Microextração em fase sólida para análise química

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Introdução:
Os métodos de análise de substâncias utilizados na área das ciências farmacêuticas, dentre outras áreas, são de extrema importância para identificar possíveis contaminantes em soluções, por exemplo. Para a realização, portanto, dessas análises é necessário o preparo de amostras.
A amostragem constitui um conjunto de operações executadas dentro de uma especificação, assegurando que a amostra coletada contenha todas as características da matriz. É uma série de etapas executadas com as quais se obtém do material em estudo, uma porção pequena de tamanho apropriado para o trabalho em laboratório. (FORTUNATO et al, 2008, p.1)
Como matrizes brutas costumam ter e gerar interferentes, a preparação de amostras auxilia pois costuma isolar e concentrar as espécies de interesse de modo que não comprometa a análise química.
A cromatografia gasosa, é adequada à separação de espécies voláteis e semivoláteis. Um grande número de técnicas de preparo de amostras tem sido usado em métodos analíticos envolvendo cromatografia gasosa. Idealmente, essas técnicas devem possuir algumas características desejáveis, em especial, a capacidade de sorver seletivamente espécies químicas voláteis e semivoláteis de matrizes aquosas e contendo interferentes não voláteis ou em suspensão. Dentre as diversas técnicas disponíveis, a microextração em fase sólida tem sido empregada para essas operações que criam o elo entre a matriz química e o instrumento analítico.
Microextração em fase sólida: princípios, métodos, sorventes e acoplamento com a cromatografia gasosa:
	A SPME é uma microtécnica em que os processos de extração e pré-concentração de analitos ocorrem numa escala dimensional comparativamente reduzida. O dispositivo básico de SPME consiste em um suporte na forma de um bastão recoberto com filmes de espessura de até 100 µm de polímeros sorventes ou sólidos adsorventes dispersos em polímeros ou misturas.
	Na SPME ocorre a sorção das espécies de interesse presentes na amostra por um filme fino de sorvente depositado sobre o suporte. Na etapa de extração, a seção recoberta com o material sorvente é colocada diretamente em contato com a amostra.
	Realizada a extração, a fibra é retirada da amostra e inserida no injetor do cromatógrafo a gás, onde os analitos são termicamente dessorvidos sob fluxo do gás de arraste e carregados para a coluna cromatográfica.
	As fibras disponíveis comercialmente são fornecidas montadas em uma agulha hipodérmica e esse conjunto é rosqueado no aplicador. Dessa forma o aplicador é reutilizável, bastando trocar o conjunto quando necessário. O aplicador permite que a fibra possa ser retraída para dentro do tubo hipodérmico durante operações que possam danificá-las.
	Com a fibra retraída na agulha, o septo do frasco de amostra é perfurado e, posteriormente, a fibra é exposta à amostra. Terminando o tempo de extração a fibra é novamente retraída, a agulha é retirada do septo e levada para inserção no cromatógrafo gasoso. Após o procedimento é recomendável vedar a ponta da agulha.
	Ao se colocar a fibra de SPME em contato com a amostra, moléculas dos analitos migram pela matriz até o recobrimento da fibra. Para recobrimentos em que o processo de extração se faz preferencialmente por adsorção essas moléculas são retidas por sítios ativos na superfície do recobrimento ou no interior dos seus poros, onde penetram por difusão. Caso o mecanismo seja predominantemente partição, as moléculas devem cruzar a interface sorvente/matriz, se dissolvendo e se difundindo pelo filme de recobrimento. Em ambos os casos, o processo prossegue até que aconteça equilíbrio entre analito remanescente na amostra, presente no headspace em contato com a amostra e sorvido sobre ou pela fibra. Assim, independentemente do modo de extração o modelamento teórico de SPME deve considerar a distribuição dos analitos entre três fases em contato – fase sorvente, amostra e hedspace. A posição desses equilíbrios depende de parâmetros dimensionais do sistema e das constantes de distribuição do analito entre o sorvente, matriz e headspace.
