2-METODOS

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Beck, ST Imunologia Clínica 
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METODOS UTILIZADOS PARA DIAGNÓSTICO 
SOROLÓGICO (II) 
 
CARACTERISTICAS DA REAÇÃO ANTÍGENO- ANTICORPO 
 
 A reação antígeno - anticorpo se processa em dois estágios: no primeiro há 
ligação especifica entre o determinante e o anticorpo correspondente e no 
segundo dá-se o fenômeno visível, como por exemplo, a aglutinação, ou 
desenvolvimento de cor através da ação enzimática sob um substrato, precipitação. 
 
Reação de Precipitação 
 
 Antígenos solúveis, em presença de seu anticorpo correspondente, formam 
um precipitado desde que a concentração dos reagentes, de acordo com a lei da 
ação das massas, permita a constituição de complexos em concentração suficiente, 
para atingir o ponto de precipitação ou insobilização. Zona de equivalência é o ponto 
em que, no sobrenadante, não há antígeno nem anticorpo; todo anticorpo e todo 
antígeno disponíveis foram precipitados. 
Em uma reação envolvendo antígeno e anticorpo, podemos Ter duas 
situações onde o excesso de um dos componentes prejudica a precipitação, 
dificultando a visualização podendo assim falsear o resultado do teste. 
 
Efeito pró- zona: Caracteriza-se por excesso de anticorpos. A insuficiência 
 de antígeno presente na reação, prejudica a precipitação; 
 
 
 Antígeno 
 
 Anticorpo 
 
 
 
Efeito pós- zona: Caracteriza-se por excesso de antígeno, onde a formação 
de precipitado fica prejudicada devido a formação de 
 complexos solúveis. 
 
 
 
 
 
 
 Zona de equivalência: Caracterizada pelo equilíbrio entre anticorpo e antígeno. 
 
 
 
 
 
 
 
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Reação de Precipitação em Gel: 
 
Imunodifusão Radial Simples: (Técnica quantitativa) 
 
Tem-se um anticorpo específico para determinado antígeno, incorporado ao gel. Em um dos 
orifícios feitos neste gel, é colocada a amostra (antígeno) com concentração desconhecida 
a ser determinada. Há difusão radial a partir do orifício, e quando todo o antígeno tiver 
difundido, verifica-se a opacificação em forma circular em torno do orifício. O diâmetro dos 
halos de precipitação corresponderão a concentração do antígeno em questão (em mg ou 
UI) EX: Determinação do nível de imunoglobulinas séricas (IgG,IgA, IgM) e Frações do 
Complemento (C3,C4). 
 
 
 Gel com anti-C3 
 
 soro com C3 
 
OBS: Esta técnica pode ser substituída pela de Turbidimetria. 
 
Imunodifusão Dupla ( ouchterlony) ( Técnica qualitativa) 
 
Quando em dois pontos diferente de uma camada de gel, posta em posição horizontal, 
colocam-se o antígeno e o anticorpo, um difunde contra o outro formando o precipitado na 
área de encontro. Se na amostra testada, tivermos presente o mesmo sistema (mesmo 
antígeno contra o mesmo anticorpo,), a linha de precipitação formada será a mesma, 
fazendo com que os arcos se encontrem perfeitamente, formando-se uma “linha de 
identidade”. Isto ocorre porque a difusão depende do PM do anticorpo, coeficiente de 
difusão do antígeno. Ex. de aplicação, determinação de anticorpos contra antígenos 
solúveis do núcleo (RNP,Ssa,) 
 
 Ag A (teste) = Ag A 
 
 
 
 AC anti-A 
 
 
 
