BIO MOL

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UMIVERDIDADE DE SAO PAULO
FACULDADE DE CIENCIAS FARMACEUTICAS
DEPARTAMENTO DE ANALISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS
LABORATORIO DE BIOLOGAI MOLECULAR ALPLICADA AO DIAGNÓSTICO
Apostila de noções de Biologia molecular
Prof. Dr. Mario H. Hirata
Profa. Dra Rosário D. C., Hirata
1999�
ÍNDICE
Tópico	Página
Aula número 1:
Introdução	 2
Estrutura do DNA e RNA	 2
Replicação, transcrição e tradução	 4
Organização do genoma de eucariotos, procariotos e viral	 7
Enzimas de restrição e suas aplicações	 10
Aula número 2:
Extração do DNA genômico 	 13
Aula número 3:
Princípios de eletroforese	 19
Fatores que influenciam na eletroforese	 20
Tipos de suporte	 22
Tipos de eletroforese	 22
Aplicações da eletroforese nas técnicas moleculares	 23
Aula número 4:
Reação de polimerização em cadeia (PCR)	 28
Princípios da reação de PCR	 28
Protocolo geral para PCR	 31
Fatores que influenciam na PCR	 31
Escolha de iniciadores para PCR	 35
Aula número 5:
PCR no Diagnóstico das Doenças genéticas	 39
Polimorfismo e mutações	 39
Diagnóstico de alguns polimorfismos por PCR	 41
Polimorfismo de apolipoproteína	 42
Polimorfismo de receptores da LDL	 44
Aula número 6:
PCR no diagnóstico de Doenças infecto-contagiosas	 46
Meningites bacterianas	 47 
Tuberculose	 50
Infecção pelo virus da Hepatite C	 59
Infecção pelo virus HIV	 64
Aula número 7:
PCR e RFLP na identificação de indivíduos	 68
�
Aplicação da PCR em Laboratório Clínico e Medicina Forense
Aula número 1
Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata
Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata
Introdução
Os avanços nos estudos da biologia molecular em eucariotos tem contribuido significantemente para o entendimento da etiologia das doenças humanas. As técnicas de recombinação dos ácidos nucleicos têm permitido aos pesquisadores identificar os vários genes responsáveis por doenças hereditárias, avaliar os mecanismos de infecção dos microrganismos, conhecer os processos que regulam a diferenciação e proliferação celular (principalmente nos processos neoplásicos), entre outros. A biologia molecular vem também apresentando aplicação bastante expressiva na pesquisa de marcadores genéticos úteis no diagnóstico laboratorial. Por outro lado, as diferenças nas sequências do DNA, observadas entre as espécies ou entre os indivíduos, são extremamente úteis para as análises forenses, os testes de paternidade, a identificação de antígenos de histo-compatibilidade, a identificação de allelos mutantes, a identificação de gêneros e espécies de bactérias, fungos, leveduras, vírus e outros. 
Nesta apostila serão abordados os princípios básicos de biologia molecular, bem como serão descritas as aplicações da técnica de PCR no diagnóstico clínico e nos testes de identificação.
Estrutura dos ácidos nucleicos (DNA e RNA)
	As informações genéticas são armazenadas nos ácidos nucleicos. Há dois tipos de ácidos nucleicos: ácido desoxiribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). O DNA é encontrado principalmente nos cromossomos no núcleo das células, enquanto RNA está presente no citoplasma, havendo muito pouco nos cromossomos.
	Os ácidos nucleicos consistem de cadeias de nucleotídeos. Cada nucleotídeo é constituido por uma base nitrogenada, uma molécula de açúcar e um grupamento de fosfato (PO4=). Há dois tipos de açúcar nos ácidos nucleicos: 2-deoxiribose no DNA e ribose no RNA (Figura 1A). As bases nitrogenadas são as pirimidinas: citosina (C), timina (T) e uracila (U) e as purinas: adenina (A) e guanina (G). O DNA contém A, C, G e T, enquanto que o RNA contém U em vez de T. Em ambos DNA e RNA, os nucleotídeos estão ligados formando uma longa cadeia cadeia polinucleotídica. Essa cadeia é formada por ligações entre o grupo fosfato do carbono 5 de um nucleotídeo e o carbono 3 do açúcar do nucleotídeo adjacente (Figura 1B).