	Na SPME acontecem equilíbrios simultâneos em um sistema multifásico. Um sistema trifásico ideal simples pode ser considerado como uma fibra mergulhada numa matriz aquosa em contato com um espaço confinado.
	Supondo um sistema ideal trifásico, antes da extração uma quantidade n0 do analito estaria presente em concentração C0 em um volume Vm da matriz. Completada a extração, no equilíbrio, essa quantidade n0 de analito estará distribuída entre as fases presentes, restando nem na matriz aquosa, neh no headspace e sendo a quantidade sorvida no recobrimento da fibra igual a nef. Havendo conservação de massa no processo, pode-se escrever que: 
	As relações entre as concentrações em cada fase dependem das respectivas constantes de distribuição em que Cef, Cem e Ceh são respectivamente as concentrações de analito em equilíbrio na fibra, na matriz e no heaspace.
 
	Combinando-se as equações obtém-se que relaciona a quantidade extraída de analito nef no equilíbrio com a concentração inicial na amostra C0. Atingido o equilíbrio, a quantidade extraída é diretamente proporcional à sua concentração inicial na amostra.
	Além disso, em SPME, uma vez atingido o equilíbrio, a relação entre quantidade extraída e concentração na amostra não depende de como as fases se dispõe no sistema: a quantidade extraída por extração direta é exatamente a mesma que seria extraída através do headspace, caso os volumes de amostra, fase extratora, headspace em contato com amostra ou fibra e demais condições sejam as mesmas.
	Seja qual for o mecanismo físico-químico relevante na extração o tempo necessário para que sejam atingidos os equilíbrios de distribuição dos analitos entre amostra, fibra e headspace depende da velocidade com que as moléculas dos analitos são transportadas por essas fases e atravessam as interfaces fibra-headspace, fibra-matriz e matriz-headspace.
	Em uma primeira aproximação, na ausência de perturbação mecânica da amostra, esses processos de transferência de massas são essencialmente difusivos. As taxas de difusão do analitos A em cada fase dependem dos respectivos coeficientes de difusão da Lei de Fick, Dm, Dh e Df, os quais por sua vez são função do volume molar do analito, da temperatura e viscosidade da fase, no caso de filmes poliméricos. O atingimento do equilíbrio de distribuição do analito entre as fases dependeria, portanto, da sua difusão por elas, que são processos essencialmente lentos e levariam, na prática, em tempos de extração excessivamente longos.
	O processo pode ser consideravelmente acelerado por agitação mecânica vigorosa da amostra e do headspace. Quanto mais intensa a agitação mecânica do meio mais rápida é a convexão e mais rapidamente é atingido o equilíbrio de extração entre fases. Em teoria, o equilíbrio entre fases somente seria alcançado após um intervalo infinito de tempo. Na prática, como isso é impossível, define-se o tempo de equilíbrio teq como aquele necessário para que sejam sorvidos 95% da quantidade máxima teórica extraível de analito após um suposto tempo de extração infinito.
	Essa equação só é totalmente válida quando a extração é feita de uma matriz gasosa, na qual a difusão e a convecção são muito rápidas.
	A etapa limitante no transporte de moléculas do analito do corpo da amostra para a interface fibra/amostra é a difusão através da camada-limite; quanto menor a espessura dessa camada, mais rápida é a difusão e mais o tempo de equilíbrio observado se aproxima do ideal. A espessura da camada-limite depende de uma série de fatores, especialmente da velocidade de agitação: quanto mais intensa for a agitação da amostra, menos espessa a camada-limite e mais rápida a difusão do analito por ela. 
	A equação pode ser modificada para incluir o tempo de migração do analito pela camada-limite no tempo de equilíbrio, resultando uma expressão mais próxima da realidade: .
	O desenvolvimento dosmetódos de análise em que SPME é usada nas etapas de extração e pré-concentração envolve principalmente a escolha de condições práticas e a otimização dos principais parâmetros operacionais, tendo em vista potencializar a seletividade e sensibilidade, se possível concomitantemente reduzindo o tempo de operação, manipulações de amostras e o consumo de reagentes.