 
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Reação de Aglutinação 
 
 O principio das reações de precipitação e aglutinação é fundamentalmente o 
mesmo. Apenas na aglutinação o antígeno é particulado, isto é , encontra-se sobre 
uma partícula. 
 Na aglutinação direta a partícula contém naturalmente o antígeno Ex: tipagem 
ABO 
 Na aglutinação indireta o antígeno é “adsorvido” sobre a partícula. 
 A aglutinação é a formação de agregados suficientemente grandes, de 
células interligadas por pontes moleculares de anticorpos que se combinam 
simultaneamente com dois determinantes antigênicos iguais, porém situados à 
superfície de duas células diferentes. A célula é apenas um suporte particulado 
sobre o qual estão presentes as moléculas de antígenos com seus determinantes. 
 Na aglutinação também temos o problema de pró-zona. Duas possibilidades 
são sugeridas para explicar o fenômeno: 
 - Quando há excesso de anticorpos, há menor possibilidade de que a mesma 
molécula de anticorpo se ligue a determinantes de células diferentes. 
 - Há casos em que estão presentes anticorpos bloqueadores, que bloqueiam 
os determinantes antigênicos, impedindo a ação dos anticorpos aglutinantes. 
 
Exemplos de reações de aglutinação: Monotest, coombs, hemaglutinação, Pesquisa 
de Fator reumatóide, ASLO, Proteína C Reativa, etc... 
 
 
REAÇÕES DE IMUNOFLUORESCÊNCIA 
 
 Quando uma substância recebe excitação por luz de determinado 
comprimento de onda e emite luz de maior comprimento, tem-se o fenômeno da 
fluorescencia. O isotiocianato de fluoresceína é a substância mais comumente 
usada, para a marcação de anticorpos usados nas reações de fluorescência, são os 
chamados conjugados fluorescentes. 
 
Imunofluorescência direta: 
 
 É a pesquisa de um antígeno em uma preparação, por um anticorpo 
purificado específico, marcado pelo fluorocromo (isotiocianato de fluoresceina). 
 
 Fluoresceína (marcador fluorescente) 
 
 Anticorpo específico (reagente comercial) 
 
 Antígeno (substancia pesquisada) 
 
É utilizada na pesquisa e caracterização de sorotipo de leptospira, cândida 
albicans,etc... 
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Imunofluorescência indireta: 
 
 Sobre a preparação de um antígeno purificado conhecido, fixado em uma 
lâmina, aplica-se a amostra que pode conter anticorpos específicos dirigidos contra 
o antígeno em questão. 
 Após haver a reação antígeno-anticorpo, lava-se a preparação para remover 
todas as proteínas(Igs), não específicas, que não se fixaram. A seguir, coloca-se 
sobre a preparação, anticorpos fluorescentes (conjugado), com especificidade 
dirigida para os determinantes antigênicos do anticorpo ligado ao antígeno( anti- 
anticorpo), podendo este conjugado ser contra IgG ou IgM, permitindo assim a 
determinação da classe do anticorpo. 
 Esta técnica é muito aplicada para a pesquisa de anticorpos no diagnóstico 
da Toxoplasmose, Chagas, Fator antinuclear, etc... 
 
 
 anti-anticorpo marcado com fluoresceina (reagente comercial) 
 
 anticorpo (pesquisado no soro) 
 
 antígeno (conhecido- reagente comercial) 
 
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO ( EIA) 
 
 ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay) 
 No método de ELISA, utilizamos uma outra maneira de visualizar a reação 
antígeno –anticorpo. 
 Ao invés de termos um fluorocromo, como na técnica de imunofluorescência, 
para a visualização da reação, temos uma enzima marcando o antígeno ou 
anticorpo. Esta enzima vai agir sobre um substrato adequado, gerando um produto 
colorido que será medido espectrofotométricamente. 
 O ensaio é desenvolvido sobre uma fase sólida, que pode ser constituída 
tanto de antígeno (quando quisermos pesquisar a presença de anticorpos na 
amostra a ser testada), como de anticorpos (quando se deseja pesquisar a 
presença de antígeno na amostra). 
 Este antígeno ou anticorpo conhecidos, são adsorvidos em superfícies 
plásticas (poliestireno ou polivinil), sensibilizando a superfície que constituirá a fase 
sólida. Sobre esta placa sensibilizada é colocado o soro a ser testado. 
 