	Em geral, o RNA consiste de uma cadeia polinucleotídica simples, enquanto que o DNA é composto de duas cadeias polinucleotídicas pareadas, dispostas em direção contraria, sendo denominadas antiparalelas (Figura 1B). As ligações covalentes do esqueleto de açúcar-fosfato localizam-se na parte externa da estrutura e as bases nitrogenadas estão projetadas para a parte interna. O arranjo das bases na molécula de DNA segue uma sequência em que cada base de uma cadeia é pareada com outra base na segunda cadeia, de modo que guanina em uma cadeia é pareada com a citosina na outra cadeia e a adenina sempre pareia com a timina (Figura 1C). Dessa forma o DNA apresenta a estrutura tridimensional de dupla hélice, onde o ângulo e a distância entre um nucleotídeo e outro é sempre constante.
(A)
(B)
	
2-deoxiribose
ribose
(C)
 5’ fosfato 	3’ hidroxila
	
	3’ hidroxila 	5’ fosfato
Figura 1. Características estruturais das moléculas dos ácidos nucleicos. (A) Molécula do açúcar. (B) Representação diagramática do arranjo antiparalelo das duas cadeias polinucleotídicas do DNA. P representa o grupo fosfato. (C) Pareamento da bases na molécula de DNA mostrando as pontes de hidrogênio.
	E. CHARGAFF, em 1951, verificou que na molécula de DNA a relação entre as purinas e pirimidinas era constante na maioria das espécies animais, ou seja, a quantidade da purina, adenina, é igual a da pirimidina, timidina; da mesma forma, a quantidade da purina guanina é igual à da pirimidina citosina. Essa característica importante é definida pela propriedade fisico-química das moléculas com formas semelhantes se atrairem mutuamente com significante afinidade (força de atração de Van Der Waals), somada à força de atração entre os átomos de cargas opostas (ligações iônicas ou pontes de hidrogênio). Essas propriedades são bastante específicas e no caso do DNA elas operam de forma conjunta e simultânea com significante energia de interação, como se fosse um molde perfeito. Em resumo, pode-se dizer que a lei de CHARGAFF se baseia na especificidade da interação das bases puricas e pirimidicas, onde a citosina pareia apenas com a guanina e a adenina pareia apenas com a timidina ou uracila. É importante salientar que a ligação entre a A e T ou U ocorre por interação de 2 pontes de hidrogênio, enquanto que entre a C e a G a ligação se dá por 3 pontes de hidrogênio (ligação mais forte). Devido a essa especificidade do pareamento entre as bases; a sequência de uma das cadeias polinucleotídicas do DNA é complementar a outra (cadeia complementar).
	A estrutura secundária de dupla hélice (duplex) do DNA, descrita por Watson & Crick em 1953, está disposta linearmente. Entretanto, pode ser também circular como nas bactérias, plasmídeos e certos vírus, e pode ser também de fita simples como em alguns tipos de fagos. Entretanto, a disposição da molécula de DNA nos organismos superiores é de particular importância, onde a informação genética está amplamente concentrada nos cromossomas dentro do núcleo. O comprimento total dos 46 cromossomas humanos tem menos que 0,5 mm, entretanto se extendido pode atingir muitos metros. Isto se deve a que o DNA é compactado na forma super-enrolada em vários níveis: primário, duplex; secundário, ao redor das proteinas ligadas ao DNA (histonas) formando os nucleossomos; terciário, enrolado com os nucleossomas formando um cilindro ou estrutura solenoide; e finalmente quaternária, formando voltas ou “loops”. Esta disposição super-enrolada é a forma natural do DNA. 
Propriedades dos ácidos nucleicos
Os ácidos nucleicos podem ser dissociados e associados por processos físicos e químicos. Em condições fisiológicas, a estrutura de dupla hélice do DNA é bastante estável. No entanto, se essa estrutura for submetida a alta temperatura (90C a 100C) ou a pH extremos (menor que 3,0 ou maior que 10,0), ela se separa em duas fitas simples, sofrendo o processo de dissociação, desnaturação ou“melting”. Da mesma forma, ao submeter-se essas fitas simples a condições de associação (temperatura  a 65C, ou pH próximo de 7,0) por algumas horas, elas podem se reconstituir formando a dupla fita novamente, obedecendo a lei da complementariedade; ou seja a dupla fita somente se reassocia se as bases forem exatamente complementares. Esse fenômeno de associação é também denominado de renaturação, hibridização ou “annealing”. Esses processos de desnaturação e renaturação são essenciais para manipulação dos ácidos nucleicos in vitro, principalmente do DNA, contribuindo enormemente para o isolamento, comparação e identificação desses compostos. Outra propriedade física muito importante dos ácidos nucleicos é a sua capacidade de absorver energia na região do ultravioleta, apresentando o pico de absorbância máxima em 260 nm. Esta propriedade é útil tanto para a quantificação quanto para avaliar a pureza dessas substâncias. 
