Análises microbiológicas II

Prévia do material em texto

Análises Microbiológicas II
Identificação: CGP
Prof. MSc. Débora Palmeira
Introdução
Os principais cocos Gram-positivos de importância clínica estão classificados como estafilococos, estreptococos e enterococos;
Existem diversas provas capazes de diferencias os três grupos e suas diferentes espécies;
Identificação Preliminar
As bactérias pertencentes aos grupos Estafilococos e Estreptococos podem ser diferenciadas através das seguintes características:
 - Morfologia na coloração de Gram;
 - Morfologia das colônias no meio de cultura;
 - Prova da Catalase.
Morfologia das Colônias
Streptococcus pneumoniae – cepa encapsulada
Streptococcus viridans
Enterococcus faecalis
Streptococcus pyogenes
Staphylococcus aureus
Prova da Catalase
Essa prova detecta a presença de citocromos oxidases nos estafilococos;
O teste é realizado com peróxido de hidrogênio (H2O2) sobre uma lâmina;
Princípio: a imediata produção de efervecência indica conversão do H2O2 em água e oxigênio gasoso.
Prova da Catalase
CatalasePositiva
CatalaseNegativa
Staphylococcus
Streptococcus
Micrococcus
Enterococcus
Resultado:
Staphylococcus X Micrococcus
Para diferenciar as bactérias dos dois gêneros, utiliza-se, principalmente, a prova de Oxidase:
São utilizados discos ou fitas de papel filtro impregnados com dicloridrato de tetrametil p-fenilenodiamina;
Princípio: torna as células permeáveis ao reagente da oxidase.
Staphylococcus X Micrococcus
Resultado:
 - Positivo -> aparecimento de cor azul-púrpura;
 - Negativo -> ausência de cor dentro de 30 segundos
Micrococcus
Staphylococcus
Identificação de Staphylococcus
Existem diversas espécies de Staphylococcus descritas. Porém, as espécies de maior importância clínica são dividas em dois grupos:
 - Coagulase positiva -> S. aureus;
 - Coagulase negativa (SCN) -> S. epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus.
Identificação de Staphylococcus
Prova da Coagulase em Lâmina: a maioria das cepas de S. aureus possui uma coagulase unida ou “fator de agregação” na superfície da parede celular que interage diretamente com o fibrinogênio presente no plasma e produz rápida aglutinação das células bacterianas;
 - 2 gotas de salina + colônia + 1 gota de plasma;
 - Observar se há aglutinação em 10 segundos.
SCP
S. aureus
SCN
Identificação de Staphylococcus
Prova da Coagulase em Tubo: a coagulase detectada por esse método é secretada extracelularmente e reage com uma substância presente no plasma denominada “fator de reação com a coagulase (CRF)” formando um complexo que reage com o fibrinogênio, resultando em formação de fibrina;
 - Adicionar 0,1mL de caldo BHI incubado com colônia suspeita a um tubo com 0,5mL de plasma;
 - Incubar por 4 horas na estufa ou banho-maria.
Identificação de Staphylococcus
Prova da Coagulase em Tubo:
SCP
S. aureus
SCN
Identificação de Staphylococcus
Provas confirmatórias para Staphylococcus aureus:
 - Prova da DNAse (Desoxirribonuclease);
 - Prova da Endonuclease Termoestável;
 - Fermentação de Manitol.
OBS: S. aureus produz DNAse e Endonuclease termoestável (ambas as enzimas hidrolisam o DNA) e é capaz de fermentar o manitol.
Identificação de Staphylococcus
Prova da DNAse: 
 - As colônias em análise são semeadas em meio contendo DNA e o corante azul de toluidina O (ou azul de ototoluidina);
 - Incubar por 24h a 35°C;
 - Interpretação: meio inalterado (negativo), meio azul intenso a rosa (positivo) -> Hidrólise de DNA -> S. aureus. 
Identificação de Staphylococcus
Prova da Endonuclease Termoestável: utiliza-se o mesmo meio da prova da DNAse;
 - Inocula-se as colônias em caldo;
 - O caldo deve ser aquecido por 15 minutos em banho de água fervente;
 - Gotejar o caldo aquecido na placa e fazer furos de 3mm de diâmetro no meio de cultura;
 - Incubar por 24h a 35°C.
Identificação de Staphylococcus
Fermentação de Manitol: utiliza-se o ágar manitol salgado (ágar-sais-manitol ou meio de Chapman);
 - Indicador de pH é o vermelho de fenol -> meio avermelhado.
 - Inocula as colônias no meio de cultura e incuba a placa por 24h a 35°C;
 - Leitura: meio inalterado (negativo) ou meio amarelado em volta das colônias (positivo)-> indica fermentação do manitol -> S. aureus.
