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IMUNODIAGNÓSTICO
Parte 2
Testes utilizados em 
Imunologia Clínica 
Testes de Reagentes Marcados
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CARACTERÍSTICAS
Alta sensibilidade
Boa especificidade
Direta – detecção de Antígeno
Indireta – detecção de Anticorpo
Permitem automação completa ou parcial 
Permite detectar diferentes classes de Anticorpos
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Reagente marcado
- Tipo de marcador determina nome do teste
MARCADOR
Radioisótopo = RADIOIMUNOENSAIO
Fluorocromo = IMUNOFLUORESCÊNCIA
Enzima = ELISA, IMUNO-DOT, WESTERN BLOT
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Radioimunoensaios
 		 Utilizam Ac conjugados com radioisótopos para quantificar os ensaios. Moléculas marcadas com isótopo ( I 125 ,I 131 )
 • Vantagens:
– Alta sensibilidade
– Permite medidas rápidas e precisas
– Limiar de detecção em nanogramas e picogramas.
• Desvantagens:
– Custo
– Vida média dos reagentes
– Risco operacional (radiação)
– Descarte de materiais
Princípio 
	Quantidade de reagente marcado (radioativo) quantifica o Ag ou Ac não marcado presente na amostra através de ligação específica
	Medida da resposta - contagem radioativa - tipo de radiação emitida
		- radiações  e  - contador de cintilação
		- radiação  - contador gama de cristal sólido
Realizado em 3 estágios
Estágio 1 – construção da curva de calibração – diluição seriada do padrão
Estágio 2 – interpolação dos resultados
Estágio 3 – controle de qualidade (amostras com [ ] conhecida) 
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RADIOIMUNOENSAIO
Imunofluorescência
- Utilizam-se Anticorpos ou Antígenos conjugados a moléculas reveladoras chamadas fluorocromos.
 Visualização em microscópio de fluorescência
Imunofluorescência / Imunohistoquímica: 
	Utilizados para detecção e localização de antígenos em células e tecidos e para detecção de anticorpos específicos em fluidos biológicos.
 Métodos de alta especificidade e alta especificidade
 Utilização de anticorpos conjugados com substâncias fluorescentes na Imunofluorescência, e de anticorpos conjugados com enzimas (Imunohistoquímica).
Princípio da técnica: 
 
Anticorpos ou antígenos são conjugados a um fluorocromo, que, quando excitado por radiações UV, emite luz no espectro visível. 
A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação em um microscópio de fluorescência
 Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT).
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) 
IFA direta:
Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. 
Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais, e doenças imunológicas renais e de pele.
IFA indireta: 
Pesquisa de antígenos (plasmódio em hemácia) e de anticorpos (sífilis, toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples, doença de chagas, malária, etc)
Diluições seriadas – título de Ac – máxima diluição onde há fluorescência
 
 
	Isotiocianato de fluoresceína (FITC) VERDE 
 
2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:
Imunofluorescência Direta
Aplicações:
 Detecção direta de microrganismos 
(secreções, urina, cortes de tecidos); 
 Identificação de subpopulações de linfócitos;
 Fenotipagem de células tumorais
Ex.: Detecção de Chlamydia trachomatis 
em secreção uretral
Ex.: Detecção de Ac anti- T. cruzi
Aplicações:
 Detecção de anticorpos específicos contra 
diversos microrganismos 
 Diagnóstico de doenças auto-imune 
 Detecção de Ac anti-nuclear
Imunofluorescência Indireta
Treponema pallidum
Pneumocystis carinii
Tripanosoma cruzi
Giardia lamblia
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Vantagens: 
Alta especificidade e sensibilidade
Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização.
Desvantagens:
“Variação individual” na leitura de resultados de IFA 
Alto custo de microscópio de fluorescência
Técnicas especiais de fixação e inclusão de tecidos para Imunohistoquímica nem sempre disponíveis.
2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:
Microscópio de imunofluorescência
Filtro de excitação
lâmina
Fluorescência emitida
Filtro de emissão
Fonte de luz branca
câmera
Fibra óptica
Fibra óptica
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Microscópio de imunofluorescência automatizado
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ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
- Baseia-se na quantificação de uma reação enzimática associada com complexos imunes.
 ELISA
- Capaz de detectar pequenas concentrações de Antígenos e Anticorpos.
- Reagente ligado a uma enzima
- Imobilização em fase sólida - placa de poliestireno
Uso: 
Detecção de Ac para diversas doenças e Ag como partículas virais, hormônios, proteínas tumorais e interleucinas
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 ELISA
	Técnica que utiliza Ag/Ac imobilizado em placa de polímero de carbono, e anticorpo conjugado a uma enzima, a qual, após agir sobre seu substrato em presença de substância cromógena, amplificará a detecção da interação Ag/Ac através da formação de cor.
Variações da Técnica: ELISA Quimioluminescente, ELISA Fluorescente, ELISA Radioativo
 Vantagens:
Alta sensibilidade e especificidade, 
Rapidez, 
Baixo custo 
Adaptação a diferentes graus de automação
 
Desvantagens:
Devido a alta sensibilidade, pequenas variações de pipetagem e tempo de incubação podem ocasionar resultados alterados
Determinação de Ag
 
 Determinação de Ac
 
Tipos: 
Direta, Indireta, de Captura e Competivo
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ELISA
 substrato 
 