Replicação, transcrição e tradução
Replicação
Toda vez que uma célula se divide, todo o seu conteúdo de DNA é duplicado na íntegra, transmitindo em absoluto as informações genéticas contidas na célula precursora, esse processo denomina-se replicação. A replicação ocorrre de forma semi-conservativa, com as duas cadeias precursoras (DNA de dupla fita, dsDNA) servindo de molde para a síntese da nova cadeia (Figura 2). Dessa forma, para a replicação ocorrer é necessário que dupla fita precursora se abra formando 2 cadeias independentes (fita simples, ssDNA). Esse é um processo energeticamente desfavorável e ocorre com a ação conjunta de uma proteina DNA-específica e várias enzimas; sendo as fitas simples precursoras replicadas, então, de forma independente e separada. A replicação pode ter início em vários sítios, mas cada origem de replicação é utilizada uma vez, durante um simples ciclo celular. A fita filha é sintetizada pela ação catalizadora da DNA polimerase III, enzima que utiliza como molde a cadeia precursora e incorpora os nucleotídeos de forma sequencial na nova cadeia, produzindo-a de acordo com a lei de pareamento das bases. Como essa polimerase sintetiza DNA na direção de 5' para 3', a síntese de uma das cadeias complementares é realizada de forma contínua enquanto que a outra é sintetizada discontinuamente. Os fragmentos da cadeia discontínua são ligados pela enzima DNA ligase. Muitas outras proteínas estão envolvidas na estabilização e manutenção da integridade das cadeias simples que são precursoras para a síntese da dupla fita, assim como no reconhecimento dos sítios de iniciação. As DNA polimerases possuem também, além da função de sintetizar polinucleotídeos, atividade exonucleásica ou "a correção de leitura" na qual os nucleotídeos incorretamente incorporados são removidos. Essa propriedade é fundamental para a manutenção a integridade da sequência original.
Figura 2. Representação da molécula de DNA durante a replicação: as duas cadeias precursoras são separadas e as cadeias complementares que são sintetizadas. 
Transcrição
A síntese protéica não é resultante da leitura direta da sequência nucleotídica do DNA. Sabemos que o DNA está localizado no cromossoma do núcleo da célula e a síntese protéica ocorre quase que na sua totalidade nos ribossomas, localizados no citoplasma. As informações genéticas contidas na sequência nucleotídica do DNA têm que ser transferidas para uma molécula intermediária que pode mover-se para o citoplasma, o RNA mensageiro (mRNA), e que ordena, então, a síntese da proteina. O processo de síntese de mRNA é conhecido por transcrição e o tamanho da molécula de mRNA é definido pela sequência de aminoácidos que o ácido nucleico codifica.
Apenas uma das fitas do DNA é transcrita dando origem a uma única sequência de mRNA para cada gene. A indicação de qual fita do DNA deve ser transcrita é orientada por uma sequência específica denominada promotor, localizada antes (“upstream”) da sequência a ser transcrita, que é reconhecida pela RNA polimerase (enzima sintetisadora de mRNA). Como a RNA polimerase adiciona sequencialmente monofosfatos de ribonucleosídeo à extremidade 3’ da cadeia de RNA em crescimento, a polimerização ocorre na direção 5’ - 3’. Isto significa que cada molécula de mRNA será identica à sequência nucleotídica da fita de DNA que não é transcrita. O mRNA transcrito é transportado para os ribossomos (RNA ribossômico, rRNA) no citoplasma, onde ocorre a síntese protéica. 
	O material genético de certos virus (retrovirus) é o RNA e a informação genética segue, portanto, a direção reversa (de RNA para DNA). Este processo é conhecido por transcrição reversa, na qual a sintese de DNA é dirigida pelo RNA e a enzima responsável é denominada transcriptase reversa. Essa enzima tem importante função no ciclo vital dos retrovírus.
