Diagnóstico de leveduras

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IDENTIFICAÇÃO LABORATORIAL DE LEVEDURAS (Cap. 9, Sidrim)
INTRODUÇÃO
- A identificação de leveduras ao nível de espécie tem significância prognóstica e terapêutica, e permitem o início precoce de terapia antifúngica nos casos de doença sistêmica causada por Candida albicans ou por leveduras não-albicans.
- Espécies de levedura fazem parte da microbiota normal da superfície da pele e também de algumas mucosas como a cavidade oral, a vagina e o jejuno, o que torna ainda mais necessária a identificação da espécie isolada.
- Isolamento de leveduras a partir de sítios anatômicos estéreis é sinônimo de infecção fúngica.
- Indivíduo normal geralmente não desenvolve infecções fúngicas; os mecanismos de defesa podem ser, no entanto, desequilibrados por fatores intrínsecos ou extrínsecos (como doença de base, cateteres intravasculares e antibioticoterapia), tornando o indivíduo suscetível ao supercrescimento da população residente de leveduras, seguido por invasão e lesão dos tecidos vivos (infecção por fungos da microbiota normal, mesmo que estes sejam de baixa patogenicidade).
- As leveduras geralmente crescem bem dentro de 48 horas, sob temperaturas entre 25 e 37°C, em meios micológicos e bacteriológicos comuns, incluindo ágar-sangue e ágar Sabouraud dextrose (ASD). São fungos unicelulares, de reprodução assexuada (por meio de blastoconídios) e cosmopolitas.
- A maioria das leveduras produz colônias de coloração branca ou bege, textura cremosa e superfície lisa; alguns isolados apresentam borda fina estrelada ou franjada nas margens da colônia.
- Rhodotorula spp. podem produzir colônias de coloração alaranjada (imagem), Cryptococcus spp. em geral geram colônias mucoides, devido à presença de cápsula, enquanto as de Trichosporon spp. apresentam-se com aspecto seco e superfície rugosa, e as leveduras demáceas produzem colônias negras; isso pode orientar quanto ao gênero em uma visão macroscópica.
- Quando se observa crescimento de uma colônia leveduriforme, deve-se proceder ao exame microscópico da mesma, através de preparações com solução salina, lactofenol azul de algodão ou corante de Gram (mais utilizado: suspensão da levedura em lâmina com KOH 10%-20% e exame a fresco com adição de lactofenol). Observa-se a presença de estruturas arredondadas ou ovais em brotamento (blastoconídios), associadas ou não à presença de hifas e pseudo-hifas, o que dá a certeza de que o isolado se trata de uma levedura.
- As leveduras predominantes numa cultura, as provenientes de sítios normalmente estéreis e aquelas recuperadas repetidamente de pacientes imunossuprimidos devem ser identificadas.
- A pureza do cultivo deve ser revalidada sempre que for necessário, pois a identificação de espécie indefinida pode ser decorrente da presença de um contaminante.
- Em relação às características morfológicas, consideram-se aspectos (ou “aspéctos”, segundo a tia) macroscópicos da colônia e microscópicos da levedura (aspecto micromorfológico), fazendo-se uso também de metodologias específicas para detectar a presença de estruturas fúngicas como tubo germinativo e cápsula.
- Bioquimicamente, são investigadas a capacidade que as leveduras têm de utilizar determinados carboidratos e compostos nitrogenados como fontes de carbono e nitrogênio (auxanograma utilizando meio C e meio N) e a capacidade de fermentar alguns carboidratos (zimograma). Podem ser pesquisadas também a produção de urease ou fenoloxidase.
PROVA DO TUBO GERMINATIVO
- Método simples de triagem que permite a distinção presuntiva entre Candida albicans ou C. dubliniensis (tubo germinativo positivo) de outras espécies de levedura (tubo geminativo negativo).
- O tubo germinativo é uma projeção alongada, que emerge da levedura quando esta entra em contato com soro à temperatura de 37°C durante 2 a 3 horas. 
- Retira-se uma alíquota da colônia de levedura inocula em um tubo contendo soro de coelho, fetal bovino ou de cavalo suspensão é incubada a 37°C durante 2 a 3 horas remoção de uma gora da suspensão, que é examinada ao microscópio óptico.