 Qualitativos
 Quantitativos
 Ac marcados 
 com Enzimas
+
+
Ag
Fosfatase alcalina
Peroxidase
B-galactosidase
DIRETO OU SANDUÍCHE
INDIRETO
= COR
ELISA Competitivo (1)
ELISA Competitiva (2)
ELISA Competitiva (3)
ELISA Competitiva (4)
ELISA Competitiva (5)
ELISA Competitiva (6)
ELISA Competitiva (7)
ELISA Competitiva (1)
ELISA Competitiva (9)
ELISA Competitiva (10)
Determinação de resultados
ELISA: Espectrofotômetro
cutoff
zona cinza (20%)
Não-reagente
Reagente
0,0
1,0
3,0
Exemplo:
D.O.
0,8
1,2
(testes não-
competitivos)
Sistema 
de leitura
Fonte: Prof. Aelson Brum
absorbância
ou D.O.
Axsym (MEIA) – fluorômetro
Architect (CMIA) – luminômetro
 [S/CO]	
ELISA
2.5.2- Quantificação de Ag/Ac em ELISA:
CURVA PADRÃO - ELISA
Competitivo ou não 
Competitivo:
Quanto maior a concentração do analito menor a contagem do sinal 
Amostras positivas tem leitura abaixo do valor limiar ou “cut-off”
Não Competitivo
Quanto maior a concentração do analito maior a contagem do sinal 
Amostras positivas tem leitura acima do valor limiar ou “cut-off”
Imunoensaio de micropartículas (MEIA)
Axsym/Abbott
EIE de micropartículas (MEIA)
Micropartículas revestidas com anticorpo anti-analito e amostras são incubadas
 Uma alíquota da mistura de reação é transferida para matriz de fibra de vidro
Conjugado (fosfatase alcalina) liga-se ao complexo da micropartícula
Substrato MUP é adicionado à matriz.
Produto fluorescente (MU) é medido.
Ensaios quimioluminescentes (CMIA)
A sensibilidade de um método enzimático aumenta cerca de dez vezes mais substituindo um substrato cromogênico por um luminescente. São altamente sensíveis.
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Immuno-Dot
 Variação do ELISA conhecida como Dot-ELISA
 fase sólida - membrana de nitrocelulose, PVDF ou náilon 
 substrato cromógeno – forma produto estável e insolúvel – mancha (dot) 
 pode-se usar conjugado radiativo – detecção por auto-radiografia
 Vantagens: pequeno volume de amostra, teste rápido, com sensibilidade e especificidade boas
 Uso: emergência com suspeita de HIV e estudos epidemiológicos
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Fracione o pente de acordo com o número de amostras 
Colocar as amostras e os controles nos pocinhos da fileira A 
Colocar o pente na fileira A e incubar segundo as instruções
Colocar o pente na fileira B e incubar
Incubar nas fileiras C, D e E. Reação com substrato na fileira F
Ler os resultados e comparar com o padrão
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Ensaios imunocromatográficos
Teste rápidode HIV
(Ac anti-HIV)
Diagnóstico de gravidez
(detecção de beta HCG)
Ensaios imunocromatográficos
Ensaios imunocromatográficos
Teste rápido de HIV
(Ac anti-HIV)
Diagnóstico de gravidez
(detecção de beta HCG)
Tipos de ELISA
Citometria de Fluxo Metodologia
Citometria de Fluxo Metodologia
 Detecta, separa e quantifica células contendo um antígeno particular, marcadas com um fluorocromo.
 Cada anticorpo é marcado com um fluorocromo diferente
 As células são então analisadas no citômetro de fluxo.
Citometria de Fluxo Metodologia
 As células saem de uma célula de fluxo e são iluminadas por um raio laser; 
 A quantidade de raios laser que é dispersa para fora das células durante a passagem das mesmas pelo laser pode ser medida, o que proporciona informação a respeito do tamanho das células. 
Citometria de Fluxo Metodologia
Suspensão de mistura de células
Conjugado fluorescente 
Feixe de laser
Detector
Defletor
Células não- fluorescentes 
Células fluorescentes 
Usos: imunofenotipagem de linfócitos, avaliação de pacientes infectados pelo HIV, diagnóstico e prognóstico de leucemias 
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Aplicações:
Caracterização de populações celulares;
 Contagem de microrganismos;
 Separação de populações celulares de acordo com a densidade dos antígenos, tamanho e granulosidade das células;
- Análise de proliferação celular.
CD4 
CD8
CD19
CD4
CD8
CD20
Citometria de Fluxo
Vantagens do método
Mede múltiplos parâmetros em células individuais
Grande número de células analisadas com rapidez
Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos
Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares
Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.
Imunofenótipo da LLA
Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Desenvolvimento da linhagem mielóide
Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Imunofenotipagem
Triagem Inicial – Painel de Marcadores
Linhagem
Marcadores Imunológicos
Linfóide B
CD19
CD79a
CD10
CD22
Linfóide T
CD3
CD7
Mielóide
Anti-MPO
CD13
CD33
CD117
Não específica
CD45
CD34
tdt
Classificação Imunológica da LLA T
Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
APLICAÇÕES CLÍNICAS DA CITOMETRIA DE FLUXO
- Análise da subpopulação linfocítica
- Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas, HIV
- Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo
- Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas
- Análise de reticulócitos
- Detecção de anticorpos antiplaquetários
- Quantificação de células progenitoras (Stem cells)
- Avaliação imunológica de paciente transplantado
Western Blot
Etapas
 preparação do gel (concentração poliacrilamida/gradiente)‏
 SDS (detergente aniônico/confere carga negativa)‏
  migração: pólo -  pólo +
 preparo da amostra (solubilização das proteínas)‏
 separação das proteínas - PM - eletroforese em gel de poliacrilamida
 transferência (semi-seco; “over-night”)‏ membrana (nitrocelulose; PVDF)‏
incubação com amostras - presença de Ac específicos - complexo formado – conjugado 
 Visualização = cromógeno - precipitado colorido
 teste confirmatório
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