HPLC Nov 16 03

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Cromatografia Líquida 
de Alta Eficiência
HPLC
KALIL LELIS CHARANEK KALIL@PEQ.COPPE.UFRJ.BR
23/NOV/2016
Uso do HPLC
- Operação do HPLC
- Desenvolvimento de métodos de análises
- Identificação e resolução de problemas no HPLC (troubleshooting)
- Conclusões
Operação do HPLC
Operação do HPLC
- Preparação de solventes
◦ Evita ruídos na linha de base
◦ Evita picos inconsistentes
- Qualidade
◦ Reagentes grau HPLC
◦ Água destilada ou Milli-Q
◦ Não utilizar compartimentos plásticos
Operação do HPLC
- Tampão
◦ Preparar diariamente (pH constante e sem crescimento microbiano)
◦ Mudanças no pH afetam a cromatografia
◦ Shelf life em geladeira
◦ Usar tampões SEM estabilizante (Metabissulfato de sódio)
- Filtração
◦ Idealmente, filtrar a fase móvel em 0.45 µm
◦ Retirar particulados e evitar entupimentos
◦ Aumentar vida útil de bomba, selos e válvulas
Operação do HPLC
- Degassing
◦ Remoção de gases dissolvidos na fase móvel
◦ Borbulhar com Helio
◦ Sonicador
◦ Filtração a vácuo
Operação do HPLC
- Solventes
◦ Frascos devem conter filtros
◦ Linhas devem estar limpas e sem crescimento microbiano (fungo)
◦ Linhas não devem ter cotovelos bruscos
◦ Reservatórios devem estar acima do nível da bomba
◦ Verificar volume de fase móvel necessário para toda a corrida
◦ Evitar deixar acabar (sistema com ar)
Operação do HPLC
- Propriedades da fase móvel
◦ Não usar soluções com pH muito alto ou muito baixo
◦ Selos, amostradores e válvulas podem ser danificados
◦ Uso de fase móvel com pouco solvente
◦ Cuidado com a coluna
◦ Fase móvel com água pura é ideal para cescimento de microorganismos
◦ Lavar o sistema com solvente orgânico frequentemente
◦ Nunca deixar o sistema com água ou tampão por muito tempo (20% solvente)
Operação do HPLC
- Conexões (capilares)
◦ Minimizar volume morto
◦ Eliminar vazamentos
◦ Erros resultam em picos largos e ruído na linha de base
◦ Diâmetro interno varia
◦ Material adequado (inox ou polímero)
Operação do HPLC
- Conectores
◦ Inox ou polímero
◦ Conector de inox usado com capilar de inox, etc
◦ Evitar vazamentos (alta pressão)
◦ Evitar volume morto
Operação do HPLC
- Tubos bloqueados
◦ Aumento na pressão do sistema
◦ Danificação da coluna
◦ Vazamento em conectores
- Vazamentos
◦ Vida útil dos conectores
◦ Substituição da conexão
Operação do HPLC
- Pré-coluna
◦ Prolongar a vida útil da coluna
◦ Atua como filtro para impurezas
◦ Descartáveis
◦ Não afeta a performance da coluna
Operação do HPLC
- Temperatura
◦ Corridas em temperatura constante
◦ Mudanças podem causar flutuações nos picos e mudança da linha de base
◦ Temperatura de operação varia com a coluna
◦ Carbono e poliméricas (T altas)
◦ Sílica (T baixas) – Alto risco de ataque químico à fase estacionária
◦ Exemplo: 60C e pH2 causa hidrólise em coluna de sílica (amida)
◦ Tamanho de partícula também influencia
◦ Partículas < 5 µm tendem a colapsar fase móvel e degradar a coluna
◦ Eficiente para controle do método
◦ Temperaturas baixas aumentam tempo de retenção, seletividade e resolução
Operação do HPLC
- Preparação das amostras
◦ Mais do que dissolver sólidos em água
◦ Filtração, extração ou derivatização
◦ Filtração na pré-coluna ou antes de colocar amostra no vial
◦ Extração geralmente é para análises de componentes traço (ELL, SPE, etc)
