Diagnóstico molecular de agentes infecciosos - Biologia Molecular Aplicada (1)

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Diagnóstico molecular de doenças infecciosas
O diagnóstico para agentes infecciosos é importante para que:
- a suspeita clínica seja confirmada
- tratamento adequado
- compreender a epidemiologia da doença
- adoção de medidas de controle
Métodos utilizados para diagnóstico:
1) Isolamento do agente infeccioso:
+ Padrão ouro.
+ Utiliza-se do exame microscópico direto e de cultura, porém, alguns
microrganismos não podem ser cultivados, podem estar encistados nos
tecidos dificultando a visualização ou, podem ser morfologicamente
indistinguíveis um dos outros;
2) Imunológico
+ Detectar anticorpos (IgM e IgG) específicos produzidos pelo indivíduo
contra determinado patógeno.
+ Pode ser realizado: RIFI; ELISA, …
+ Resultados rápidos e confiáveis.
+ Boa sensibilidade e especificidade
+ Relativamente barato
+ Incapaz de distinguir microrganismos morfologicamente semelhante.
3) Detecção de ácidos nucleicos
+ Detecta o DNA “estranho” que infecta o organismo hospedeiro, o agente
infeccioso apresenta sequências únicas que podem ser usadas para
diferenciação.
+ Utiliza-se sequência específica do parasito para que seja desenhado as
sondas para Southern blot ou para o desenho dos primers de PCR.
Os principais alvos para desenho de sondas ou iniciadores:
- Sequências repetitivas;
- Telômeros e microssatélites (em eucariotos);
- Locus do rDNA;
- Genes multicópias (bactérias);
Diagnóstico molecular de doenças infecciosas
- Sequência correspondente por genes de vias metabólicas únicas de
determinado gênero - altamente específico porém, sensibilidade
relativamente baixa.
Exemplo: Um indivíduo com Leishmaniose - DIAGNÓSTICO:
+ Cultura do parasito ou microscopia de aspirado da medula óssea
(procedimento invasivo)
+ Extrai o DNA do tecido afetado, coletado na biópsia; utiliza-se primers
específicos para Leishmania - amplificação - análise em eletroforese -
identifica o DNA do parasito;
HIV
Marcadores:
- 2 moléculas de RNA;
- Capsídeo proteico (p17, p24)
- Envelope (gp41, gp120)
- Enzimas: TR, PT, IT, RNAso
- Células alvo - Receptores CDA (LT)
- Co-Receptores: CCR5, CXCR4
Marcadores da infecção pelo HIV na corrente sanguínea de acordo com o
período que surgem após a infecção, seu desaparecimento ou manutenção ao
longo do tempo.
● Para diagnóstico molecular, temos o uso de técnica de reação de cadeia
da polimerase: RT-PCR quantitativa;
● Utilizado para contagem de carga viral do HIV; início e acompanhamento
do tratamento; avaliação de falha terapêutica.
A PCR quantitativa permite que a quantidade de DNA presente na amostra seja
quantificada.
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Outro uso para as técnicas moleculares é devido ao poder do vírus emmutar;
isso afeta a eficiência dos medicamentos = falha terapêutica.
Utiliza-se sequenciamento. 1º realizam a amplificação e logo depois, realizam o
sequenciamento (ddNTPs + dNTPs )
A genotipagem HIV é um exame disponível desde 2000, tem grande impacto na
sobrevida dos pacientes pois o tratamento se torna individualizado baseado no
perfil de resistência do vírus;
Nomenclatura da mutação:
As mutações devem ser identificadas para serem passadas a um infectologista;
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Expressão do receptor CCR5:
A mutação para homozigoto delta 32 gera resistência ao HIV por modificar o
receptor celular pelo qual o vírus entraria.
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Coronavírus
O diagnóstico pode ser realizado pela detecção de IgG e IgM, ademais, pode ser
realizado por meio do RT-PCR, ummétodo altamente específico e sensível.
O DNA utilizado comomolde pode ser extraído de qualquer célula, tecido ou
fluido biológico (mesmo amostras armazenadas em formaldeído ou incluídas
em parafina). Os métodos de extração de DNA são relativamente simples e as
amostras podem ser estocadas por vários meses.
● Vários métodos de amplificação estão sendo desenvolvidos.
● Apresenta amplo emprego em laboratórios de pesquisa e em
laboratórios clínicos.