Relatório Microbiologia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS - EQA
ENGENHARIA DE ALIMENTOS
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS II
Carolina Marques - 88853
Cinthia Silveira - 81809
Islaine Kelle Ortiz - 88855
Renata Vaz - 82228
Ruth Gaudêncio - 85277
CONTAGEM DE STAPHYLOCOCCUS COAGULASE POSITIVO
Profª Susana Kalil
Rio Grande - RS
2017
SUMÁRIO
21. INTRODUÇÃO	�
32. MATERIAL E MÉTODOS	.�
32.1 MATERIAL	�
32.2 MÉTODOS	�
52.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO	�
93. CONCLUSÃO	�
10REFERÊNCIAS	�
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1. INTRODUÇÃO
As bactérias do gênero Staphylococcus pertencem à família Micrococcaceae, são Gram-positivas e apresentam forma esférica de cocos, que podem formar arranjos, e apresentam crescimento em condições anaeróbias facultativas ou aeróbias, onde são capazes de produzir catalase (FRANCO, 2006). O Staphylococcus aureus é um microrganismo amplamente dissipado no meio ambiente, como o ar, água, solo e esgoto, sendo a cavidade nasal de homens e animais domésticos seu principal reservatório. 
Em condições ótimas ocorre a produção de enterotoxinas termoestáveis e resistentes a enzimas proteolíticas sendo classificadas como coagulase positivas e consideradas patogênicas, uma vez que podem produzir toxina estafilocócica (SANTANA et al., 2010).
	A enumeração de ECP (estafilococos coagulase positiva) é reconhecida internacionalmente como um padrão microbiológico de segurança de alimentos e importante indicador das condições higiênico-sanitárias da sua produção e conservação (RESTA e OLIVEIRA, 2013).
A intoxicação por essa bactéria ocorre devido à ingestão de um alimento contaminado, assim a prática de análise de extrema importância para determinar a sanitinização do mesmo, para padrões estabelecidos da qualidade higiênica uma vez que a ingestão por enterotoxinas termoestáveis podem produzir enterotoxinas causadoras de gastroenterites nos seres humanos com ou sem diarréia (SILVA, et al., 2015), as quais são principalmente produzidas por S. aureus.
Considerando a importância da determinação da presença de cepas de Staphylococcus coagulase positiva em alimentos, em setembro de 2017 realizou-se uma análise no laboratório de microbiologia de alimentos da Universidade Federal do Rio Grande, com o objetivo de verificar a presença de S. aureus em uma amostra de bolo, assim como a realização do teste de coagulase para este microrganismo. 
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 MATERIAL
• 9 Placas de Petri; 
• 7 pipetas de 1 mL; 
• 225 mL de água peptonada 0,1%; 
• 3 a 5 tubos de diluição com 9,0 mL de água peptonada 0,1%; 
• alça de Drigalski; 
• 200 mL de ágar Baird-Parker (meio base); 
• solução de telurito de potássio 1% p/v esterilizada por filtração; 
• emulsão de gema de ovo; 
• tubos de ensaio contendo 5 mL de caldo infusão cérebro-coração; 
• amostra de bolo confeitado. 
2.2 MÉTODOS 
Para realizar a inoculação foi pesado assepticamente, 25g de amostra, de bolo confeitado que foi transferido para uma bolsa de homogeneização previamente esterilizada onde se adicionou 225mL de água peptonada esterilizada e homogeneizou-se por 1 a 2 minutos no extrusor, obtendo-se a primeira diluição 10-1.
 Para o preparo da segunda diluição de 10-2, foi transferido assepticamente 1,0 mL da diluição 10-1 para um tubo de ensaio contendo 9 mL do diluente. As diluições subseqüentes foram obtidas de maneira similar. 
Da primeira diluição, inoculou-se 1 mL (0,3 mL em 3 placas diferentes e 0,1 mL em outra) e das demais diluições inoculou-se 0,1 mL na superfície de placas de Ágar Baird-Parker (BP), previamente preparadas. Após o inóculo foi espalhado com alça de Drigalski, das placas de maior para as placas de menor diluição, até que todo o excesso de líquido fosse absorvido e a secagem completa, sendo as placas então incubadas invertidas a 35-37°C por 48 horas.
 Após a o período de incubação foram selecionadas placas com 20 a 200 colônias para a contagem de colônias típicas de Staphylococcus coagulase positivas, que se apresentassem circulares, pretas, pequenas (máximo 1,5 mm em diâmetro), lisas, convexas, com bordas perfeitas esbranquiçada, rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo transparente. 
Foram selecionadas no mínimo 5 colônias típicas para teste de coagulase, sendo cada uma transferida para um tubo com 5 mL de Caldo Infusão Cérebro Coração (BHI), e então emulsionadas, após os tubos foram incubados a 35-37°C/24 horas.