Fermentação do Manitol
	 Positivo				Negativo
Identificação de Staphylococcus
Identificação de Staphylococcus coagulase negativa (SCN): 
 - Produção de Fosfatase (S. epidermidis);
 - Sensibilidade à Novobiocina (S. saprophyticus);
 - Fermentação de açúcares (S. haemolyticus).
Identificação de Staphylococcus
Produção de Fosfatase -> prova utilizada para identificação presuntiva de S. epidermidis que utiliza ágar Mueller-Hinton com pH 5,6-5,8 contendo p-nitrofenil fosfato;
 - O semeio é feito em forma de mancha e a placa é incubada por 24h a 35°C;
 - A presença de cor amarelo brilhante abaixo e ao redor do inóculo representa prova positiva -> bactéria produz fosfatase -> S. epidermidis.
Identificação de Staphylococcus
Sensibilidade à Novobiocina: teste de tolerância muito útil para identificação de S. saprophyticus (Método de Kirby-Bauer -> disco difusão);
 - Preparar uma suspensão do microrganismo em caldo BHI, TSA ou solução fisiológica, acertando a turvação em 0,5 na escala de MacFarland;
 - Com auxílio de um swab, semear na superfície de uma placa de ágar Mueller-Hinton ou AS Mueller-Hinton;
 - Esperar secar e com uma pinça flambada ou esterilizada em álcool, colocar um disco de Novobiocina na superfície do meio, pressionar delicadamente com a pinça e incubar a placa.
Identificação de Staphylococcus
Sensibilidade à Novobiocina
 	Interpretação
 
- Sensível -> presença de halo de inibição ≥16mm diâmetro;
 - Resistente -> ausência de halo de inibição ou halo ≤12mm de diâmetro.
Sensibilidade à Novobiocina
Interpretação de Staphylococcus
Fermentação de açúcares: série de provas utilizadas para identificação de S. haemolyticus;
 - Inóculo é realizado em uma série de tubos com meios que contêm diversos açúcares e o indicador de pH vermelho de fenol;
 - Os tubos são incubados por 24h a 35°C;
 - Leitura:
	Meios inalterados (vermelhos) -> negativo;
	Meios amarelos -> positivo -> fermentação do açúcar.
Identificação de Staphylococcus
Fermentação de açúcares para S. haemolyticus
	Interpretação
 - Frutose -> negativo;
 - Maltose -> positivo;
 - Manose -> positivo.
 - Urease -> negativo.
CGP
Catalase
 +
 -
Estreptococos
 +
 -
Estafilococos
Oxidase
Micrococcus
Staphylococcus
Coagulase 
 +
 -
SCP (S. aureus)
SCN
Staphylococcus
Coagulase 
 -
SCN
 +
SCP (S. aureus)
DNAse
Endonuclease
Termoestável
Manitol
S. aureus
SCN
 +
 -
S. aureus
SCN
 +
 -
 +
 -
S. aureus
SCN
S. epidermidis
S. saprophyticus
S. haemolyticus
Fosfatase (+)
Frutose (-)
Maltose (+)
Manose (+)
Urease (-)
Novobiocina (R)
Identificação dos Estreptococos
A primeira diferenciação dentre os estreptococos é feita através da observação da aparência da placa de ágar sangue:
 - Alfa hemólise: Streptococcus grupo viridans, S. pneumoniae, Enterococcus spp.;
 - Beta hemólise: S. agalatiae, S. pyogenes, Enterococcus spp.;
 - Gama hemólise: Enterococcus spp., Streptococcus grupo viridans, S. agalactiae.
Identificação de Estreptococos
Identificação de Estreptococos alfa hemolíticos:
 - Sensibilidade à Optoquina -> diferenciar S. pneumoniae
 - Prova da Bile solubilidade -> diferenciar S. pneumoniae;
 - Prova da Bile esculina -> identificação presuntiva para Enterococcus spp.;
 - Prova de Tolerância ao Sal -> diferenciar Enterococcus spp.;
Identificação de Estreptococos
Identificação de Estreptococos alfa hemolíticos
Sensibilidade à Optoquina -> o semeio é feito em placa contendo AS através do método de Kirby-Bauer, colocando-se um disco contendo optoquina no centro, e incubada a 35°C em campânula por 24h.
Interpretação:
 - Halo ≥ 14mm de diâmetro (sensível)-> Streptococcus pneumoniae;
 - Halos menores devem ser confirmados com provas alternativas para Enterococcus e Streptococcus grupo viridans.
Identificação de Estreptococos
Optoquina (S) -> Streptococcus pneumoniae
Identificação de Estreptococos
Identificação de Estreptococos alfa hemolíticos
Prova da Bile solubilidade -> 
 - Caldo: utilizar um caldo turvo após 3h de incubação e inocular uma suspensão de desoxicolato a 10%.
	Interpretação: clareamento da turbidez representa lise bacteriana (teste positivo) -> S. pneumoniae.