	São possíveis duas abordagens experimentais básicas, a otimização univariada que é quando os parâmetros operacionais são aperfeiçoados separadamente em séries de extrações, onde um deles é variado e os outros mantidos fixos, podemos também usar amostras de testes os mais parecidos possíveis aos que serão analisados pelo método que é desenvolvido. Há condições favoráveis que devem ser selecionadas no desenvolvimento de um método usando SPME como: A seleção da fibra SPME, onde a seleção da fibra deve levar em consideração a seletividade do recobrimento para os analitos que são alvos da análise, a sua compatibilidade com a matriz. Quando se trata de espessura de recobrimento quanto mais espesso for o filme mais lento é o atingimento do equilíbrio e a dessorção, o que pode muitas vezes levar a picos cromatográficos deformados, porém, maior a eficiência de extração no equilíbrio. Assim, se sensibilidade e detectabilidade altas forem imperativas, as fibras com filmes espessos serão as preferidas, mas as fibras de filme sortivo fino possibilitam fazer analíses mais rápidas e com limites de detecção mais altos.
	Na seleção do modo de operação sempre que possível em SPME é preferido o modo de operação pelo headspace pois obtém-se boas eficiências de extração, mesmo para espécies classificadas como pouco voláteis sem expor a fibra a condições agressivas.
	Vale lembrar também que as extrações diretas só são recomendadas para analitos com pressões de vapor muito baixas. Em tese o tempo de extração deve ser ajustado para ser igual ou superior ao tempo de equilíbrio, a determinação se dá a partir do estabelecimento dos perfis de extração, curvas relacionando o tempo de extração com a massa extraída ou área do pico cromatográfico. Muitas vezes mesmo depois de tempos muito longos de extração em alguns casos acontece até mesmo a diminuição nas massas extraídas, nas operações usando as fibras que tem recobrimento adsorventes, isso pode ser atribuído a competição entre as moléculas dos analitos pelos sítios ativos, e isso, além de impedir o alcance do equilíbrio faz com que as massas extraídas não possam ser correlacionadas ás concentrações, porém, quando essa diferença é observada com qualquer tipo das fibras expostas por tempos muito longos ás amostras, a causa é basicamente a perda de analitos por difusão através de septos e tampas de frascos de extração ou por adsorção sobre as superfícies em contato com a amostra.
	A temperatura de extração afeta não somente o equilíbrio que é envolvido como também a velocidade com que os equilíbrios são atingidos, o efeito do incremento da temperatura é simples, tendo em vista que a taxa de transferência das massas entre as fases envolviadas aumenta, e, portanto, os equilíbrios são rapidamente atingidos. Supondo que uma extração pelo headspace ocorre simultaneamente aos equilíbrios de distribuição do analito entre a amostra e seu headspace, e entre o headspace e o recobrimento da fibra. Na maioria das vezes a entalpia da vaporização do analito da amostra para o headspace é positiva, já a entalpia da transferência do headspace para a fibra é negativa.
	Em amostras aquosas, levando em conta o condicionamento do meio, a presença de eletrólitos fortes e o pH do meio podem afetar a posição dos equilíbrios de extração, a adição de eletrólitos pode também causar o chamado efeito salting out: a presença de cátions e ânions inertes causando uma diminuição da atividade do solvente e aumentando a atividade de qualquer soluto presente na amostra.
	Aplicações na área de química dos alimentos e em bioanalítica:
	Recentemente grande atenção tem sido dada à área de química dos alimentos e em bioanalítica. Apesar de grande abrangência, todas as aplicações demandam por resultados analíticos precisos e confiáveis. Nesse sentido, contando com a evolução das técnicas de análise, a sensibilidade dos instrumentos analíticos tem sido aprimorada, consequentemente as técnicas usadas no preparo de amostras devem ser adequadas para minimizar a introdução de artefatos durante a sua manipulação. Nesse contexto, a SPME tem sido uma alternativa bastante proveitosa para esses estudos.
