Hibridização: Método de Detecção de DNA

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Hibridização
A reação da PCR é uma reação extremamente especifica e sensível, e há a possibilidade de ver se houve amplificação usando, por exemplo, a eletroforese. Entretanto, existem algumas reações da PCR em que a quantidade de DNA é muito baixa e mesmo fazendo uma reação de amplificação ainda não é possível ver uma banda de amplificação na eletroforese. 
Nesses casos, para saber se houve amplificação ou não, pode-se usar o método de hibridização, que consiste em usar princípios semelhantes da PCR. Como está querendo caracterizar DNA, por exemplo, pode usar uma sequencia de nucleotídeos para que se ligue naquela região especifica que quer saber se está presente ou não. 
Acontece que se tem o DNA e tem o pareamento de um oligonucleotideo, não é possível vê se pareou ou não, por isso é necessária à presença de um marcador (sonda) que pode ser radioativo ou não radioativo.
A hibridização baseia-se na propriedade intrínseca dos ácidos nucleicos de complementariedade das bases nitrogenadas. Por complementariedade de bases a sonda, sequencia de oligonucleotideo marcado, e a molécula alvo (analito) se une. A hibridização possui uma sonda e uma molécula alvo, o que caracteriza a ligação da sonda com a molécula alvo é a especificidade que a sonda se liga ao analito. 
A interação entre a sonda e a molécula alvo se da através de uma ligação seletiva e extremamente especifica, ao ponto de poder dizer que se não houve hibridização não há a molécula alvo. 
O sistema de hibridização se divide em sistema indicador e sistema detector. O sistema indicador representa a parte da sonda que vai se ligar diretamente a molécula alvo, através de uma ligação covalente, e o sistema detector é aquele que sinaliza através de florescência, coloração, etc. Dependendo da molécula alvo, vai necessitar de um ligante (sistema indicador) correspondente. 
A molécula alvo fica fixada em uma membrana. Na reação da PCR o DNA está em meio liquido e não se pode colocar uma sonda nesse meio reacional para buscar a complementariedade. É preciso inicialmente fazer uma eletroforese, separando por peso molecular, e posteriormente transferir o produto da eletroforese para um suporte, uma membrana. Depois que se coloca o analito e o ligante em meio reacional se faz uma etapa de lavagem, para que caso não haja a molécula alvo o ligante sai, fazendo com que não haja a emissão de sinal. 
Marcação a quente: marcação com material radioativo. 
Marcação a frio: marcação com material não radioativo. 
O sistema indicador pode ser dividido em dois tipos: sistema indicador direto e sistema indicador indireto.
→ Sistema indicador direto: marcador ligado na sonda. Apresenta como vantagem a não presença de anticorpo conjugado e necessita de uma única etapa de lavagem. E como desvantagem é que para cada tipo de analito há a necessidade de um indicador com um sistema detector especifico. Sua aplicação ocorre quando for cópias simples da molécula alvo proveniente de Southern ou Northern blot. 
Southern blot: transferência de DNA do gel para a membrana.
 Northern blot: transferência de RNA do gel para a membrana.
→ Sistema indicador indireto: mais utilizado, pois há o ganho em especificidade. Possui um sistema modificado ligado ao sistema indicador, que estará ligado diretamente a molécula alvo, porém esse sistema modificado não será capaz de emitir um sinal. E esse sistema modificado é alvo de um conjugado, que é um anticorpo que reconhece a estrutura e esse anticorpo possui um sistema detector que emite o sinal. Vai haver a necessidade de mais de uma lavagem. As condições físico-químicas que interferem na especificidade da ligação do sistema detector com o sistema indicador se chama estringência. Apresenta como desvantagem a necessidade de um anticorpo ligado ao sistema modificado, existe a possibilidade de no meio reacional que por ventura pode vir a ser reconhecida por esse anticorpo, então necessita de um tratamento para que interferentes não interfira na reação. Aplicação direta in situ, e em amostras de Southern, Northern e dot blot.
Hibridização in situ: caracterização dessas moléculas diretamente na célula. Colocam-se células em uma lamina e as trata com proteinases, que foram poros nas células. Através desses poros, há a entrada da sonda, que se liga ao DNA, RNA ou até mesmo proteína. 
Com o sistema indicador indireto é possível quantificar a quantidade de oligonucleotideo. Com a quantificação de DNA ou RNA dá para ver se o tratamento de alguma patologia está funcionando ou não. 
→ Método de marcação: O sistema indicador pode se localizar na terminação 5’, 3’ ou no meio da sequencia oligonucleotideo. Para que a sonda entre nos pontos é necessário que ocorra uma reação enzimática, fotoquímica ou química. 
Terminação 5’: nucleotídeo pequeno e marcação com material radioativa. A fosfatase alcalina vai retirar o fosfato do ultimo nucleotídeo e vai ocorrer a inserção de dNTP com o isótopo radioativo. 
Terminação 3’: nucleotídeo pequeno e marcação com material radioativa ou não. Um transferase terminal insere uma uracila nessas sequencia de nucleotídeo e nessa uracila será onde o sistema detector se encaixará. 
No meio da sequencia: nucleotídeo grande (mais de uma marcação). Faz-se uma desnaturação no DNA dupla fita e se utiliza dos hexâmeros randômicos, que é uma sequencia de seis nucleotídeos contendo os quatro nucleotídeos organizados de todas as maneiras possíveis. Algum deles vai reconhecer alguma parte do oligonucleotideo e nesse hexâmero vai haver um nucleotídeo com o sistema detector, podendo ser radioativo ou não. Ao final dessa ligação se faz outra desnaturação e se retira a sonda formada.