Em seguida da incubação procedeu-se o teste de coloração de gram onde foi colocada uma gota de solução salina estéril em uma lâmina seca e limpa, então, retirou-se uma pequena quantidade do inóculo com a alça de platina, que foi espalhado na lâmina, até a obtenção de um esfregaço fino, o qual foi aderido à lâmina através de calor, passando-o de duas a três vezes sobre o bico de Busen. Logo após, adicionou-se do corante primário Cristal Violeta ao esfregaço, que depois de um minuto foi desprezado. Em seguida, a lâmina foi coberta com a solução de Lugol, por aproximadamente um minuto e trinta segundos, e após, seu excesso foi descartado. Na próxima etapa, com a lâmina inclinada e lavada com álcool-acetona até que não houvesse o desprendimento do corante. Então, a lâmina foi lavada rapidamente em água corrente e posteriormente, coberta com o corante secundário, a Fucsina básica, que após 30 segundos foi lavada e seca (sem esfregar). Logo após, o microrganismo foi visualizado no microscópio óptico e identificado. 
Também após a incubação foi realizado o teste de coagulase, sendo transferido 0,2 mL de cada cultura obtida em BHI, para tubo de ensaio com tampa de rosca contendo 0,5 mL de Coagulase Plasma-EDTA (plasma de coelho com EDTA) e misturou-se com movimentos de rotação, sem agitar os tubos, para não interferir na coagulação. Foram incubados durante 6 horas a 35-37°C. Após foi observado se houve a formação de coágulo nos tubos em intervalos de uma hora, sempre com o manuseio cuidadoso dos tubos para não haver rompimento do coágulo. 
Com a coagulação completa de todo o conteúdo do tubo, formando um coágulo firme que não se rompe quando o tubo é virado para baixo é considerada reação positiva de nível 4+ (Figura 1). A coagulação da maior parte do conteúdo do tubo, formação de um coágulo grande e organizado, é considerada reação positiva de nível 3+. A formação de um pequeno coágulo organizado ou de pequenos coágulos desorganizados caracterizam reações positivas de níveis 2+ ou 1+ respectivamente. As reações de níveis 3+ e 4+ são confirmativas de Staphylococcus coagulase positiva (FDA, 2001). Nos tubos em que a reação não foi observada neste período, estende-se a incubação por até 24 horas (OLIVEIRA, 2011).
2.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na realização da análise, após a amostra ser homogeneizada, 1 mL da primeira diluição é inoculada, pelo método de disseminação, em quatro placas de petri contendo ágar BP, três destas placas com 0,3 mL e a última com 0,1 mL. Isto é feito, no caso em que a contagem estimada para S. aureus na amostra for menor do que 100 UFC/g ou mL, assim, as placas contendo entre 25 a 250 colônias típicas são selecionadas e contadas, sendo a soma destas colônias, multiplicada pelo fator de diluição, o total de unidades formadoras (PAULO, 2005).
As características seletivas utilizadas no isolamento do micro-organismo, o crescimento a 42-43ºC em NaCl (5,5 a 10%), cloreto de lítio (0,01 a 0,05%), glicina (o,12 a 1,26%), manitol e polixima (40mg/l), a capacidade de redução de telurito de potássio (0,0025 a 0,05%) o que produz as colônias pretas em meio sólido, a capacidade de hidrolisar gema de ovo e a atividade de coagulase e termonuclease.
O Ágar de Baird-Parker foi o meio de cultura utilizado para o isolamento e a enumeração de Staphylococcus coagulase positiva, pois combina os agentes seletivos necessários e evita o acúmulo de peróxido de hidrogênio (tóxico para células), a seletividade deste meio se deve à presença de cloreto de lítio e teluritode potássio, que inibem a microflora competidora, assim como à glicina, que é um componente essencial da parede celular estafilocócica, e ao piruvato de sódio, que auxilia na recuperação das células danificadas, assim, a multiplicação desta bactéria é incentivada. Ao meio, ainda é acrescentado gema de ovo para facilitar a visualização das colônias, que apresentam uma coloração preta em função da redução do telurito a telúrio, além disso, a partir da hidrólise da gema de ovo pela enzima lipase, essas colônias irão apresentar um halo claro de lipólise e de proteólise em seu entorno, neste caso, são definidas como colônias típicas as que apresentam coloração preta com um halo ao seu redor, como ilustra a figura 1, contudo o mesmo permite também o crescimento de outras espécies de Staphylococcus, que apresentam colônias parecidas, sendo necessário após a confirmação de colônias típicas o teste de coagulação para confirmação da espécie (SILVA, et al, 2007).
Figura 1. Colônia típica de Staphylococcus coagulase positiva.
A contagem foi realizada em apenas uma das placas da duplicata para diluição 10-2, supondo que o espalhamento por disseminação foi mal efetuado na outra placa, que apresentou colônias muito grandes e unidas umas às outras. Para essa então, foram contadas 61 colônias, sendo cálculo de UFC/g no bolo confeitado, realizado após a confirmação das colônias contadas. 
