aumento de escala e turbidimetria

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS – EQA
CURSO DE ENGENHARIA BIOQUÍMICA
DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA II
	
Aumento de escala de cultivo microbiano 
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Medidas de biomassa – Turbidimetria e massa seca
Luana Marques 115803 
 Jenyfer Conceição 117844
Rio Grande, 2018
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Curva de crescimento microbiano...............................................................................3
Figura 2: Curva padrão de LEVEDURA.....................................................................................3
SUMÁRIO
5RESUMO	�
51. INTRODUÇÃO	�
32. OBJETIVOS	�
33. MATERIAL E MÉTODOS	�
33.1 Material	�
33.3 Procedimento Experimental	�
54. RESULTADOS E DISCUSSÃO	�
65. CONCLUSÃO	�
6REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS	�
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RESUMO
O resumo deve ser constituído de uma sequência de frases concisas e objetivas com introdução ao assunto abordado, objetivos, principais resultados e uma frase conclusiva (máximo 300 palavras) e 3 palavras-chave. O resumo deve ser escrito com espaçamento simples.
INTRODUÇÃO
Os micro-organismos, quando em condições favoráveis para o seu crescimento, se reproduzem de forma a qual é possível a sua quantificação por UFC/mL (unidade formadora de colônias por mililitros) assim, uma cultura que foi mantida em condições adequadas que proporcionasse ambiente adequado à sua reprodução, possibilita-se a confecção de uma curva de crescimento de um determinado microrganismo. Uma curva de crescimento bacteriana que é típica pode ser representada segundo a Figura 1.Determinando assim a taxa e crescimento microbiano em relação ao tempo e suas 4 fases típicas de crescimento (TORTORA et al., 2012).
	
FIGURA 1 – Curva de crescimento microbiano.
(TORTORA et al., 2012).
Com o crescimento microbiano adequado, é possível a realização do aumento de escala do cultivo inicial, levando-se em conta que a quantidade de volume do cultivo inicial, deve ser 10% do volume que se deseja para o cultivo final, realizando sucessivamente as ressuspenções até chegar ao volume de cultivo desejado (PELCZAR et al., 1997).
Para determinação da biomassa que existe em determinado meio de cultivo é feito o método do peso seco, se corretamente executado, constitui o processo básico secagem da �
biomassa determinando assim seu peso servindo como referência na padronização de outros métodos como na turbidimetria que consiste na medida da turvação de uma suspensão de microrganismos. Ao se medir a absorbância em um espectrofotômetro verifica-se que a turvação que está diretamente relacionada coma massa de microrganismos presente, possibilitando-se a sua quantificação (LIMA et al., 2001).
2. OBJETIVOS
Realizar o aumento de escala de um cultivo microbiano e quantificar a concentração de biomassa (células microbianas) de um meio de cultivo.
3. MATERIAL E MÉTODOS
	
