Resumo Bio Mol Aplicada 2

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RESUMO – BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA 
 
Técnicas de biologia molecular utilizados no diagnóstico genômico: 
Amplificação: PCR e eletroforese, PCR-RFLP, PCR em tempo real, PCR digital, 
sequenciamento. 
Hibridização: captura híbrida, southern blot, hibridização em tiras, hibridização in situ, 
microarranjo. 
1- PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) 
• É uma técnica que permite gerar, em um mesmo tubo de ensaio, bilhões de 
cópias de determinada sequência de DNA de interesse (técnica de 
amplificação in vitro). 
• Reação cíclica: produtos de um ciclo são substratos para o ciclo seguinte. 
• Processo termodinâmico e enzimático. 
• DNA é separado em fitas simples pela helicase que quebra as ligações de 
hidrogênio, a primase sintetiza pequenos fragmentos de RNA iniciadores 
(primers), a DNA polimerase utiliza a cadeia de DNA de fita simples como 
molde para síntese de uma cadeia complementar. 
• A PCR é conduzida em um pequeno tubo de plástico contendo: DNA 
polimerase termoestável, nucleosídeos trifosfatados (ATP, TTP, CTP, GTP), a 
amostra de DNA a ser amplificada, par de primers específicos, íons de 
magnésio (Mg+2) - cofator enzimático, tampão (solução para manutenção do 
pH) e água. 
• Temperatura de Melting: temperatura na qual metade das cadeias encontram 
dissociadas. (Tm é diretamente proporcional ao conteúdo de citosina e guanina 
– possuem ligação tripla) 
• Desnaturação inicial: 100°C por 1 minuto - 95°C por 2-5 minutos (artigo) - o 
calor é capaz de quebrar as ligações de hidrogênio entre as cadeias 
complementares. Converte fita dupla em fita simples. 
• Desnaturação: 98°C por 30 segundos - 95°C por 30 segundos (artigo) 
• Anelamento (primer): 50-60°C por 30 segundos – a redução da temperatura 
possibilita que os dois primers se anelem por meio da complementariedade, 
delimitando precisamente a região que será amplificada. 
• Cálculo de temperatura de anelamento: T = (4.CG + 2.AT) 
• Primers não devem ter uma diferença grande de temperatura de anelamento 
(4°C). 
• Polimerização (taq polimerase): 72°C por 30 segundos – o aumento da 
temperatura gera uma condição ideal para atividade da enzima DNA 
polimerase que sintetizará uma nota fita de DNA utilizando os primers como 
ponto de partida e os nucleosídeos trifosfatados para formar as novas cadeias. 
• Ao final de 30 a 40 ciclos são produzidas bilhões de cópias da sequência-alvo 
de DNA. 
• No final de todo o processo, o amplicon pode ser analisado por meio de 
eletroforese em gel de agarose. 
• Aplicações: diagnóstico de doenças genéticas, infecciosas e câncer, evidência 
forense e perfil genético, biotecnologia agrícola. 
• Limitações: custo dos reagentes e equipamentos, condições específicas para 
cada reação. Contaminação (falsos positivos) e falsos resultados negativos. 
• Fatores que influenciam o resultado: concentração dos reagentes (Mg, 
primers, DNA), curva de temperatura de anelamento. 
• Altas concentrações de primers geram bandas inespecíficas, curva de 
temperatura de anelamento. 
• Excesso de magnésio pode inibir a reação. 
 
2- ELETROFORESE 
• A visualização da PCR é possível majoritariamente na fase platô. 
• Separação do DNA, RNA ou proteína de acordo com tamanho do fragmento. 
• Diferença de potencial elétrico (polo positivo e negativo) - migração de um polo 
para o outro. 
• Material para eletroforese: matriz de gel (poroso semelhante a gelatina) - 
poliacrilamida (proteínas e DNA), agarose (DNA e RNA). Campo elétrico 
(migração do DNA, RNA e proteína). 
• A escolha da matriz depende do tamannho dos fragmentos analisados 
• Agarose: separa fragmentos de tamanhos distantes 100-3000 pb. 
• Poliacrilamida: maior resolução, separa fragmentos com até 1 pb de diferença. 
• A agarose não é solúvel em temperatura ambiente e precisa ser aquecida e 
resfriada para formação do gel - gelificação. 
• A porcentagem utilizada é medida em peso/volume. 
• Concentração de agarose: quanto mais fechada/concentrada a malha, mais 
resistência os fragmentos sofrem e mais separados ficam. 
• Solução tampão é utilizada para solubilizar a agarose - mantém pH estável, 
maior força iônica (carrega mais corrente que a água). 
• Etapas: 
• 1- Preparo do gel de agarose - solubilização da agarose no tampão, adição de 
um intercalante de DNA (moléculas que se inserem entre os pares de bases 
do DNA). 
• Intercalantes de DNA: Absorvem luz em um comprimento de onda e emitem 
em um comprimento maior – brometo de etídio: intercalante muito utilizado 
para visualização do DNA, excitação em luz UV, emissão em luz 
laranja/vermelho - corante. 
• 2- Preparo da amostra: Amostra + gel-loading buffer – aumenta a densidade e 
da cor a amostra. 
• Fatores que influenciam a eletroforese: concentração de brometo de etídio no 
gel, voltagem e tipo de tampão de eletroforese aplicada. 
• Fotodocumentador – luz UV - análise da corrida. 
• Analisa de baixo para cima. 
• DNA migra – para +. 
 