- Não se pode confundir tubos germinativos com pseudo-hifas; o tubo germinativo é asseptado, sem constrição no ponto de inserção entre a projeção crescente e o blastoconídio, enquanto a pseudo-hifa pode ser septada ou não, e apresenta ponto de constrição em sua base.
- Resultados falso-negativos podem ocorrer em portadores de neoplasia submetidos a quimioterapia, ou no exame de pacientes tratados com antifúngicos, ou quando o inóculo é pesado (alíquota muito grande de levedura) ou, ainda, quando há refrigeração prolongada do soro.
- O falso-positivo é observado raramente, quando a incubação se prolonga por mais de 3 horas.
PROVA DO MICROCULTIVO (DALMAU, 1929)
- Possibilita o estudo micromorfológico das leveduras em meio ágar-fubá-Tween 80 ou ágar-arroz-Tween 80 incubação das leveduras em meio com Tween 80 e sob baixa tensão de oxigênio estimula a produção de conídios e filamentação, sendo possível sugerir o gênero, ou até mesmo a espécie, através do estudo da presença e disposição dos blastoconídios, artroconídios, hifas verdadeiras e pseudo-hifas.
- A presença de clamidoconídios é característica de C. albicans ou de C. dubliniensis, sendo seu melhor desenvolvimento no extrato de arroz, enquanto o de blastoconídios é intensificado no fubá.
- Presença de blastoconídios sem hifas ou pseudo-hifas Cryptococcus spp., Candida glabrata, Rhodotorula spp. ou Saccharomyces spp.
- Presença de artroconídios, blastoconídios e hifas Trichosporon spp.
- Presença apenas de hifas e artroconídios Geotrichum candidum.
- Em geral é preciso realizar provas bioquímicas adicionais para confirmar a identificação.
USO DE MEIO CROMOGÊNICO
- Meios de cultivo capazes de gerar o crescimento de colônias de cores distintas, segundo a espécie de levedura.
- Década de 90 CHROMagar Candida meio capaz de fazer a identificação presuntiva das espécies de levedura mais comumente isoladas de material clínico e de facilitar o reconhecimento de culturas mistas de leveduras.
- Princípio: produção de cor das colônias por reações enzimáticas espécie-específicas, com um substrato cromogênico do meio.
- Sensibilidade e especificidade do meio excede 99% para C. albicans, C. tropicalis e C. krusei (colônias verde, azul e rosa-pálido, respectivamente).
IDENTIFICAÇÃO DE Cryptococcus spp.
- Gênero caracterizado pela presença de cápsula de mucopolissacarídeos.
- C. neoformans é o principal agente de meningite fúngica (isolamento de células fúngicas no líquor neurocriptococose).
- Exame pode evidenciar a presença da capsula montagem da preparação entre lâmina e lamínula, utilizando tinta nanquim como líquido de montagem na proporção de 1:1 em água destilada nanquim não penetra na cápsula, que se apresenta como halo claro em torno da levedura, ressaltada contra o fundo preto do corante.
- OBS: espécies de Rhodotorula ou de Sporobolomyces também apresentam cápsula!
- Para discriminação do gênero pode-se utilizar também o teste de hidrólise da ureia, utilizando o meio de Christensen. Levedura produz urease que hidrolisa ureia, resultando em alcalinização do meio de cultura, o que é observado através de mudança da coloração do ágar do amarelo para o rosa intenso.
- Trichosporon spp., Rhodotorula spp. e Candida lipolytica também podem ser urease positivas, mas apresentam características morfológicas e bioquímicas distintas de Cryptococcus.
- C. neoformans é fenoloxidase positiva síntese de pigmentos de melanina a partir do fenol produção de colônias de tonalidade castanho-escuras ou negras sobre meio de niger, de sementes de girassol ou de ácido caféico.
- Finalmente, o meio CGB é empregado para a quimiotipagem das cepas de C. neoformans var. neoformans e C. neoformans var. gatti (??) var. gatti vira indicador de pH para azul-cobalto.
