Bio Mol Aplicada

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RESUMO BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA AO DIAGNÓSTICO 
LABORATORIAL 
 
1- MUTAÇÕES GÊNICAS 
 
• A perpetuação do material genético depende da taxa de mutação - taxa 
elevada: em células germinativas (destruição da espécie), em células 
somáticas (destruição do indivíduo). 
• Permite a variação e evolução das espécies. 
• Mutações constitutivas: presente em todas as células do organismo, são 
transmitidas para células filhas durante a divisão celular e podem ser herdadas 
(presente em células germinativas) - ocorre durante a replicação do DNA ou 
por exposição a agentes mutagênicos, efeito varia de acordo com o local e tipo 
de mutação. 
• Mutações somáticas: mutação em células somáticas, podem ocorrer em 
qualquer momento da vida, como resultado de exposição a agentes 
mutagênicos, erros durante a replicação do DNA ou outros processos 
celulares. Não são transmitidas para geração seguinte. Podem ocorrer em 
qualquer tecido do corpo e podem afetar a função normal das células (doenças: 
câncer). 
 
- Mutações no DNA - 
• Erros durante o processo de replicação - erro na precisão e na fidelidade. DNA 
polimerase acrescentando um nucleotídeo errado na cadeia de crescimento: 
se os mecanismos de correção falharem as mutações podem permanecer e 
serem transmitidas para células filhas durante a replicação. 
• Lesões espontâneas ou induzidas - espontânea: erro de replicação, danos 
oxidativos em espécies reativas de O2, danos químicos por espontânea 
desaminação dos nucleotídeos. Induzidas: radiação ionizante, ultravioleta, 
agentes químicos mutagênicos, vírus e outros fatores ambientais: quebra de 
cadeia, altera sua estrutura ou sequência. Rearranjos cromossômicos: pode 
ocorrer por meio de deleções, duplicações, inversões e translocações 
(síndrome de Down: trissomia do cromossomo 21 (duplicação, adicionou uma 
cópia). 
• Inserção por elementos de DNA (transposons): “genes saltadores” insere uma 
sequência de genes em diferentes locais do genoma. Transposons são 
capazes de se mover pelo genoma devido enzimas, como transporase, corta 
o DNA ao redor do transposon e o insere em uma nova posição. 
• Mutações pontuais: afetam um ponto do genoma (6-10 nucleotídeos), podem 
ocorrer por substituição, deleção ou inserção 
• Pontos preferenciais de mutação - hotspots: geralmente contém sequencias 
ou nucleotídeos repetidos ou instáveis, que são mais suscetíveis a erros 
durante a replicação (alta taxa de mutação do genoma). Regiões 
microssatélite: sequencias curtas de repetições de nucleotídeos (1-6 pb), 
marcadores biológicos em estudos genéticos (identificar o indivíduo, 
determinar relações familiares, mapear doenças genéticas), geralmente são 
pequenas mutações por inclusão ou exclusão de um ou mais pb nas 
sequencias, pode levar a mudanças na função de genes próximos ou na 
regulação gênica, nem toda região microssatélite é um hotspot. Metilação das 
citosinas: ocorre nas ilhas CpG (ilhas com maior densidade de sequencias 
CpG, encontrada principalmente em regiões promotoras), a metilação é um 
processo epigenético onde um grupo metil se liga a posição 5 da citosina (com 
metil - supressão da transcrição, sem metil - ativação da transcrição), as ilhas 
CpG são mais suscetíveis a mutação devido a desaminação (a desaminação 
da 5-metilcitosina forma uma uracila, a uracila é considerada uma base 
incorreta pelo sistema de reparo do DNA e pode ser substituída por outras 
bases na replicação, levando a mutações), mutações nessas ilhas são 
frequentes em alguns tipos de câncer e podem levar a alterações na expressão 
gênica. 
• Mutação x Polimorfismo: o polimorfismo são variações genéticas relativamente 
comuns e não confere uma vantagem ou desvantagem significativa em termos 
de sobrevivência e reprodução. Ex: hemoglobina A – forma normal em 
indivíduos saudáveis. Hemoglobina S – forma diferente associada a anemia 
falciforme. Ex: gene da lactose. Podem ter efeitos fenotípicos sutis ou nenhum 
efeito. Mutações são variações raras no DNA e podem ter efeito patogênico. 
• Síndrome do X frágil: causa deficiência intelectual leve a grave - repetição 
CGG: 200 a 2000x próximo a ponta 5’ do gene. 
• Doença de Huntington: afeta a capacidade cognitiva, movimentos e equilíbrio 
emocional – repetição CAG: 40 a 120x na região codificante do gene HD. 
• Espécies reativas de O2 - oxidação: 
− Radiação ionizante: transversão - mutação pontual que substitui uma base por 
outra base, pode mudar a estrutura, função ou estabilidade da proteína. 
Ultravioleta – pode provocar inserção ou deleção nos nucleotídeos. Gama e 
raio x - difíceis de corrigir e impedem a replicação, são agentes clastogênicos 
usados nos tratamentos de câncer para matar células em rápida proliferação. 
− Produtos da respiração. 
− Radicais livres. 
• Análogos de base: compostos que possuem estruturas semelhantes as bases 
nitrogenadas, mas diferem em termos de composição da estrutura, podem ser 
utilizados para terapia já que pode interferir na replicação. Telômeros de base 
– ocorrem devido a rearranjos dos átomos de H e elétrons dentro da base, os 
rearranjos levam a diferentes estruturas que podem se parear de forma 
anômala com bases complementares levando a erros de pareamento na 
replicação e alterações na sequência de DNA. 
• Agentes intercalantes de DNA: se intercalam entre as bases de DNA e 
interrompem sua estrutura (distorcendo a estrutura da dupla hélice). A 
distorção pode afetar a ação das enzimas envolvidas na replicação, o que 
causa inserção ou deleção de um ou mais pares de base. Ex: doxorrubicina - 
quimioterápico. Ex: etídio brometo: causa fluorescência. 
• As mutações podem ser: 
• Silenciosas ou sinônimas: não prejudica a produção do aa, o códon é trocado 
por um que resulta no mesmo aa. (um mesmo aminoácido pode ser codificado 
por diferentes códons). 
• Não silenciosas ou de sentido contrário: a mudança da base altera o aa 
codificado, isso pode acarretar alteração da função, ganho de função ou 
alteração da estabilidade ou dobramento resultando em uma proteína não 
funcional ou de meia-vida reduzida). 
− Conservativas: altera um nucleotídeo, mas mantém características 
semelhantes da proteína. 
− Não conservativas: altera um nucleotídeo e o novo aa possui características 
complementares distintas. 
• Sem sentido: mudança introduz um stop códon e interrompe a proteínas antes 
do seu término, isso pode acarretar proteínas truncadas (+ curta – pode perder 
funções importantes), degradação do mRNA (mecanismo de qualidade que 
percebe o stop códon prematuro) ou perda da função da proteína. 
• Mudança de matriz de leitura (frame-shift): um ou mais nucleotídeos são 
inseridos ou deletados na sequência de DNA, alterando o quadro de leitura 
durante a tradução do mRNA. 
• O efeito das mutações depende da região do genoma que aconteceu a 
mutação: 
− Ilhas CpG: existem várias, controla a transcrição (quando está metilada não 
transcreve). 
− TATA box (promotor): indica o início da replicação e transcrição. 
− Éxons: indica a sequência de códons para formar o aa - região codificante. 
− Íntrons: os íntrons são removidos (splicing) garantindo a variabilidade genética 
- mutações nos íntrons alteram a formação da proteína. 
− Região de poliadenilação: indica o fim da transcrição e adiciona a cauda poliA. 
 