Tradução
	A relação entre a sequência de nucleotídeos do DNA e a sequência de aminoácidos da proteina correspondente é denominada código genético. Esse código é universal e é encontrado em todos os organismos vivos. O código genético é lido em grupos de três nucleotídeos, cada um codificando um aminoácido (Tabela 1). Cada sequência de trinucleotídeo é denominada codon e a sequência de condons que codifica um polipeptídeo específico é denominada cistron.
Tabela 1. O código genético
1a.base(5’)
2a. base
3a.base (3’)
U
C
A
G
U
Phe
Ser
Tir
Cis
U
Phe
Ser
Tir
Cis
C
Leu
Ser
Terminação
Terminação
A
Leu
Ser
Terminação
Trip
G
C
Leu
Pro
His 
Arg
U
Leu
Pro
His
Arg
C
Leu
Pro
Glu
Arg
A
Leu
Pro
Glu
Arg
G
A
Isoleu
Treo
Asp
Ser
U
Isoleu
Treo
Asp
Ser
C
Isoleu
Treo
Lis
Arg
A
Met*
Treo
Lis
Arg
G
G
Val
Ala
AcAsp
Gli
U
Val
Ala
AcAsp
Gli
C
Val
Ala
AcGlu
Gli
A
Val
Ala
AcGlu
Gli
G
* codon de iniciação
	O processo de decodificação pelo qual a informação genética presente na molécula de mRNA dirige a síntese proteica é denominado tradução. Esse processo envolve o mRNA, o rRNA e o RNA de transferência ou tRNA, encontrado no citoplasma. Cada tRNA tem 70-90 nucleotídeos em comprimento e é de fita simples, mas devido ao pareamento de bases dentro da molécula, adquire a forma de uma folha de trevo. Dentro dessa estrutura, um trinucleotídeo de sequência variável forma o anti-codon que pode parear com um codon da molécula de mRNA. Na outra extremidade da molécula de tRNA está uma sequência para ligação a um aminoácido específico. Portanto, um codon particular no mRNA é relacionado através de um tRNA a um dado aminoácido. Na tradução, o ribossoma liga-se primeiramente a um sítio específico na molécula de mRNA (codon de iniciação, ATG) que ajusta a fase de leitura ("reading frame"). O ribossoma, então, se movimenta ao longo da molécula de mRNA, traduzindo um codon de cada vez usando tRNAs para adicionar aminoácios ao final da cadeia polipeptídica em alongamento. A tradução é finalizada quando o ribossoma reconhece na fita de mRNA o codon de terminação ("stop codon"). A direção da leitura é de 5’-3’, sendo que a sequência de nucleotídeos da fita de DNA corresponde à sequência de aminoácidos da proteina traduzida na direção do N-terminal para o C-terminal.
	Em princípio as sequências de bases nos ácidos nucleicos devem ser traduzidas em qualquer fase de leitura diferente, dependendo onde o processo de decodificação se inicia. Para uma dada sequência UUAGCAAAGCUGCGAAUG, as três fases de leitura possíveis são :
 	UUA GCA AAG CUG CGA A
	 UAG CAA AGC UGC GAA U
	 AGC AAA GCU GCG AAU G 
Entretanto, o código genético não se sobrepõe, pois a fase de leitura é ditada pelas sequências de iniciação e de terminação da tradução presentes na molécula de mRNA. A fase de leitura pode ser alterada por mutações que removem ou inserem bases na sequência nucleotídica. Esse tipo de alteração é conhecido como descolamento de fase ("frameshift") e pode causar a perda total da função da proteina produzida.Organização do genoma de eucariotos, procariotos e viral
Estrutura Gênica
	Os cromossomas constituem-se de uma longa e ininterrupta sequência de nucleotídeos na qual estão dispostos muitos genes. O gene é uma unidade de herança constituida por uma sequência nucleotídeos que carrega as informações necessárias para a síntese de um dado polipeptídeo. O gene é uma entidade estável mas pode sofrer mutações, sendo que a nova forma do gene é herdada de modo estável, exatamente como a forma que lhe deu origem. Um gene pode existir em formas alternativas, denominadas alelos, que determinam a expressão de alguma característica particular. 
