzima livre é insignificante. Por isto, diz-se que a enzima está saturada e não há 
mais um aumento da velocidade da reação, mesmo se a concentração do substrato for 
aumentada. As unidade de Vmáx são (unidade de concentração) sobre tempo ([ES]/s) 
 
5.4. O que é inibidor enzimático e quais os principais fatores que diminuem a 
atividade de uma enzima para atuar como catalisador? 
São moléculas que interferem com a catálise, diminuindo ou interrompendo as 
reações enzimáticas de maneira reversível ou irreversível por mecanismos que não 
envolvem a desnaturação da mesma. Os inibidores reversíveis podem ser competitivos 
e não-competitivos. Os inibidores competitivos na sua maioria possuem estrutura 
molecular semelhante à do substrato, competindo com ele pelo sítio ativo da enzima. 
Em geral, a reação não ocorre enquanto o inibidor estiver ligado à enzima. Os 
inibidores não-competitivos: ligam-se a sítios distintos do substrato, sendo possível 
uma ligação simultânea do inibidor e do substrato à enzima. Porém, a enzima é 
inativada na presença do inibidor, estando o substrato ligado ou não. 
Os inibidores irreversíveis se combinam com um grupo funcional pertencente à 
molécula da enzima, e que seja essencial para a atividade da mesma. Esse tipo de 
inibidor pode, inclusive, promover a destruição desse grupo funcional. 
As enzimas tem sua atividade diminuída quando submetidas a pHs extremos, 
temperaturas elevadas, agitações mecânicas, solventes orgânicas, metais pesados e 
radiações UV. Estes fatores alteram a conformação da enzima (desnaturando), 
prejudicando a sua função biológica. 
5.5. O que acontece se você mudar o pH ou a temperatura do meio reacional e 
mantiver a concentração de enzima e substrato constantes? Explique. 
Cada enzima tem um pH ótimo (ou uma faixa de pH), no qual a atividade é máxima. A 
atividade é reduzida em pH maior ou menor, pois as cadeias laterais de alguns 
aminoácidos atuam como áci-dos ou bases fracos e a mudança de pH pode protoná-los 
ou desprotoná-los. A temperatura tam-bém afeta a atividade enzimática, com o 
aumento desta pode inicialmente aumentar a velocidade da reação, uma vez que a 
energia cinética das moléculas aumenta. No entanto, chega um determinado 
momento em que ocorre a desnaturação da enzimática, e esta perde sua função 
catalítica. 
 
5.6. Cite dois exemplos de enzimas que atuam em sistemas biológicos e explique a 
sua atuação. 
Transferases: são aquelas enzimas que tem como finalidade realizar a translocação de 
grupos funcionais como grupamento amina, carbonila, carboxila, fosfato, de uma 
molécula para outra. Podemos citar como exemplo a Quinase. 
Liases: Atuam na remoção de molécula de água, gás carbônico e amônia, a partir da 
ruptura de ligações covalentes. A Descarboxilase pode ser dada como um exemplo de 
liases. 
 
5.7. Que tipos de resíduos químicos foram gerados neste experimento, e como foram 
tratados? Explique. 
 
Foram gerados resíduos de solução de catecol + H2O2 + H2O + enzima + quinona 
correspondente. O volume de resíduos gerados foi em pequena quantidade e os 
reagentes estavam bastante diluídos. O extrato de batata é orgânico e não tóxico, 
podendo ser descartado na pia. As soluções preparadas foram coletadas em um 
recipiente específico para posterior tratamento e descarte. 
 
 
5.8 Assista ao vídeo e discuta sobre as reações do processo de escurecimento 
enzimático de frutas. 
 
Quando cortamos alguns alimentos, podemos notar que, após pouco tempo eles 
escurecem, fenômeno chamado de escurecimento enzimático. Esse fenômeno é 
causado por enzimas conhecidas como PPO (polifenoloxidase). A reação serve para 
proteger os alimentos por dentro, já que por fora eles possuem casca. Quando o tecido 
é alterado através de um corte, a enzima entra em contato com o substrato, gerando 
pigmentos escuros devido à exposição ao oxigênio. Dependendo do substrato, as 
polifenoloxidases podem ser diferentes. Processos físicos (redução de temperatura ou 
inativação térmica da enzima, por exemplo) e/ou químicos (uso de compostos 
antioxidantes) podem retardar esse processo. 
 
 
5.9 Quais as enzimas do grupo das Polifenoloxidase? 
 
Catecolase, tirosinase, polifenolase, catecol oxidase, creolase e fenolase 
 
 
 
 
 
 
Conclusão 
Pode-se concluir que a cinética da reação tem uma variação maior no início da reação, 
até atingir um pico onde ocorre a saturação da enzima e se alcança a velocidade 
máxima. Após isso a velocidade se mantém constante e isso foi possível ser visto 
através da leitura da absorbância a cada 20 segundos até completar 6 minutos. 
Como futuros farmacêuticos e bioquímicos, a compreensão de como funcionam as 
enzimas, bem como a utilidade delas em processos químicos são importantes. Além 
disso, é necessário também ter um conhecimento sobre cinética química das reações e 
saber que a velocidade da reação depende não somente dos reagentes, mas também 
de catalisadores, de temperatura e do pH do meio. 
 
 
Bibliografia 
- LEHNINGER, A.L., Princípios de Bioquímica. Editora Sarvier, SP 
- Roteiro do trabalho 
-FLORENCE, A.T.Attwood, D.M, Princípios de Físico-Químicaem Farmácia. Tradutores 
Zuleika Rothschild, Adolfo M. Rothschild, ET al. Sāo Paulo: Pharmabooks, 2011.