Após a incubação, realizou-se a coloração de Gram para os tubos 1 e 4, assim como o teste de coagulase para todos os 5 tubos do teste confirmativo. A coloração de gram foi efetuada para auxiliar na confirmar a cultura de S. Aureus, obtendo-se um resultado de cocos gram positivos para o tubo 1 e de bacilos gram positivos para o tubo 4, como ilustra a figura 2, respectivamente.
Figura 2. Resultados obtidos pela coloração de gram, para os tubos 1 e 4, respectivamente.
A coagulação da maior parte do conteúdo do tubo, formando um coágulo grande e organizado, é considerada reação positiva de nível +3. A formação de um pequeno coágulo organizado ou de pequenos coágulos desorganizados caracteriza reações positivas de nível 2+ ou 1+, respectivamente. As reações de nível 3+ ou 4+ são confirmativas da presença de S. aureus coagulase positiva (figura 3). Culturas com reações positivas de nível 1+ ou 2+ devem ser submetidas a testes adicionais para a confirmação (SILVA, et al, 2007). 
Figura 3. Possíveis resultados para o teste de coagulase
Como resultado do teste de coagulase, nunhum dos 5 tubos submetidos a avaliação apresentou resultado positivo, como pode-se observar na figura 4. 
Figura 4. Resultados obtidos no teste de coagulase
	A partir do resultado obtido, foi possível calcular a porcentagem de tubos positivos, assim como, a contaminação de S. aureus na amostra analisada. 
Devido a ausência da reação de coagulação estimou-se UFC/g.
Dentre os alimentos mais frequentemente implicados em surtos, encontram-se os bolos confeitados, pratos à base de carne de frango desfiado, queijos e maionese de legumes, ou seja, são alimentos que exigem uma manipulação para o seu preparo, os quais muitas vezes são estocados em temperaturas inadequadas, uma vez que a enterotoxinas podem ser produzidas entre 10 e 46 ºC (SILVA, et al., 2015). 
De acordo com Goulart, Lacerda e Dias foram realizadas análises de amostras de bolo confeitado na Universidade Federal de Minas Gerais. Em um total de 32 amostras de bolos confeitados 29 (90,6%) destas obtiveram uma contagem de Staphylococcus coagulase positiva (SCP) superior a 1,0 x 105 UFC/g proveniente de manipulação e da produção de recheio e cobertura, com indicativos de que os bolos foram mantidos a temperatura ambiente por longos períodos antes de serem servidos.
Em contrapartida, na análise realizada na prática de aula, de um mesmo tipo de produto, foi obtido um valor inferior a 10-1 UFC/g, estando abaixo do valor permitido na legislação, o que pode ser indicador de uma manipulação e conservação adequada do bolo confeitado.
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3. CONCLUSÃO
Com a realização da prática foi desenvolvida a técnica e o conhecimento para verificar a contaminação de alimentos por S. aureus, entendendo a necessidade de realização para confirmação da espécie em questão, evitando assim o risco de consumo de um produto contaminado ao consumidor, além do comportamento em laboratório. E a confirmação de que bolo confeitado como amostra na aula, apresentava ausência do micro-organismo por não apresentar nenhum resultado positivo no teste de coagulase, sendo indícios de uma manipulação e armazenamento adequados. 
REFERÊNCIAS
(BBL Coagulase Plasmas. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection, 2005. p. 1. 
SILVA, N. da.; et all. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. 3.ed.- São Paulo: Editora Livraria Varela, 2007.
Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Módulo IV, p. 15-16. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_4_2004.pdf>. 
GOULART, Ana Elisa Resende; LACERDA, Inayara Cristina Alves ; DIAS, Ricardo Souza. Potencial Risco de Intoxicação Alimentar por Staphylococcus Spp. Enterotoxigênicos Isolados de Bolos com Cobertura e Recheio. 2016. 7 f. Monografia ( Trabalho de Conclusão de Curso, Bacharelado em Farmácia)- Universidade Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, 2016.
PAULO, E. M. Manual da disciplina Microbiologia de Alimentos. Universidade Estadual de Feira de Santana. p. 19. Feira de Santana - Bahia, 2005.
SILVA, J. P. L. da., et al. Staplylococcus spp. Incidência e surtos. Embrapa Brasília – DF, 2015.
FRANCO, B.D.G.M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, 2005.
FORSYTHE, S. Microbiologia da Segurança Alimentar. Porto Alegre: Artmed, 2002.
JAY, J.M. Microbiologia de Alimentos. 6 ed. Porto Alegre: Artmed, 2005.
RESTA, M. S. A. e OLIVEIRA, T. C. R. M. Avaliação do padrão estafilococos coagulase positiva estabelecido pela legislação brasileira para massas alimentícias. Londrina – Paraná: Brazilian Joournal of Food Technology, 2013. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1981-67232013000400009&lng=pt&tlng=pt> Acesso em: 21 de outubro de 2017