	Embora todos genes funcionais sejam transcritos, a maioria do DNA genômico não é totalmente transcrito. A quantidade total de DNA nuclear no genoma haplóide (gamético) humano compreende 3 x 106 kb. Como a maioria dos genes tem 1 a 20 kb em comprimento, deveria haver 1 milhão de genes, mas somente 3000 locos de doença foram identificados. Mesmo considerando todos os outros genes que conferem as características normais como altura e inteligência, uma grande porção do DNA genômico não tem função definida. Entretanto, mais e mais tem se observado que este DNA tem funções importantes, incluindo o controle de ação gênica.
	Genes que são responsáveis pela síntese de enzimas específicas ou peptídeos são denominados de genes estruturais, enquanto que os genes reguladores modificam os efeitos dos genes estruturais. 
Controle da expressão gênica
	Nas células existem mecanismos moleculares que controlam o número e a quantidade das proteinas produzidas. As diferenças na síntese proteica resultam de sinais moleculares que controlam as taxas em que as moléculas de mRNA são transcritas a partir do DNA (controle transcricional) ou traduzidas (controle traducional)
Processamento pós-transcricional do mRNA
	A transcrição e a tradução nos procariotos são processos concomitantes mas nos eucariotos são processos temporal e espacialmente desconectados. Como vimos, nos eucariotos a transcrição ocorre no núcleo e a tradução no citoplasma. Durante a passagem do núcleo para o citoplasma, o mRNA transcrito (denominado pre-mRNA) deve ser processado para que seja obtido o mRNA maduro. 
	Nos procariotos, a sequência de nucleotídeos do gene é colinear com a sequência de aminoácidos de uma dada proteína, entretanto, nos eucariotos a sequência codificante é geralmente interrompida por sequências adicionais. 
	A maioria dos genes dos eucariotos são compostos por regiões codificadoras denominadas exons e regiões não-codificadoras denominadas introns. Estes introns são sequências posteriormente removidas durante o processamento do transcrito primário. Esse processo é denominado processamento do RNA ou “RNA splicing”. Após a remoção dos introns, a RNA polimerase II adiciona uma sequência AAUAAA extremidade 3’ do mRNA, conhecida como poli-A. A maioria dos mRNAs eucarióticos possuem 100 a 200 resíduos de adeninas ligadas à extremidade 3', denominada cauda de poli-A, adicionada pela enzima poli-A polimerase. Antes que ocorra a remoção dos introns, o mRNA sofre a adição de resíduos de 7-metil-guanosina (Caps) na extremidade 5’, denominada metilação Cap. Esse processamento sofrido pelo mRNA torna a molécula mais estável e facilita o seu deslocamento para o citoplasma. Entretanto, mutações que ocorrem nas regiões de junção dos exons podem modificar o mRNA processado, produzindo um mRNA maduro que codifica para uma proteína diferente da original. 
	Alguns genes complexos tem moléculas de mRNA muito grandes, que são processadas de diferentes formas para produzir diferentes mRNA maduros que são traduzidos em polipeptídeos diferentes. Esse processo é denominado processamento alternativo (“alternative splicing”) e ocorre no mesmo tecido mas em diferentes estágios de desenvolvimento e diferenciação e pode também ocorrer em diferentes tecidos.
Estrutura gênica dos procariotos
	Existem regiões específicas no DNA, denominadas promotores que identificam o sítio de início da transcrição do RNA (região na qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição). 
	Nos procariotos, os genes que codificam as enzimas pertencentes a uma mesma via metabólica são adjacentes uns aos outros e agrupados ("cluster") ao longo do cromossomos junto com sequências regulatórias. Este conjunto é denominado operon, sendo que a sequência que regula a expressão desses genes é denominada operador. O operador encontra-se antes (“upstream”) da sequência do promotor, nas posições de -35 a -10 antes do início da sequencia codificante. Nos procariotos, a regulação destes operons obedece a condições nutricionais ou ambientais. O estímulo da expressão de uma enzima em resposta à presença de um substrato particular é denominada indução. A lactose, por exemplo, pode servir como fonte de carbono e energia para a Escherichia coli. O metabolismo deste substrato depende da hidrólise de seus componentes, glicose e galactose, pela enzima -galactosidase. A presença de lactose (indutor) induz a síntese de -galactosidase por ativação do operon da lactose (operon lac), aumentando a taxa de ligação da RNA polimerase ao DNA e a taxa de síntese do mRNA da -galactosidase. Na ausência do indutor o operon é reprimido pela ação do repressor. O repressor liga-se a uma sequência especifica no operador, bloqueando a ligação da mRNA polimerase ao promotor, inibindo assim a síntese de mRNA que codifica para a  galactosidase.