◦ Extração é feita quando a matriz pode danificar aparelho ou para concentrar o analito
◦ Derivatização é usada com UV, FLD
◦ Cuidado para produzir compostos que ataquem o sistema HPLC
◦ Amostra deve estar em solvente parecido com fase móvel
Desenvolvimento de métodos
Desenvolvimento de métodos
- Método
◦ Condição de parâmetros para análise
◦ Tipo de fase móvel
◦ Vazão de fase móvel
◦ Composição de fase móvel
◦ Escolha da coluna
◦ Temperatura da coluna
◦ Escolha e configuração do detector
- Bom método
◦ Rápido
◦ Robusto
◦ Reprodutível
Desenvolvimento de métodos
- Método
◦ Condição de parâmetros para análise
◦ Tipo de fase móvel
◦ Vazão de fase móvel
◦ Composição de fase móvel
◦ Escolha da coluna
◦ Temperatura da coluna
◦ Escolha e configuração do detector
- Bom método
◦ Rápido
◦ Robusto
◦ Reprodutível
Desenvolvimento de métodos
- Estratégias para desenvolvimento de métodos
◦ “Hands on” – Tentativa e erro
◦ Uso de softwares
◦ Utilizar várias colunas e fases móveis
◦ Foco no “Hands on”
Desenvolvimento de métodos
- Escolha da coluna
◦ Utilizar coluna com grande vida útil no pH da fase móvel
◦ Escolher colunas com alta pureza para melhores picos
◦ Escolher C18 ou C8 para curto tempo de retenção e boa resolução em vários pH
◦ Caso amostra muito específica (muito polar, muito básica), escolher coluna apropriada
- Fase móvel aquosa
◦ Começar com pH BAIXO para melhor formato do pico, menor tempo de retenção e reprodutibilidade
◦ pH 2-4 com tampão 20-50 mM para melhores picos
◦ Acetonitrila ou Metanol – começar alto para menores tempos de retenção, depois ajustar
◦ Caso resolução não seja boa, substituir MeOH por ACN e vice versa
- Usar temperaturas mais altas para reduzir tempo de análise
Desenvolvimento de métodos
- Ponto de partida
- Escolher uma coluna C18 ou C8
◦ Coluna pequena minimiza o tempo de análise (e desenvolvimento do método)
◦ Tamanhos menores de partículas leva a boa resolução em pouco tempo
◦ Coluna de rápida resolução
- Escolher uma fase móvel
◦ Robusta, funciona com muitas amostras
◦ Tampão fosfato pH 3, Ácido Fórmico ou Forsfórico em água, etc
◦ Acetonitrila ou Metanol como solvente orgânico
Desenvolvimento de métodos
- Ponto de partida
- Ajustar a fase móvel para os tempos de retenção e a resolução
◦ Adequar a resolução dos picos
◦ Tempos de análises < 30 min
Desenvolvimento de métodos
- Otimização
- Fase móvel (mais fácil)
◦ Alterar a composição do solvente orgânico
◦ Alterar o pH da fase aquosa
- Fase estacionária
◦ Usar outra coluna (C8, Fenil, CN)
◦ Colunas mais novas (menor diâmetro de partículas)
Desenvolvimento de métodos
Desenvolvimento de métodos
Desenvolvimento de métodos
Desenvolvimento de métodos
Desenvolvimento de métodos
Desenvolvimento de métodos
Desenvolvimento de métodos
- Otimização
- Escolha da melhor coluna
- Melhor eficiência da análise
- Novos equipamentos e tecnologias
◦ Reduzem tempo de análise
Troubleshooting
Troubleshooting
- Surgimento do problema. E agora?
◦ Aplicação correta do HPLC?
◦ Amostra correta?
◦ Método está sendo seguido corretamente?
◦ Configurações dos instrumentos correta?
◦ Quando funcionou corretamente pela última vez?
◦ Houve alguma mudança?
◦ Houve mais de uma mudança?
◦ Rever TODOS os parâmetros!
Troubleshooting
- Bomba
- Autosampler
- Coluna
- Detector
- Aquisição de dados
-Problemas podem aparecer em TODOS os componentes do HPLC!