 
 
 AG soro ( AC) = 
 
 
 
 AC Soro ( Ag) 
 
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Normalmente, os antígenos usados para a sensibilização das placas para 
teste de ELISA comerciais, são obtidos através de engenharia genética utilizando-
se a técnica de DNA recombinante, ou através de sintetizadores, obtendo-se 
peptídeos sintéticos. Isto confere uma grande pureza ao antígeno, minorando 
grandemente reações falso positivas. 
 Após a reação antígeno-anticorpo ter ocorrido, faz-se uma lavagem para 
retiradade componentes inespecíficos do soro não fixados, e o conjugado 
apropriado (antígeno ou anticorpo marcado) é colocado para revelar a reação. 
 
 
 Anti-anticorpo marcado com enzima Anticorpo específico com enzima 
 Antígeno com enzima 
 Ag soro 
 Ac soro 
 ac placa 
 Ag placa 
MÉTODO 
INDIRETO SANDUÍCHE 
 
 
 Ag 
 Antígeno específico marcado com enzima 
anti IgM 
IgM 
 
CAPTURA 
 
Após esta Segunda etapa, faz-se nova lavagem para retirada do conjugado não 
fixado e adiciona-se o substrato adequado para a enzima ( Peroxidase, Fosfatase 
alcalina,,,) Se houve a reação antigeno-anticorpo (POSITIVA), haverá conjugado 
preso a placa e este atuando sobre o substrato, desenvolverá a cor que será medida 
espectrofotométricamente. Caso a reação tenha sido negativa, o conjugado livre 
terá sido lavado fora, e não havendo enzima para atuar sobre o substrato, não 
haverá desenvolvimento de cor 
 
Enzima substrato conjugado 
 Ação Lavado fora 
 anti-Ac enzimática 
 
 
 substrato oxidado 
 COR 
 Substrato 
 sem ação enzimática 
 INCOLOR 
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MÉTODO ENZIMÁTICO DE COMPETIÇÃO 
 
 
 Ac anti –virus C 
 marcado 
 Com enzima 
 
 Ac anti- virus C 
 Presente no soro 
 
 
Antígeno do virus Hepatite C 
 
 
 Substrato COR 
 
 
 
Se anticorpos estiverem presentes no soro, competem com o anticorpo marcado, 
impedindo que este último se ligue. Ao ser colocado o substrato enzimático, não 
haverá desenvolvimento de cor 
 
 
Se não houver anticorpos anti-virus C na amostra, o anticorpo anti- virus C marcado 
com enzima se liga ao antígeno da placa, e ao ser colocado o substrato, haverá 
desenvolvimento de cor. Então nos ensaios de competição: 
COR = negativo 
INCOLOR = positivo 
 
 
 
MÉTODOS RADIOMÉTRICOS, FLUORIMÉTRICOS, QUIMIOLUMINESCENTES. 
 
 Os princípios usados nestes métodos são semelhantes aos descritos para os 
métodos imunoenzimáticos. O que altera de um para outro são os marcadores 
usados. 
 
 Nos radioimunoensaios (RIA), o marcador ao invés de ser uma enzima, é 
uma substância radioativa (C14). Ao invés de uma reação corada, teremos como 
resultado emissão de radioatividade. Esta será medida por um cintilador, nos dando 
a indicação da presença ou não do anticorpo ou antígeno pesquisado. 
 
 Nos métodos fluorimétricos, temos ao invés de emissão de radiação, a 
emissão de luz por uma substância capaz de ser excitada por uma FONTE 
LUMINOSA. (ex: umbeliferol, isotiocianato de fluoresceina, europio etc..) 
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 Nos métodos quimioluminescentes (CL), a emissão de luz ocorre devido a 
formação de um PRODUTO luminoso, resultado de uma REAÇÃO QUÍMICA. 
Ex: Dioxetano (oxiredução) Luminol; Luciferina (sofre a ação de enzima 
luciferase) Produto quimioluminescente. 
Luciferina é o nome genério para substratos quimioluminescentes existentes na 
natureza (ex: vagalume) 
Luciferase é o nome genérico para enzimas bioluminescentes. 
 