Estrutura gênica dos eucariotos
	Os promotores dos eucariotos são elementos que sinalizam o sítio onde a transcrição deve iniciar-se e, possivelmente, controlam o nível de expressão do gene associado. Geralmente estão localizados cerca de 30 bases “upstream” do codon de iniciação (ATG) e ompreendemsêquencias denominadas “boxes” ou “motifs”. As mais frequentes são as TATA, CAT e CG “boxes. 
	Além dos promotores, os genes dos eucariotos possuem sequências regulatórias adicionais conhecidas como amplificadores ("enhancers"), que podem estar muito distantes do promotor (antes ou depois, “upstream” ou “downstream”) e que potenciam a taxa de transcrição. É importante salientar que estes amplificadores não são específicos e potenciam a transcrição de qualquer promotor que estiver na sua vizinhança. A eficiência da expressão de um gene em um tecido específico depende da adequada combinação e integração dos amplificadores, dos promotores e das sequencias adjacentes.
	O genoma dos eucariotos pode apresentam os pseudogenes que são replicas de genes ativos mas não produzem um produto reconhecível, geralmente ocorrem devido a mutações acumuladas no gene. 
	Transposons são elementos genéticos móveis que se deslocam de uma região para outra do genoma e, enzimaticamente, se integram a estes locais. Desta forma, a localização destes segmentos de DNA no genoma é instável. Estes transposons contém os genes que codificam para as enzimas necessárias à sua inserção e para remobilização para outro sítio. Geralmente, a inserção de um transposon produz mutação ou rearranjo cromossômico variável que abole a função do gene que recebe esse elemento móvel. 
	Polimorfismo de DNA
	A análise do DNA humano progrediu na medida em que se conheceu a variabilidade de sequências entre os indivíduos. Mini e microsatélites são sequências curtas, repetidas consecutivamente, que estão distribuidas ao longo dos cromossomas humanos, representando cerca de 40% do DNA. Sua natureza repetitiva faz com que sejam instáveis durante a replicação do DNA de geração para geração. A consequência é que o número de repetições dentro de uma sequência varia largamente entre os indivíduos. Em função dessa variabilidade (polimorfismo de DNA), cada indivíduo, exceto gêmeos idênticos, terá um padrão ou perfil de DNA pessoal (“Fingerprinting”). Esses perfis são usados para estabelecer a identidade dos indivíduos em diversas situações. 
	As sequências de microsatélites mais comuns no DNA humano são CA ou GT, dependendode qual das fitas de DNA está sendo lida, pois há milhares dessas sequências espalhadas no DNA humano. O tamanho da repetição pode ser muito variável e pode fornecer excelentes marcadores genéticos para estudar o comportamento fenotípido das famílias. A maioria dessas sequências repetitivas não produz efeito deletério, entretanto foi demonstrado que uma forma de retardo mental em homens, a síndrome do X frágil, é causada pela expansão de um triplete (CGG) contendo 6 a 54 repetições. Verificou-se também que disturbios neurológicos na distrofia miotônica e na doença de Huntington, estão associados a alterações no tamanho dos microsatétiles. Esta descoberta forneceu a base científica para o fenômeno de antecipação no qual os disturbios genéticos tornam-se mais severos nas gerações subsequentes. 
IMPORTÂNCIA DAS ENZIMAS NA BIOLOGIA MOLECULAR
Muitas enzimas que atuam na replicação e transcrição tem sido purificadas e a sua atividade biológica usada in vitro para reações moleculares específicas diretas. A maioria dessas enzimas é isolada de bactérias, fungos, leveduras ou virus. Essas enzimas são utilizadas das mais diversas formas, a saber: clonagem e amplificação de genes de interesse, preparo de sondas de ácidos nucleicos, ensaios de hibridização, entre outras aplicações.
As nucleases representam uma categoria de enzimas específicas de ácidos nucleicos que hidrolizam as ligações fosfo-diester dos polímeros de ácidos nucleicos, uma de cada vez. As nucleases podem requerer um grupamento hidroxil terminal livre (exonucleases), com especificidade de 3' para 5', ou podem atuar somente em ligações internas (endonucleases). As nucleases podem ser específicas para DNA ou RNA. As nucleases DNA-específicas podem catalizar apenas cadeias únicas (por exemplo, a S1 nuclease) ou cadeias duplas (DNAse I). 