− Mutações em regiões não codificadas - 
• Enzima UGTA: + repetições de T e A no promotor (TATA box), diminui a 
expressão e atividade, conjuga a bilirrubina (facilita a excreção), mutação pode 
levar a icterícia, irinotecan (medicamento contra câncer) - a mutação afeta a 
capacidade de metabolizar o medicamento e aumenta os efeitos colaterais. 
• Enzima CYP3A5: mutação nos íntrons, tira a indicação de que um íntron é um 
íntron fazendo ele ser reconhecido como um éxon formando outra proteína - 
altera a forma como a proteína se expressa. 
 
2- DIAGNÓSTICO LABORATORIAL 
 
• 1°: coletar a amostra adequada - mutaçõessomáticas: coletar no local onde a 
mutação está expressa (biópsia). Mutações constitutivas: pode ser coletada de 
qualquer matriz biológica (o sangue é a melhor matriz para diagnóstico já que 
possui maior concentração de material genético). 
• 2°: extração e limpeza do DNA - expõe o DNA utilizando o tampão lise para 
romper a membrana plasmática, limpeza para retirar outras substâncias 
celulares, une o DNA para extrair o máximo de material genético. 
• 3°: quantificação do DNA: precisa ter um grau de pureza e concentração para 
um diagnóstico preciso. 260/230 (indica concentração de contaminantes 
orgânicos) - 1,8 – 2,0. 260/280 (indica concentração de proteínas) 1,8 – 2,2. 
Concentração de DNA – 20 – 50, o ideal é em torno de 30, maior de 50 pode 
ser necessário diluir, menor que 20 só consegue fazer PCR em tempo real. 
• Extração salting-out: concentração salina se torna muito alta e ocorre a 
diminuição da solubilidade das moléculas do solvente na fase aquosa, levando 
a formação de um sistema bifásico. 
 
