Diluição e contagem de Unidades Formadores de Colônias

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Diluição e contagem de Unidades Formadores de Colônias (UFC)
· A diluição decimal seriada da amostra é requerida nos ensaios quantitativos porque através dela é possível realizar a contagem. Ela visa reduzir o número de microrganismos por unidade de volume, permitindo a contagem. Essa diluição geralmente é decimal, para facilitar o posterior cálculo dos resultados de quanto de colônias tem por grama de alimento. 
· Inicialmente, é feita a preparação da amostra utilizando 25 gramas do alimento a ser analisado diluído em 25 mL de água peptonada estéril e, depois, homogeneizado. É importante adotar todos os procedimentos de antissepsia para garantir a segurança da amostra, de forma que ela não seja contaminada. 
· Na diluição 1 pra 10, ou 10-¹ são diluídos 0,1 mL de solução em 0,9 mL de água pepitonada. Na segunda diluição, a 1 pra 100 ou 10-², é diluído 0,1 mL de solução do tubo anterior em 0,9 mL de água pepitonada e assim por diante.
· A quantidade de diluições vai depender de vários fatores, principalmente do nível de contaminação esperado e deve ser de forma que permita, na contagem de placas, a obtenção de placas com número de colônias adequado. 
· Exemplo: Uma amostra com leite tem 10.000 bactérias por mililitro. Se 1ml desta amostra fosse semeado em placa, teoricamente 10.000 colônias deveriam se tornar no meio da placa de Petri, porém, isso não produziria uma placa contável. Se 1ml dessa amostra fosse transferido para um tubo contendo 9ml de água estéril, cada mililitro do fluido dentro do tubo conteria 1.000 bactérias. Se 1ml dessa amostra fosse inoculado em uma placa de Petri, ainda teriam colônias demais na placa para realização da contagem. Portanto, outra diluição deveria ser feita. Um mililitro contendo 1.000 bactérias deveria ser transferido para um segundo tubo de 9 ml de água. Cada mililitro nesse tubo conterá agora somente 100 bactérias, e se 1ml do conteúdo do tubo fosse inoculado em placa, 100 colônias potenciais seriam formadas um número facilmente contável. 
· Para contagem em placas, é importante que somente um número limitado de colônias se desenvolva na placa. Quando muitas colônias estão presentes, algumas células são reprimidas e não podem se desenvolver. Uma recomendação da Food and Drug Administration é a contagem de placas com somente 25 a 250 colônias. Para assegurar que algumas contagens de colônias estejam nessa faixa, o inóculo inicial é diluído várias vezes. 
· Posteriormente, deve ser feito o cálculo do número de colônias. A ISO 7218-2007 é uma regra geral para ensaios em que todas as colônias (ou todas as colônias típicas) são consideradas nos cálculos (sem confirmação).
UFC/g ou ml = o somatório do n° de colônias / V x [n1 + (0,1 x n2)] x d
V = volume inoculado em cada placa (geralmente 0,1 ml no plaqueamento em superfície ou 1ml no plaqueamento em profundidade)
N1 = número de placas contadas da primeira diluição selecionada (geralmente é 1 quando não foi feito duplicada e 2 quando foi feita duplicata)
N2 = número de placas contadas da segunda diluição selecionada
D = primeira diluição retida para contagem (10-¹ = 0,1, 10-² = 0,01, 10-³ = 0,001 e assim por diante)
· Quando a inoculação é feita em duplicata, n1=2 e n2=0. Quando a inoculação não é feita em duplicata, o n1=n2=1, então, a equação pode ser simplificada para: 
UFC/g ou ml= somatório / V x 1,1 x d
Exemplo de inoculação em duplicata:
UFC/g ou ml = o somatório do n° de colônias / V x [n1 + (0,1 x n2)] x d
UFC = 36/0,1 x [2+(0,1x0)] x 0,1
UFC = 36x0,02
UFC = 36 x10³
Contagem de Staphylococcus aureus em alimentos
· Sua contagem é muito importante pois, através dela, é possível identificar o envolvimento desse microrganismo em intoxicações alimentares, serve como indicador de contaminação pós processo ou das condições de sanificação das superfícies destinadas ao contato com alimentos.
· A contagem de S. aureus baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras em ágar Baird-Parker, cuja composição evidencia a habilidade desse microrganismo de crescer na presença de 0,01 a 0,05% de telurito de potássio em combinação com 0,2 a 0,5% de cloreto de lítio e 0,12 a 1,26% de glicina. O S. aureus reduz anaeróbia e aerobiamente o telurito de potássio, produzindo colônias negras. O ágar Baird-Parker suplementado com solução de gema de ovo possibilita a verificação das atividades proteolítica e lipolítica do S. aureus, por meio do aparecimento de um halo de transparência e um de precipitação do redor da colônia, respectivamente.
· Existe dois tipos de colônias: as colônias típicas são circulares, preta pequenas, lisas, convexas, com bordas perfeitas, massa de células esbranquiçadas nas bordas, rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo transparente se estendendo para além da zona opaca; as colônias atípicas são cinzentas, sem um ou ambos os halos típicos. São selecionadas as colônias típicas e realizadas as provas bioquímicas.
· As provas bioquímicas são realizadas por:
Teste de catalase: colocar a massa celular em uma lâmina e gotejar peróxido de hidrogênio, se houver desprendimento de gás o teste é catalise +. Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o peróxido de hidrogênio, liberando oxigênio, o que é evidenciado por meio da formação de borbulhas.
Teste de coagulase: Adicionar 1 gota de soro bovino e depois adicionar uma colônia de células, se houver formação de coágulo é catalase +. Baseia-se na comprovação da capacidade de coagular o plasma pela ação da enzima coagulase produzida pelo microrganismo.
Coloração de Gram: Baseia-se na verificação das características morfológicas e tintoriais do microrganismo. O esfregaço é feito em lâmina e fixado, em seguida, é realizada a coloração. Para coloração, é adicionado o cristal de violeta de genciana deixando-o agir por 1 minuto, em seguida escorre e adiciona o lugol deixando por mais 1 minuto. Posteriormente, lava com água e adiciona álcool-cetona, que é um descolorante, e deixa agir por 30 segundos. A lâmina é lavada em um filete de água e seca com auxílio de um papel de filtro limpo ou ao ar livre. Por fim, é aplicado uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e levado ao microscópio para ser observado. As células visualizadas da cor violeta são Gram-positivas e as células visualizadas de cor rosada são Gram-negativas.