	Num estudo relacionado à química dos alimentos, tendo em vista a extração de pirazinas de cacau torrado foi evidenciado que o rendimento de extração é maior quando feita no headspace do sólido em vez de no headspace de sua suspensão aquosa. Nesse mesmo trabalho determinou-se que o efeito salino afeta de um modo diferente a extração de diversos analitos testados. A SPME em headspace foi aplicada com resultados melhores do que a SPME direta, para análise quantitativa de componentes que possuem aromas produzidos por bactérias derivadas de carne, as extrações com fibra PA foram melhores do que as fibras com PDMS, isso devido ao caráter polar desses analitos.
	A SPME tem sido utilizada em alimentos tanto para detectar compostos alvo quanto para determinar componentes voláteis e semivoláteis (como contaminante tetrametileno dissulfatotetramina, conhecido também como tetramina) altamente tóxico sem cheiro ou sabor e que se acumula em diversos alimentos causando casos de mortes por intoxicação. Outro contaminante alimentar com possível ação carcinogênica é o furano, que é um líquido de alta volatilidade produzido em decorrência da reação de Maillard. Kim et al. A determinação desse composto baseado na extração através da SPME aliada à GC-MS utilizando alimentos enlatados como carnes, sopas, sucos e peixes, e também alimentos armazenados em frascos de vidro como as papinhas de bebê.
	Os mesmos autores deste estudo concluíram que devido ao fato do efeito de matriz ser pronunciado de uma forma diferente em relação aos alimentos que foram analisados, o uso de adição de padrão para quantificação do contaminante se faz necessário. 
	Além disso, os mesmos reportaram um bom desempenho nas técnicas de extração através do headspace, que levou à redução no tempo de análise aliada à sensibilidade de identificação dos contaminantes em diversos alimentos testados. 
	Pode-se apontar um viés da SPME nas análises de alimentos que é a determinação do perfil dos voláteis responsáveis pelos flavores dos alimentos, os vinhos são ricos em flavores e vários compostos voláteis de diferentes classes e já foram identificados e são amplamente conhecidos. Pesquisadores estudando o vinho mais caro do mundo, devido a sua rara composição e baixa produção, desenvolveram um método rápido e simples para a determinação dos compostos voláteis e semivoláteis por extração do headspace das amostras e posterior identificação desses compostos. Diversos tipos de fibras foram avaliadas para a extração de dezessete compostos presentes no vinho e aplicadas à extrações nos modos direto e por headspace. O melhor desempenho de extração foi por meio de headspace.
	Mais recentemente, Algusto e colaboradores relataram a correlação dos cromatogramas obtidos por SPME - GC - MS, da fração volátil e semivolátil de cervejas com diversos parâmetros sensoriais. Analogamente, Ribeiro e et. al. analisaram diversas amostras de café arabica por SPME-GC-FID para correlacionar a qualidade dos cafés com seus perfis voláteis.
Conclusão:
O uso de Microextração em Fase Sólida vem ganhando espaço cada vez maior com sua utilização, principalmente por uma série de vantagens comparadas com métodos convencionais de extração, tais como: a não utilização de solvente orgânico, integração da extração e da concentração do soluto em uma única etapa e em um dispositivo extrator (reutilizável) e introdução deste dispositivo no sistema analítico para o processo de dessorção. (QUEIROZ,2009).
Apesar da comprovação de que na presençade eletrólitos fortes e variações do pH, o uso da técnica de SPME ou Microextração em Fase Sólida é muito utilizada no preparo de amostras para análises químicas de alimentos e bioanálises, na detecção de possíveis contaminantes tóxicos que prejudiquem a saúde humana.
REFERÊNCIAS:
ALENCAR, Letícia; ANDRADE, Karina Pinheiro; BRAGANÇA, Rosemary do Nascimento Porto; FORTUNATO, Dalva Maria da Nóbrega. A Importância do Preparo da Amostra para o Sucesso da Análise de Alimentos. Higiene Alimentar. v.22, n.160, p. 38-41, abril-2008.
QUEIROZ, Maria Eugênia C. Microextração em Fase Sólida para Análise de Fármacos em Fluidos Biológicos. Scientia Chromatographica. São Paulo, v.1, n.3, p. 11-19, 2009.