Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original
* Técnicas de Biologia Molecular: PCR e Sequenciamento do DNA Centro de Ciências Exatas e da Natureza Departamento de Biologia Molecular Disciplina: Genética Eleonidas Moura Lima * Thermus aquaticus * * * PCR - consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA. * Taq DNA Polimerase dNTPs: dATP, dGTP, dCTP e dTTP DNA molde Primers Tampão MgCl2 * Taq DNA Polimerase dNTPs: dATP, dGTP, dCTP e dTTP DNA molde Primers Tampão MgCl2 * Taq DNA Polimerase dNTPs: dATP, dGTP, dCTP e dTTP DNA molde Primers Tampão MgCl2 * Taq DNA Polimerase dNTPs: dATP, dGTP, dCTP e dTTP DNA molde Primers Tampão MgCl2 * Taq DNA Polimerase dNTPs: dATP, dGTP, dCTP e dTTP DNA molde Primers Tampão MgCl2 * Taq DNA Polimerase dNTPs: dATP, dGTP, dCTP e dTTP DNA molde Primers Tampão MgCl2 * * * Agarose diluída em tampão Aplicação das amostras (produtos de PCR) no gel polimerizado de agarose Deixar a agarose solidificar em um suporte que acompanha a cuba * * * Exemplo: Triagem de mutações no gene TP53 ( exon 6) e sua associação à evolução do câncer gástrico . 1º- Passo: Obter a sequência de interesse do gene para desenhar os iniciadores ou primers 2°- Passo: Desenhar e avaliar os iniciadores ou primers 3°- Passo: Avaliar o especificação do iniciadores ou primers através da comparação com genoma (BLAST) * Validação in sílico As sequências de interesse são obtidas nos bancos de dados que são públicos http://genatlas.medecine.univ-paris5.fr/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ http://www.ensembl.org/index.html * Validação in sílico Algumas características importantes: Tamanho do primers A temperatura de anelamento Evitar estruturas secundárias Avaliação da ΔG do sistema e na extremidade 3’ * Validação in sílico Algumas características importantes: Tamanho do primers A temperatura de anelamento Evitar estruturas secundárias Avaliação da ΔG do sistema e na extremidade 3’ * Validação in sílico Algumas características importantes: Tamanho do primers A temperatura de anelamento Evitar estruturas secundárias Avaliação da ΔG do sistema e na extremidade 3’ * Validação in sílico Algumas características importantes: Tamanho do primers A temperatura de anelamento Evitar estruturas secundárias Avaliação da ΔG do sistema e na extremidade 3’ * Validação in sílico Programa * Validação in sílico * Validação in sílico * PAGE (Acrilamida : Bis - 49:1) Gel de 5%a 6% 5% Glicerol - agente desnaturante fraco - detecta mutações raras Temperatura: 4 - 25 C Eletroforese: 10-20W (12-16 h) Detecção: Prata Eficiência: < 200 pb (100%) * Eletroforese em gel poliacrilamida * Análise de gel * Análise de gel * Análise de gel * Análise de gel * Análise de gel * Sequenciamento * Sequenciamento Realizado pelo Método Enzimático Dideoxicleotídeos são marcados com fluorocromos, misturados em uma única reação A reação é aplicada em gel de poliacrilamida e, durante a corrida, os fluorocromos passam por um feixe de “laser” que excita a molécula, emitindo luz em diferentes comprimentos de onda * Sequenciamento A luz emitida pelos fluorocromos é detectada por um fotomultiplicador e a informação é processada por computador, gerando a sequência DNA Traqueamento único Visualização * Técnicas de Biologia Molecular: PCR e Sequenciamento do DNA Centro de Ciências Exatas e da Natureza Departamento de Biologia Molecular Disciplina: Genética Eleonidas Moura Lima * * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox * Texto xerox *
Continue navegando
Materiais relacionados
Perguntas relacionadas
