Sequenciamento genético para prevenção e diagnóstico de doenças

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Sequenciamento genético para prevenção e diagnóstico de doenças
DNA
O DNA é a sigla do termo ácido desoxirribonucleico, que é a maior macromolécula celular, sendo formado a partir da união de compostos químicos chamados de nucleotídeos.
 Desde a descoberta da dupla fita de DNA surgiram diversas ciências, entre elas a genética e a biologia molecular. 
 Os estudos surgiram com o objetivo de conhecer o funcionamento de uma célula ou organismo, além de conhecer possíveis doenças e tentar encontrar a cura. 
 Para que isso fosse possível foram descobertas várias técnicas, entre elas o sequenciamento do genético, afim de descobrir a sequência das bases nitrogenadas do DNA.
O sequenciamento de DNA ou sequenciação de ADN é uma série de métodos bioquímicos que têm como finalidade determinar a ordem das bases nitrogenadas adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T) da molécula de DNA.
 O primeiro método de sequenciamento de DNA surgiu em meados dos anos 70 e ficou conhecido como método químico ou Maxam – Gilbert, método no qual foi amplamente aplicável na época. Alguns anos depois, em 1977, Frederick Sanger propõe um método diferente e mais eficiente chamado de método enzimático ou de Sanger. Esse método logo se tornou altamente replicável e é utilizado até os dias de hoje.
 A reação é realizada em 4 tubos de ensaio. Cada tudo contêm: DNA; DNA polimerase; Primer; Nucleotídeos; E um tipo de ddNTP diferente. Após isso ocorre a replicação em todos os tubos
 Dentro de cada tubo a replicação acontece e termina em lugares diferentes. No final do processo temos fragmentos da fita de DNA de diferentes tamanhos. O conteúdo desses tubos é aplicado em gel de poliacrilamida e separado por tamanho (eletroforese). Os fragmentos menores ficaram mais em baixo e os maiores mais em cima. Para obter a sequência do DNA, a leitura é feita de baixo para cima, resultando em fragmentos que se sobrepõem, e formam a fita completa de DNA.
Pirosequenciamento
 Proposto por Mostafa Ronaghi (1996); 
 Instituto Real Tecnológico da Suécia; Pesquisador na Universidade de Stanford; 
 Vice-presidente da Illumina Company;
 Primeira alternativa ao método de Sanger para sequenciamento do DNA
Princípios
Detecção através da Luz;
 Liberação de Pirofosfato na adição de um nucleotídeo;
 Ação de 4 diferentes enzimas:
 DNA polimerase; 
 ATP sulfurilase; 
 Luciferase; 
 Apirase; 
 Substratos utilizados: 
 Adenosina 5’ fosfossulfato (APS); Luciferina; 
 Resultados obtidos rapidamente.
Etapas
 Passo 1
 Extração do DNA.
 Passo 2 
Adição do Desoxirribonucleotídeo Trifosfato (dNTP); 
DNA polimerase catalisa a incorporação do dNTP na fita; Complementar à fita molde; 
Liberação de pirofosfato (PPi); Quantidade equivalente à de nucleotídeos incorporados.
 Passo 3 
 ATP sulfurilase converte PPi para ATP; Presença de adenosina 5’fosfossulfato (APS); 
 Conversão de luciferina em oxiluciferina (pela luciferase); 
 Luz visível; 
Proporcional à quantidade de ATP; Detcção é feita por um chip ; 
Gera um pico na saída de dados do software; 
 Cada pico (sinal de luz) é proporcional ao número de nucleotídeos.
 Passo 4 
 Apirase degrada nucleotídeos não incorporados e ATP; 
 Após degradar, mais nucleotídeos são adicionados. 
 Passo 5 
 Adição de dNTP é realizada sequencialmente; 
Cadeia complementar de DNA é construída; 
 Sequência nucleotídica é determinada a partir dos picos.
Aplicações
Identificação de bactérias; 
Tipagem fúngica e viral; 
Detectar mutações;
Análises de metilação do DNA; • Sequências múltiplas; 
Verificações de clones; Sequenciamento do genoma humano.
 Vantagens:
 Processo automatizado 
 Tempo de análise curta;
 Resposta instantânea do sequenciamento; 
 Alto rendimento;
 Preparo rápido da amostra;
Ion torrente
Parecido com o pirosequenciamento; 
Utiliza microchip para deterctar a incorporação do dNTP; 
Chip mede a diferença de pH;
Evolução acompanha informática;
Funcionamento
DNA é fragmentado; 
Adição de marcadores;
Cada fragmento liga-se a um “bead”;
“Beads” são posicionados em poços;
Ocorre replicação do fragmento; 
Cobre o “bead”;
Poços individuais;
Banho de dNTP; 
Caso dNTP ligue-se, libera H+; 
Variação do pH detectada pelo chip;
Análises rápidas ~2h; Elevada sensibilidade; 
Ideal para DNA pequeno a médio; Baixo custo;
Localiza prontamente sítios específicos no DNA; 
Altamente recomendado para avaliação de fragmentos específicos;
Aplicacoes
Biologia molecular 
Sequenciamento é utilizado no estudo de genes e quais proteínas codificam
Biologia evolutiva 
O sequenciamento do DNA é útil para entender como diferentes organismos estão relacionados; 
Medicina 
Pacientes podem saber se apresentam doenças genéticas; 
 Ciência forense 
Identificação; Teste de paternidade;