Esta luz é medida por um luminometro , podendo ser quantificada, nos dando a 
relação com a concentração, através de curva de calibração armazenada no 
aparelho utilizado. 
 
Ex aparelho fluorimétricos: IMX, Stratus, Axis, Vidas 
Ex aparelhos quimioluminescentes: Elecsis, Imulite. 
 
 
SENSIBILIDADE DOS DIFERENTES IMUNOENSAIOS: 
 
 
RIA detecta 10-17 moles 
 
EIA detecta 10-12 moles 
 
CL detecta 10-17 moles (até 10-21 moles) 
 
 
Vantagem do EIA e da CL sobre o RIA, é não utilizar substância radioativa, que 
são prejudiciais a saúde e tem vida média muito curta , o que não é bom para 
utilização em Kits de rotina laboratorial pequena. 
 
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Turbidimetria e Nefelometria 
 
 
.. .absorve Transmite 
 (TUBIDIMETRIA) 
 
reflete 
 Dispersão (NEFELOMETRIA) 
(Mudança de direção) 
 
 
 O uso de partículas de látex padronizada, sensibilizadas para pesquisa de antígeno 
ou anticorpo, padroniza o tamanho dos imunocomplexos formados. Pode-se sensibilizar as 
partículas com anticorpos monoclonais contra determinada proteína (ac contra frações do 
complemento,C3, por ex), ou com epitopos (antigenos) contra os quais pesquisamos 
anticorpos ( estreptolisina O –por ex ). 
 
Os imunocomplexos formados originam partículas grandes que absorvem a luz incidente ou 
desviam a luz emitida. Na turbidimetria o λ, comprimento de onda, é menor que a partícula, 
a qual absorve a luz. Na nefelometria o comprimento de onda é igual ao tamanho da 
partícula, a qual desvia a luz. A intensidade da luz transmitida (turbidimetria) ou dispersa 
(nefelometria), dependendo do número de complexos formados, será medida por 
espectrofotômetro ou nefelometro respectivamente, em dois momentos diferentes durante a 
reação (cinética de dois pontos). 
 
 A diluição do soro elimina a interferência de quilomicrons, LDL, VLDL, e complexos 
imunes circulantes, que possuem tamanho muito pequeno. A nefelometria é superior a 
tubidimetria por apresentar menor “background”, resultando em melhor especificidade e 
sensibilidade. A luz “contaminante” que possa existir no aparelho e a perda da luz desviada 
são as principais razões da menor especificidade e sensibilidade na turbidimetria. 
 
 
 Equivalência 
 
 
 
 Dissocia 
 
 
 
 (tempo) 
Excesso de Ac leitura Precipita excesso de Ag 
 
Durante a formação dos imunocomplexos, ocorre sempre associação e dissociação 
antígeno-anticorpo com o passar do tempo. Haverá sempre um momento de maior 
quantidade de grandes complexos formados, que tendem a formar rede e precipitar, por isto 
a reação é realizada sob agitação. Leituras muito baixas podem ser interpretadas como 
ausência de complexo formado ou presença de excesso do analito pesquisado (antígeno). 
Na tubidimetria, nestes casos dilui-se o soro, para eliminar a segunda possibilidade. 
Luz 
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ANTICORPOS MONOCLONAIS 
 