3- PCR (REAÇÃO DE CADEIA DA POLIMERASE) 
 
• Cada especialidade precisa de uma unidade funcional própria. 
• O PCR é o mesmo (utiliza o mesmo tampão, enzima Taq, Mg) o que muda é a 
sonda e o primer de acordo com a finalidade do exame. 
− Taq: é uma DNA polimerase que sintetiza novas cadeias de DNA 
complementares amplificando a região de interesse. 
− Mg²: cofator essencial para a atividade da enzima Taq, estabiliza as ligações 
de fosfato do DNA fornecendo energia necessária para a polimerização do 
novo DNA. 
− A sonda e o primer se anelam de acordo com a complementariedade de bases 
• Identifica mutações genéticas e polimorfismos, oncologia (monitora progressão 
e resposta terapêutica), diagnósticos virais e na farmacogenética (se o 
indivíduo não possuir nenhuma alteração nas enzimas que metabolizam 
fármacos). 
• Forense e paternidade: utiliza eletroforese em gel (separa por tamanho e 
fragmento de DNA), analisa regiões microssatélite (o número de repetições é 
herdado e único em cada indivíduo, fingerprint, metade do nosso genoma são 
regiões de repetição. No teste de paternidade não precisa ser 100% por conta 
da recombinação gênica. 
• Vantagens: rapidez, custo relativamente baixo, simples de realizar. 
• Desvantagens: intensa manipulação laboratorial, extração do DNA, análises 
conduzidas em laboratórios especializados. 
• Copia (amplifica) apenas a região de interesse in vitro por meio de PCR e 
clonagem 
• O PCR copia em torno de 100 – 600 pb: utiliza o DNA polimerase in vitro para 
copiar o fragmento de interesse diversas vezes, amplificando a informação e 
permitindo a visualização e/ou análise. 
• É uma reação cíclica: o produto de um ciclo é substrato para o próximo ciclo. 
• É um processo termodinâmico (para desnaturar o DNA e romper as ligações 
de fosfato) e enzimático. A desnaturação ocorre no termocirculador. 
 
4- TÉCNICA DE EXTRAÇÃO COM COLUNA DE SÍLICA 
 
• 1° coleta: 
• Venopunção 
• O local de preferência é a fossa antecubital 
• Distribuição em H ou M. 
• EDTA: anticoagulante. 
• 2° extração: 
• Dividido em 4 etapas: lise, ligação, lavagem e eluição. 
• Lise: utiliza hemalise–RBC 10x e tampão lise para romper a membrana e expor 
o DNA. Retirar o máximo possível de sobrenadante (possui restos celulares 
como proteínas, lipídeos metabólicos). 
• Ligação: utiliza etanol para precipitar e condensar o DNA, após condensar 
transferir para o microtubo que possui a coluna de sílica (o DNA se liga a 
membrana da coluna por conta do seu caráter negativo). 
• Lavagem: adicionar tampões de lavagem para retirar os restos celulares e 
deixar a amostra pura (foram utilizados 2 na prática). 
• Eluição: transfere a coluna para um novo microtubo e adiciona o tampão de 
eluição entre o DNA e a coluna de sílica (o tampão rompe a interação entre o 
DNA e a sílica). 
• 3° quantificação: 
• Utilizamos o espectrofotômetro nanodrop – quantifica a concentração de 
acordo com a absorbância: 
• 260nm: concentração do DNA 
• 280nm: absorção de proteínas 
• 230nm: absorção de contaminantes (reagentes) 
• Pipetar 1 microlitro de H2O autoclavada no capilar e dar o “blank” (para calibrar 
e ajustar o espectrofotômetro evitando interferências na leitura) 
• Pipetar 1 microlitro do DNA e anotar a concentração do DNA, razão 260/230 
(contaminantes) e 260/280 (proteínas). 
• Os parâmetros que geralmente são utilizados para avaliar a qualidade do 
método de extração são: quantidade de DNA, pureza e integridade. O kit 
comercial estabelece a metodologia e qualidade da amostra.