Testes Imunológicos em Laboratório

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Estudar pelo livro:
 "Diagnóstico laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Auto-Imunes" autores Antonio Walter Ferreira e Sandra Ávila. Ed Guanabara Koogan, 2001.
"Diagnóstico laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Auto-Imunes" autores Antonio Walter Ferreira e Sandra Ávila. Ed Guanabara Koogan, 2013.
Testes utilizados em
Imunologia Clínica – Testes de Reagentes Marcados
 Características
Alta sensibilidade
Boa especificidade
Direta – detecção de Ag
Indireta – detecção de Ac
Competição – amostra compete com reagente marcado
Custo mais alto – produção dos reagentes
Permitem automação completa ou não
Permite detectar Ac de uma classe específica que sejam específicos para um determinado Ag
Reagente marcado –  Ag ou Ac
Sistema heterogêneo – lavagem – retira reagente não ligado
 
Reagente marcado
- Marcação não modifica interação Ag-Ac
- Alto custo
- Permite detecção de classes específicas de Ac para um determinado Ag
- Tipo de marcador determina nome do teste
 
MARCADOR
Radioisótopo = RADIOIMUNOENSAIO
Fluorocromo = IMUNOFLUORESCÊNCIA
Enzima = ELISA, IMUNO-DOT, WESTERN BLOT
 
Radioimunoensaio
- Primeira técnica com reagente marcado
- desenvolvido em 1956 – detecção de Ac anti-insulina em pacientes tratados com o hormônio
- radioisótopos - I125 ou I131 – ligação a resíduos de tirosina em proteínas
- vantagens: quantitativo, rapidez, precisão, limiar de detecção em nano ou picogramas
- desvantagens: alto custo do teste, vida média dos reagentes e risco operacional – radiosótopos
- Uso: Ag e Ac, marcadores tumorais, hormônios
 
Princípio
quantidade de reagente marcado (radioativo) quantifica o Ag ou Ac não marcado presente na amostra através de ligação específica
medida da resposta - contagem radioativa -  tipo de radiação emitida
                    - radiações a e b - contador de cintilação
                    - radiação g - contador gama de cristal sólido
Realizado em 3 estágios
Estágio 1 – construção da curva de calibração – diluição seriada do padrão
Estágio 2 – interpolação dos resultados
Estágio 3 – controle de qualidade (amostras com [  ] conhecida)
  
Imunofluorescência
 
Princípio:
Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno.
 
Fluorocromos
- São substâncias que, absorvem luz de um comprimento de onda menor quando excitados com luz UV, emitem luz em comprimento de onda maior (fluorescência).
- Características: estabilidade, grande capacidade de absorção, absorção e fluorescência de luz no espectro visível, nenhuma interferência com a reação imunológica.
 Imunofluorescência direta
Conjugado - Ac marcado com fluorocromo
Vantagens: alta sensibilidade e especificidade, possibilidade de localizar componentes intracelulares com fluorocromos contrastantes
Desvantagens: um conjugado para cada Ag
Uso: imunohistoquímica – doenças renais e de pele
 Imunofluorescência indireta
- Conjugado Ac antiimunoglobulina específico – classes
- Diluições seriadas – título de Ac – máxima diluição onde há fluorescência
- Vantagens: sensível, específica, reprodutível , fácil, padronizada, mesmo conjugado determina Ac  produzidos em diferentes doenças
- Desvantagens: custo do microscópio, subjetividade na leitura e dificuldade de automação
 Técnicas imunoenzimáticas
- Ac ou Ag marcados com enzimas – conjugado
ENZIMA
        - elevada especificidade
        - fácil de ser obtida na forma purificada
        - conjugação a Ag e Ac – sem interferências
        - produto de reação com substrato – fácil de ser quantificado, mesmo com pequenas quantidades de enzima
        - estável
        - custo acessível
        - vários tipos – fosfatase alcalina, peroxidase
        - determina o tipo de substrato
 SUBSTRATO CROMOGÊNICO
        - ao serem consumidos por enzimas geram produtos coloridos solúveis ou insolúveis
        - quantificação do produto – espectrofotômetro, cor visual ou comparação com padrão
        - depende do tipo da enzima utilizada
 
PEROXIDASE
    - substrato H2O2 ligado a um cromógeno
    - cromógeno com produto solúvel - OPD ou TMB
    - cromógeno com produto insolúvel - DAB ou 4-cloro-1-naftol
FOSFATASE ALCALINA
    - cromógeno com produto solúvel - NPP
    - cromógeno com produto insolúvel – BCIP ou NBT
 SUBSTRATO FLUORIGÊNICOS
- emitem luz fluorescente após serem consumidos pela enzima
- quantificação da luz emitida pelo produto - fluorômetro
FOSFATASE ALCALINA
    - 4-metilumbeliferil-fosfato que gera um fluoróforo (4-metilumbeliferona)‏
 SUBSTRATO QUIMILUMINESCENTE
     - amplificação de sinal ® hormônios e marcadores tumorais
     - emitem brilho após serem consumidos pela enzima
     - quantificação do brilho emitido pelo produto - luminômetro
FOSFATASE ALCALINA
         - adamantildioexietano-fosfato que gera um ânion (adamantildioexietano)
 
Ensaio heterogêneo
- etapa de lavagem – retira reagente marcado não ligado a fase sólida
FASE SÓLIDA
        - conhecido como suporte
        - tubos, microplacas, micropartículas ou tiras
        - partículas de agarose, poliacrilamida, dextran, poliestireno
        - micropartículas – lavagem – decantação, centrifugação, adsorção em fibra de vidro ou captura
        - tipos: ELISA, dot – ELISA, IMUNNOBLOT
 Immuno-Dot
 Variação do ELISA conhecida como Dot-ELISA
 fase sólida - membrana de nitrocelulose, PVDF ou náilon 
 substrato cromógeno – forma produto estável e insolúvel – mancha (dot)
 pode-se usar conjugado radiativo – detecção por auto-radiografia
 Vantagens: pequeno volume de amostra, teste rápido, com sensibilidade e especificidade boas
 Uso: emergência com suspeita de HIV e estudos epidemiológicos
 
ELISA
- capaz de detectar < [ ] Ag e Ac
 reagente ligado a uma enzima
 imobilização em fase sólida ® placa de ploiestireno
 Vantagens: > sensibilidade e especificidade, rapidez, baixo custo e adaptação a diferentes graus de automação
 tipos: direta, indireta, de captura e de competição
 Uso: detecção de Ac para diversas doenças e Ag como partículas virais, hormônios, proteínas tumorais e interleucinas
 
Determinação de Ag
 ELISA direto de captura
 ELISA direto de competição
 Determinação de Ac
 ELISA indireto
 ELISA indireto de captura
 ELISA indireto de competição
 Western Blotting
 identificação de proteínas reconhecidas por Ac
 separação das proteínas - PM - eletroforese em gel de poliacrilamida
 transferência eletroforética -  nitrocelulose
 incubação com amostras - presença de Ac específicos -  complexo formado – conjugado
 Visualização = cromógeno - precipitado colorido
- teste confirmatório
 Etapas
preparação do gel (concentração poliacrilamida/gradiente)‏
SDS (detergente aniônico/confere carga negativa)‏
migração: pólo - ® pólo +
preparo da amostra (solubilização das proteínas)‏
tampão corrida
voltagem/amperagem
transferência (semi-seco; “over-night”)‏
membrana (nitrocelulose; PVDF)‏