3.1 Material
Para o aumento de escala de cultivo microbiano:
Cepa de levedura, tubos de ensaio com rosca, meio YM em tubo inclinado, cabo de kolle com alça de cromo-níquel, bico de Bunsen, Erlen de 125 mL, Erlen de 500 mL, pipetas de 5 mL.
Para medidas de biomassa – Turbidimetria e massa seca:
Pipetas, balões volumétricos, tubos de centrífuga, placas de petri, estufa, espectrofotômetro
Exemplo: solução aquosa de hidróxido de sódio (NaOH) 0,1 mol/L, sulfato de cobre pentahidratado p.a. (CuSO4.5H2O), água destilada (H2O), álcool etílico anidro (CH3CH2OH).
3.3 Procedimento Experimental 
Para o aumento de escala de cultivo microbiano: 
Retirou-se, com o auxílio da alça do meio de cultivo as células do micro-organismo;
 Transferiu-se, para 40 mL de meio de cultivo (inóculo), totalizando assim 10 % (v/v) de inóculo;
Levou-se ao shaker durante aproximadamente 24 horas à 28 °C e 180 rpm; 
Decorrido o tempo de inóculo transferiu-se, próximo à chama do bico de Bunsen, 10 mL do inóculo para 90 mL de meio de cultivo; 
 Levou ao shaker à 28 °C e 180 rpm, até a realização da medida de turbidez.
 Para medidas de biomassa – Turbidimetria e massa seca
Curva Padrão:
Centrifugou-se em duplicata volume conhecido de meio de cultivo em centrífuga à 4000 rpm durante 5 minutos; 
Descartou-se o sobrenadante após centrifugação
Ressuspendeu-se as células com água destilada e centrifugar à 4000 rpm durante 5 minutos; 
Descartaou-se o sobrenadante e transferir a quantidade total de células para uma placa de petri tarada; 
Deixou-se as células em estufa à 50 °C durante 24 horas; 
 Deixou-se as placas em dessecador por 30 minutos para esfriar e pesar. 
Pontos da curva:
Centrifugou-se 3 tubos com 5 mL de meio de cultivo em centrífuga à 4000 rpm durante 5 minutos; 
Descartou-se o sobrenadante após centrifugação; 
Ressuspendeu-se as células com água destilada e centrifugar à 4000 rpm durante 5 minutos; 
Descartou-se sobrenadante e realizar diferentes diluições a partir desta biomassa lavada; 
Realizou-se a leitura da absorbância das diferentes diluições em espectrofotômetro à 600 nm para obtenção dos pontos da curva padrão de biomassa. 
Análise da concentração de biomassa em 144 horas de cultivo: 
Centrifugou-se em duplicata volume conhecido de meio de cultivo em centrífuga à 4000 rpm durante 5 minutos; 
 Descartou-se o sobrenadante após centrifugação;
 Ressuspendeu-se as células com água destilada e centrifugar à 4000 rpm durante 5 minutos; 
Ressuspendeu-se as células em balão de volume conhecido e realizar a leitura da absorbância em espectrofotômetro à 600 nm.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nas aulas práticas realizaram-se um aumento de escala, turbidimetria e cálculo de massa seca. Para quantificar a concentração de biomassa em um cultivo, a turbidimetria é uma alternativa. No entanto, para utilizá-la precisa-se de uma curva padrão, que foi calculada a partir de concentrações distintas de uma mesma biomassa, observada na figura. 
FIGURA 2: Curva padrão de LEVEDURA
Tal curva padrão só pôde ser calculada devido à quantificação da massa seca, onde se obteve 0,02035 g em 5 mL do cultivo com a levedura. Após a quantificação da massa seca, consegue-se calcular a concentração de 4,07 g/L de biomassa, levando a construção da curva padrão.
Posteriormente, coletou-se uma amostra do cultivo e foi medida a absorbância de 0,816 em duplicata, concluindo que em 312 horas de cultivo a concentração estava 0,4 mg de biomassa da levedura.
5. CONCLUSÃO
	
	Os micro-organismos habilmente possuem uma grande capacidade de reprodução quando estabelecidos em ambientes favoráveis, com essa rápida taxa de crescimento surgem também métodos como a turbidimetria que possibilitam a quantificação desse micro-organismos em qualquer ponto do cultivo auxiliando no monitoramento do crescimento celular, evidenciando resultados de crescimento ou declividade reprodutora, possibilitando por fim análises confiáveis a respeito do micro-organismo. 
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W; SCHMIDELL, W. Biotecnologia
Industrial. Fundamentos. 1a ed. v.1 São Paulo: Edgard Blücher, 2001.
Pelczar Jr., M. J.; Chan, E.C.S; Krieg, N.R. Microbiologia: Conceitos e Aplicações. 2 ed. Vol 1. São Paulo, Pearson Makron Books, 1997.
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, CL. Microbiologia. 10. ed., Porto Alegre: Artmed, 2010.