PRODUÇÃO DE ASCOS (LEVEDURAS ASCOSPORADAS)
- Alguns gêneros de leveduras produzem estruturas de reprodução sexuada (ascos) quando crescem em meio adequado Saccharomyces e Pichia em meioságar extrato de malte, ágar acetato de sódio, meio V8 e outros.
- Incubação por 7 dias submete à coloração de Kinyoun ascósporos coram-se de vermelho enquanto as outras células leveduriformes coram-se de azul.
IDENTIFICAÇÃO DE Candida dubliniensis
- Primariamente associada com a colonização e infecção da cavidade oral de pacientes HIV-soropositivos, sendo relatada também em casos de infecção sistêmica associada à imunodeficiência.
- Compartilha muitas características com C. albicans, o que torna difícil a distinção.
- Isolados de ambas as espécies crescem a 30 e 37°C, produzem colônias de cor creme em ASD, produzem tubo germinativo e clamidoconídios e apresentam perfil bioquímico semelhante; a discriminação baseia-se em métodos moleculares como PCR, RAPD e PFGE.
ASSIMILAÇÃO DE CARBOIDRATOS
- Testa a capacidade de crescimento da levedura em aerobiose frente a uma fonte de carbonos: glicose, lactose, maltose, trealose, xilose, dextrose (controle positivo) entre outros açúcares, fornecidos como única fonte de energia (meio YNB ou meio “C”).
- Assimilação em meio sólido auxanograma ou técnica auxanográfica.
- Ágar destituído de qualquer fonte de carbono adiciona-se a suspensão da levedura, que é distribuída na placa utilização de discos de papel de filtro impregnados com os diferentes carboidratos positividade é avaliada através da observação de halo de crescimento da levedura em presença do carboidrato fornecido.
ASSIMILAÇÃO DE NITROGÊNIO (TÁ ACABANDO!)
- Testa a habilidade que uma levedura tem de crescer aerobiamente na presença de um composto nitrogenado fornecido como única fonte de energia.
- Essa técnica auxanográfica emprega meio de ágar YCB ou YNB destituído de qualquer fonte de nitrogênio, adicionado da suspensão da levedura e distribuído em placa depois são aliquotados compostos nitrogenados sobre o ágar a positividade é avaliada por meio do crescimento da levedura em presença do composto fornecido (geralmente peptona como controle positivo e nitrato de potássio).
ZIMOGRAMA OU FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS
- Habilidade que uma levedura tem de crescer anaerobiamente na presença de determinado açúcar fornecido como única fonte de energia, observada através da produção de gás carbônico e alteração de pH.
- Classicamente é realizada em meio líquido suspensão da levedura é inoculada em tubo de ensaio contendo meio de cultura, solução do açúcar desejado a 2% e um tubo de Durham invertido positividade é observada através da produção de gás no interior do tubo de Durham e da mudança da coloração do meio, quando se utiliza um indicador de pH.
SISTEMAS MANUAIS E AUTOMATIZADOS PARA PROVAS DE ASSIMILAÇÃO DE CARBOIDRATOS
- Os sistemas manuais mais utilizados são o API 20C, o ID 32C e o Auxacolor galerias plásticas contendo carboidratos desidratados, nas quais a suspensão da levedura é inoculada provas positivas podem ser traduzidas pela turvação ou mudança de coloração.
- Ainda assim são recomendadas provas adicionais como a macromorfologia colonial, a micromorfologia, pesquisa de cápsula, etc.
- Métodos automatizados mais difundidos são o Microscan Rapid Yeast Ident e o AutoMicrobic mesmo princípio, só que os sistemas são controlados e interpretados automaticamente por computadores.
- ATB fungus 2 faz o antifungiograma (estudo de antifúngicos).
- Recomendações: utilizar sempre microcultivo como teste adicional, cuidado para obter inóculos puros e viáveis, certificar-se sobre quais espécies são identificadas por cada método, e observar protocolo.
- OBS: laboratórios de pesquisa já investem no uso de anticorpos monoclonais ou de métodos moleculares com a finalidade de resolver problemas de diagnóstico ou de marcagem epidemiológica.