Troubleshooting
- Tipos de problemas com a coluna
◦ Pressão
◦ Formato do pico
◦ Retenção
◦ Detectores
Troubleshooting
- Problemas com pressão
Troubleshooting
- Alta Pressão
◦ Coluna com contaminação
◦ Coluna entupida
◦ Pré-coluna entupida
◦ Conectores estrangulados
- Determinando a causa e corrigindo alta pressão
◦ Verificar pressão com e sem a coluna
◦ Muito comum problemas de entupimento na pré-coluna
◦ Remover coluna – Pressão ainda alta?
◦ Remover pré coluna – Pressão ainda alta?
Troubleshooting
- Caso pressão não abaixe
◦ Realizar back flush na coluna – Limpar sujeiras superficiais
◦ Lavar a coluna – Eliminar contaminação e entupimento pelo recheio
◦ Lavar a coluna – Remover compostos adsorvidos de alto peso molecular◦ Lavar a coluna – Remover precipitados da amostra ou do solvente
◦ Último caso – Trocar o conector (evitar)
◦ Troca do conector pode danificar colunas de alta performance
Troubleshooting
- Lavagem da coluna (fase reversa)
Fase móvel sem sais
100% Metanol
100% Acetonitrila
75% Acetonitrila : 25% Isopropanol
100% Isopropanol
100% Hexano
- Ao final, inverter a ordem dos solventes para re-equilibrar a coluna
Troubleshooting
- Técnicas de prevenção
◦ Usar proteção de colunas (filtros em linha e pré-coluna)
◦ Filtrar amostras sempre
◦ Filtrar fases móveis com tampão
- Filtros em linha
◦ Fácil de usar e substituir
◦ Muito mais barato que a coluna
Troubleshooting
- Baixa Pressão
◦ Mais simples do que alta pressão
◦ Verificar vazamentos
◦ Fluxo incorreto
Troubleshooting
- Problemas com formatos dos picos
Troubleshooting
- Problemas com picos
◦ Picos divididos
◦ Picos com cauda (tailing)
◦ Picos largos
- Pode ser uma combinação (exemplo, picos largos com cauda)
- Não necessariamente afetam todos os picos
- Múltiplas causas para cada problema
Troubleshooting
- Picos divididos
◦ Caminho da amostra atrapalhado por vazio na coluna
◦ Amostra passando por diferentes caminhos na coluna
◦ Empacotamento ruim da coluna
◦ pH alto – dissolve sílica
◦ Conectores mal encaixados
Troubleshooting
- Picos divididos
◦ Lavagem da coluna elimina picos divididos
◦ Resultado de acúmulo de contaminação na coluna
- Prevenção
◦ Pré-coluna
◦ Lavagem periódica da coluna
◦ Filtração das amostras
Troubleshooting
Troubleshooting
- Picos divididos
◦ Efeito de solventes
◦ Solvente na amostra mais forte do que fase móvel
◦ Manter concentração de solvente na amostra < fase móvel
Troubleshooting
Troubleshooting
- Picos com cauda, largos
◦ Interações secundárias com a coluna
◦ Contaminação da coluna
◦ Envelhecimento da coluna
◦ Coluna saturada
◦ Efeitos fora da coluna
- Alguns picos com cauda
◦ Efeitos secundários, interações residuais
◦ Picos pequenos eluindo na cauda de picos maiores
Troubleshooting
- Picos com cauda, largos
- Todos os picos com cauda
◦ Efeitos fora da coluna
◦ Acúmulo de contaminação na entrada da coluna
◦ Acúmulo de metais pesados
◦ Coluna ruim
Troubleshooting
- Interações secundárias
◦ Toda interferência de parâmetros na interação da amostra com coluna
◦ Tampão
◦ pH
Troubleshooting
- Interações secundárias
◦ Tampão
Troubleshooting
- Interações secundárias
◦ pH
Troubleshooting
- Interações secundárias
◦ pH
◦ Aminas
Troubleshooting
- Contaminação da coluna
- Teste simples e rápido
◦ Inverter a direção do luxo na coluna e fazer uma análise
◦ Caso melhore, lavar com isopropanol