Identificação de Estreptococos
			 Bile solubilidade
Negativa
Positiva
Identificação de Estreptococos
Identificação de Estreptococos alfa hemolíticos
Prova da Bile solubilidade -> 
 - Placa: inocular gotas de desoxicolato sobre as colônias e incubar por 30 minutos a 35°C;
	Interpretação: desaparecimento das colônias (prova positiva) -> S. pneumoniae.
Identificação de Estreptococos
Identificação de Estreptococos alfa hemolíticos
Prova da Bile esculina -> é realizado em tubo contendo ágar inclinado (AI) contendo 40% de bile e esculina, fazendo estrias em sua superfície e incubar por 24h a 35°C;
Princípio: as espécies de Enterococcus são capazes de hidrolisar a esculina, escurecendo o meio.
Interpretação: enegrecimento do meio (teste positivo) -> Enterococcus.
Identificação de Estreptococos
			 Bile esculina
 Positiva
Negativa
Identificação de Estreptococos
Identificação de Estreptococos alfa hemolíticos
Prova de Tolerância ao Sal: inóculo é realizado em AI contendo 6,5% de NaCl por 24h a 35°C;
Interpretação: presença de crescimento no meio indica tolerância ao NaCl (prova positiva) -> Enterococcus spp.
Identificação de Estreptococos
Identificação
SensibilidadeàOptoquina
Bile solubilidade
Bile esculina
Tolerância a 6,5% deNaCl
S.pneumoniae
S
+
-
-
S.grupoviridans
R
-
-
-
Enterococcus
R
-
+
+
Identificação de Estreptococos alfa hemolíticos:
Identificação de Estreptococos
Identificação de Estreptococos beta hemolíticos:
 - Sensibilidade à Bacitracina -> identificação presuntiva de S. pyogenes;
 - Teste de CAMP -> identificação presuntiva de S. agalactiae;
 - Prova de PYR -> teste presuntivo para S. pyogenes e Enterococcus.
Identificação de Estreptococos
Identificação de Estreptococos beta hemolíticos
Sensibilidade à Bacitracina: é realizada em placa de AS através do método de Kirby-Bauer, colocando um disco contendo bacitracina, e incubar a 35°C;
Interpretação: a presença de halo de qualquer diâmetro representa prova positiva -> S. pyogenes.
Identificação de Estreptococos
Identificação de Estreptococos beta hemolíticos
Teste de CAMP: é realizado em placa de AS. É necessária a utilização de cepa de S. aureus produtora de β-hemolisina para inocular uma única estria no centro da placa. Para o teste, é feita uma estria perpendicular à de S. aureus com as colônias que se quer identificar;
Interpretação: S. agalactiae produzem “Fator CAMP” que interage com a β-hemolisina do S. aureus, aumentando o halo de beta hemólise, que fica em forma de flecha (teste positivo).
Identificação de Estreptococos
			 CAMP
Identificação de Estreptococos
Identificação de Estreptococos beta hemolíticos
Prova de PYR (pirrolidonil arilamidase): realizada em discos de papel filtro contendo PYR, esfregando as colônias neste.
Interpretação: ao gotejar o corante, observa-se mudança de cor se houver hidrólise de PYR pela enzima -> cor rosa/vermelha (teste positivo) -> S. pyogenes ou Enterococcus.
Identificação de Estreptococos
Identificação
SensibilidadeBacitracina
CAMP
PYR
Bileesculina
Tolerância a 6,5%NaCl
S.pyogenes
S
-
+
-
-
S.agalactiae
R
+
-
-
-
Enterococcus
R
-
+
+
+
Identificação de Estreptococos beta hemolíticos
Identificação de Estreptococos
Identificação de Estreptococos gama hemolíticos
Identificação
CAMP
PYR
BileEsculina
Tolerância a 6,5% deNaCl
Sensibilidade
Optoquina/ Bacitracina
Enterococcus
-
+
+
+
R
S.agalactiae
+
-
-
-
R
S.grupoviridans
-
-
-
-
R
CGP
Catalase
 +
 -
Estreptococos
Estafilococos
Alfa hemólise
Beta hemólise
Gama hemólise
Optoquina (S)
Bile solubilidade (+)
Bile esculina (+)
Tolerância a 6,5% NaCl (+)
S. 
pneumoniae
Enterococcus
Enterococcus
Bac (R)
CAMP –
PYR +
BE +
NaCl +
S. agalactiae
Bac (R)
CAMP +
PYR -
BE -
NaCl -
S. pyogenes
Bac (S)
CAMP -
PYR +
BE -
NaCl -
S. grupo viridans
Bac e Opt (R)
CAMP –
PYR -
BE -
NaCl -
Identificação de Estreptococos
Classificação e Identificação Sorológica:
 - Características antigênicas do carboidrato C de composição variável, localizado na parede celular;
Identificação de Estreptococos