3- PCR-RFLP 
• Enzimas de restrição: enzimas bacterianas que reconhecem a dupla hélice e 
clivam em sítios de restrição. 
• Cada enzima possui um sítio de restrição específico. 
• Reconhece sequencias palindrômicas. 
• Aplicações das enzimas de restrição: mapas de restrição, geração de 
fragmentos para clonagem, fragmentação do DNA – Southern blotting, geração 
de fragmentos para uso como sonda molecular, detecção de SNPs. 
• Transversão: troca de purina – purina ou pirimidina – pirimidina 
• Transição: troca de purina – pirimidina ou pirimidina – purina. 
• O primer precisa começar com C ou G e a mutação não pode ficar no meio. 
• AA a enzima não cliva. 
 
4- PCR em tempo real 
• Master mix: mistura de todos os reagentes que se utiliza na PCR convencional 
(primers, íons). 
• Sistema baseado na detecção e quantificação de um sinal fluorescente - 
conversão do sinal fluorescente em valor numérico para cada amostra – 
permite constante detecção e monitoramento dos produtos de amplificação 
durante toda corrida. 
• Possui controle positivo e controle negativo. 
• Como o produto de PCR aumenta a cada ciclo, a fluorescência aumenta 
proporcionalmente. 
• Sem amplificação - os produtos começam a ser degradados 
• qPCR 
• Depende do tipo de molécula - 
• DNA: Detecção/quantificações de patógenos, detecção de mutações (SNP, 
CNV), alterações da cromatina (metilação). 
• Polimorfismo – consequências: variabilidade genética - raça, altura, 
susceptibilidade às infecções/doenças complexas/genotóxicos, metabolismo 
de fármacos, marcadores genéticos. 
• A maioria é polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP). 
• 2/3 são substituições de C por T. 
• Polimorfismo na região promotora: proteína expressa + lenta. 
• Nos éxons: pode alterar a função, estabilidade. 
• Nos íntrons: geralmente perde a função - proteína truncada. 
• Genotipagem: 1° anela sonda – 2 sondas, uma para cada alelo. Se anelar em 
um G e depois no A, o indivíduo é GA. 
 
5- EXPRESSÃO GÊNICA 
• Utiliza como matriz o mRNA - é pequeno e só possui uma fita e por isso é 
“difícil de trabalhar” 
• Retira a matriz de onde o gene é expresso – biopsia. 
• Mais etapas do que quando a matriz é DNA – precisa fazer um DNA desse 
RNA, por ser pequeno não dá pra fazer PCR. 
• Primer desenhado para a sequência do RNA: método trizol e coluna de sílica 
são os mais utilizados. 
• RNA - instável, manipulação difícil, qualquer coisa degrada o RNA. 
• cDNA – a enzima transcriptase reversa sintetiza um DNA a partir de um molde 
– utiliza mRNA como molde para síntese. 
• Alguns genes são expressos de forma diferente em diferentes fases do 
desenvolvimento humano. 
• Classificação: constitutivos – expressos em todas as células, essenciais para 
manutenção da vida, proteínas estruturais, envolvidas em processos básicos 
como geração de energia/replicação e manutenção do material genético - 
regulados – alvo do diagnóstico, se está expresso o indivíduo está infectado. 
• Expressão gênica - controleendógeno “housekeeping” (controle necessário 
para avaliar se o PCR está sendo feito de forma correta): corrige variações 
relacionadas a quantidade de tecido utilizada na extração (produto inicial), 
eficiência de extração em tecidos diferentes, eficiência da transcriptase reversa 
e degradação do RNA. 
• Principais controles endógenos/genes constitutivos: GAPDH, beta-actina, 18S. 
• RT-PCR: os reagentes são os mesmos que a PCR, os primers são desenhados 
a partir do mRNA. 
• Se na eletroforese não tem nada, mas tem no grupo controle, significa que 
aquele gene não é expresso. 
• PCR em tempo real – menos ciclos, maior concentração.