◦ Caso não melhore, coluna danificada
Troubleshooting
- Contaminação da coluna
Troubleshooting
- Picos com cauda frontal
◦ Causa: Coluna saturada
Troubleshooting
- Picos largos
- Todos os picos largos
◦ Perda de eficiência da coluna
◦ Coluna com vazio
◦ Grande volume de injeção
- Alguns picos largos
◦ Picos fantasmas – Eluição de injeções passadas
◦ Alto peso molecular do analito
◦ Amostra de proteínas ou polímeros
Troubleshooting
- Pico fantasma
Troubleshooting
- Dispersão fora da coluna
◦ Volume morto
◦ Volume capilar muito grande
Troubleshooting
- Dispersão fora da coluna
Troubleshooting
- Dispersão fora da coluna
◦ Usar capilares pequenos
◦ Usar capilares com diâmetro interno pequeno
◦ Garantir que as conexões são feitas com encaixes correspondentes
◦ Usar um detector com célula de baixo volume
◦ Injetar volume de amostra pequeno
- Ainda há muito volume morto
◦ Checar se conexões são compatíveis
Troubleshooting
- Problemas com retenção
Troubleshooting
- Problemas com retenção
◦ Coluna velha
◦ Contaminação da coluna
◦ Pouco tempo de equilíbrio (condicionamento)
◦ Má escolha do conjunto fase móvel/coluna
◦ Mudança na fase móvel (não intencional)
◦ Mudança no fluxo
◦ Gradientes diferentes
Troubleshooting
- Problemas com retenção
◦ Analito sensível ao condicionamento da coluna
◦ Formato muda por formação de complexos metálicos (quelantes)
Troubleshooting
- Problemas com retenção
◦ Formação de quelantes
Troubleshooting
- Problemas com retenção
◦ Lavagem ácida
Troubleshooting
- Problemas com retenção
◦ Mudança na fase móvel (não intencional)
Troubleshooting
- Problemas com detectores
◦ Reconhecer a origem do problema
◦ É consequência da técnica utilizada?
◦ É esperado devido à fase móvel?
◦ Pode ser corrigido mudando parâmetros do detector?
Troubleshooting
- Problemas com detectores
◦ Picos negativos
- Absorbância da amostra é menor que a da fase móvel
- Perturbação do equilíbrio do sistema quando o solvente da amostra passa pela coluna
- Normal em RID (Índice de refração)
Troubleshooting
- Problemas com detectores
◦ Picos negativos
Troubleshooting
- Problemas com detectores
◦ Picos fantasma
- Picos que aparecem sem injeção de amostra
- Problema – fase móvel suja
Troubleshooting
- Problemas com detectores
◦ Picos fantasma
Troubleshooting
- Problemas com detectores
◦ Ruído na linha de base (noise)
- Célula do detector suja
- Lâmpada do detector com problemas
- Pulsos da bomba (se for periódico)
- Efeitos da temperatura no detector (pequena oscilação)
- Bolhas de ar
Troubleshooting
- Problemas com detectores
◦ Ruído na linha de base (noise)
Troubleshooting
- Problemas com detectores
◦ Linha de base instável
- Gradiente
- Temperatura instável (RID)
- Contaminação na fase móvel
- Fase móvel não está em equilíbrio com a coluna
- Eluição de contaminantes do sistema
Troubleshooting
- Problemas com detectores
◦ Linha de base instável
Conclusões
Conclusões
- Desenvolvimento do método
◦ Fundamental para boa análise
◦ Robusto
◦ Repetibilidade
- Análise em pouco tempo
- Minimizar problemas
Conclusões
- Problemas em colunas são evidentes
◦ Alta pressão
◦ Formato do pico
◦ Mudança na retenção
- Problemas não necessariamente associados à coluna
◦ pH fase móvel
◦ Conectores
◦ Detectores
◦ Contaminação
Conclusões
- Iniciar com as questões corretas
◦ Fundamental a correta identificação do problema
- Repostam levam às soluções