 Todo organismo animal está constantemente produzindo uma série de 
anticorpos diferentes, dirigidos a antígenos nele introduzidos por alimentos, 
infecções, etc. Assim, no soro obtido do animal de laboratório, estarão presentes 
outros anticorpos, além daqueles cuja produção foi induzida. Por serem produzidos 
por vários clones de plasmócitos (células que secretam anticorpos no sangue e na 
linfa), o soro produzido de maneira convencional é dito policlonal. 
 É possível obter, porem, outro tipo de solução, com anticorpos produzidos por 
um único clone, portanto, idênticos entre si. São os anticorpos monoclonais, que 
apresentam varias vantagens sobre o soro policlonal, como: 
 
- Especificidade (elimina falso positivos) 
 
-Sensibilidade (maior quantidade do anticorpo específico presente 
consegue detectar menor quantidade do antígeno) 
 
-Pode-se detectar vários epitopos de uma mesma molécula separadamente. 
(Importante na detecção de antígenos de diferenciação na classificação de 
leucemias) 
 Como o isolamento de um clone de plasmócito provindo de um animal 
imunizado é inviável, pois os linfócitos B não se mantém em cultura por mais de 
alguns dias, a solução foi fundir plasmócitos com células de mielomas (tumor 
benigno de plasmócitos). As células híbridas resultantes, denominadas hibridomas, 
possuem características das duas células: 
 
 - Sintetizam anticorpos 
 - Mantém-se indefinidamente em cultura 
 
 Após a fusão das células, os hibridomas positivos (produtores do anticorpo 
desejado) são isolados e expandidos, garantindo população de células puras, isto é, 
célulasgeneticamente idênticas e originadas de um unico ancestral 
(MONOCLONAL) 
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Células B Mortais 
Células Mieloma Imortais 
Células B não fundidas Mieloma não fundido 
MORTE MORTE no meio HAT 
Apenas hibridomas crescem no meio HAT 
Contém gen para produção de 
AC específico para o antígeno 
estimulado 
ELISA para pesquisa de anticorpo no 
sobrenadante da cultura 
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OBTENÇÃO DE ANTIGENOS ATRAVÉS DA TÉCNICA DE DNA RECOMBINANTE 
 
PLASMIDEOS: 
 
 É um DNA de fita dupla extracromossomico encontrado em bactérias (E. coli). 
Geralmente replicam e são segregados independentes do DNA cromossômico. São 
responsáveis pela resistência a antibióticos, hemolisinas, indutores de tumores em 
plantas, etc...São um dos vetores usados para a clonagem de DNA. 
 
 
O termo clonagem de DNA refere-se à purificação quantitativa de um determinado 
fragmento de DNA. Obtém-se assim milhões de moléculas de DNA com seqüências 
idênticas de nucleotideos. 
 Plasmideos com insertos da porção de DNA que se quer amplificar, são 
introduzidos em bactérias ( E.coli), sensíveis a ampicilina. Como o plasmideo 
manipulado possui uma porção que codifica resistência a ampicilina, as bactérias 
que passarem a portar o plasmideo recombinante serão resistentes a penicilina, 
permitindo a seleção das colônias de bactérias portadoras do plasmideo, o qual se 
replicará juntamente com a bactéria portadora, amplificando o fragmento de DNA 
desejado que será posteriormente extraído e purificado. Pode-se ainda ser obtido a 
produção de uma proteína específica, através da inserção de um cDNA, que fará 
com que a bactéria recombinante ao ser induzida, sintetize a proteína codificada 
pelo cDNA dos plasmideos nela inseridos. ( cDNA são fitas complementares aos 
RNAm maduros, cuja seqüência é traduzível em proteínas) 
BACTÉRIA 
 DNA cromossômico 
 
 
 Plasmideo 
 
DIGESTÃO Sitio da enzima de restrição 
 
 porção que confere resistência a ampicilina 
 
Plasmideo linearizado Fragmento a ser clonado LIGAÇÃO(DNA ligase) 
 
 sitio de resistência a ampicilina 
 
Inserto + 
 
 PLASMIDEO RECOMBINANTE BACTÉRIA SENSÍVEL A PENICILINA 
 
 
 
 
 BACTÉRIA resistente a 
 PENICILINA