As endonucleases de restrição são nucleases encontradas naturalmente em bactérias e são denominadas enzimas de restrição porque restringem sua atividade a DNA estranhos. O DNA do hospedeiro não é atacado porque os sítios vulneráveis a suas próprias enzimas são protegidos por um processo denominado metilação do DNA. Cada enzima é designada de acordo com o organismo do qual é derivada. A EcoRI, por exemplo, é uma enzima obtida de Escherichia coli cepa R e foi a primeira enzima desse tipo isolada. A maioria das enzimas de restrição reconhecem sequências de 4, 5 ou 6 nucletídeos. Muito poucas reconhecem sequências maiores. Algumas são denominadas isosquisomeros, por clivar em diferentes sítios dentro de uma mesma sequência (Ex. XmaI e SmaI) e por clivar o mesmo sítio mesmo sendo obtidas de diferentes microorganismos (Ex. HindIII e HsuI). Outras enzimas reconhecem diferentes sequências com o mesmo sítio interno (Ex. BamHI e Sau3A). Para cada região da molécula de DNA onde a sequência específica ocorre, a enzima de restrição corta ambas as cadeias de forma reprodutível, formando extremidades assimétricas ou coesivas (“stick-end”) ou simétricas ou cegas (“blunted-end”). Estas enzimas são utilissímas para cortar duplas fitas de grande tamanho em fragmentos reprodutíveis e para preparar DNA de diferentes fontes utilizado em procedimentos de clonagem.
As Ligases, como a DNA-ligase usada durante a replicação, catalizam a formação de ligações fosfo-diester entre dois segmentos de ácidos nucleicos. As DNA ligases requerem a presença de um molde complementar, no entanto, as RNA ligases não tem essa exigência para o processamento do mRNA.
As Polimerases catalizam a síntese do polímero de ácido nucleico complementar usando uma cadeia precursora como molde. Essas enzimas são fundamentais para a clonagem e ampificação de genes. A Taq DNA polimerase, por exemplo, é uma enzima extremamente útil para a amplificação do DNA in vitro pela reação de polimerização em cadeia (PCR). 
A transcriptase reversa, presente apenas nos retrovírus, cataliza a síntese de DNA a partir de moldes de RNA ou DNA. Essa enzima tem importante função no ciclo vital dos vírus, mas pode ser usada in vitro para procedimentos de clonagem e para o preparo de sondas de DNA a partir de mRNA. A transcrição reversa constitui-se um método útil para produzir uma copia complementar de um gene (denominado cDNA) a partir do mRNA. Dessa forma, o genoma dos retrovirus pode ser identificado em amostras biológicas utilizando esse método..
Enzimas de restrição e suas aplicações
	Tecnologia de DNA recombinante
	Como vimos, as endonucleases de restrição são enzimas que clivam a molécula de DNA em sítios sequência-específicos. A especificidade de cada enzima proporcionou o desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante. Isto significa que fragmentos de DNA de tamanho reprodutível podem ser produzidos e esses fragmentos contendo um gene particular, por exemplo, podem ser removidos do restante da molécula de DNA e ser inseridos em um DNA carreador, produzindo moléculas de DNA recombinado biologicamente funcionais. Nos primeiros experimentos de recombinação foram utilizados os vetores plasmidiais para carrear fragmentos de DNA estranhos. Plasmideos são pequenos pedaços de DNA circular extra-cromossômicos que ocorrem naturalmente no citoplasma das bactérias e se replicam independentemente do DNA bacteriano hospedeiro. Utilizando uma endonuclease particular, o plasmídeo pode ser aberto e um fragmento de DNA estranho pode ser inserido, por ação de uma DNA ligase, produzindo um plasmídeo recombinate. Os plasmídeos fornecem veículos úteis para carregar fragmentos de DNA ou genes e, quando transfectados em bactérias (usualmente Escherichia coli), podem produzir clones que ao serem replicados in vivo, produzirão cópias múltiplas do fragmento de DNA incorporado. 
	Identificação de genes
	O DNA extraído de um fragmento de tecido, de leucócitos ou de células do líquido amniótico, contém milhares de genes, embora em algumas células muitos destes genes estejam desligados ou reprimidos e somente relativamente poucos estejam ativos. A identificação de um gene ou sequência nucleotídica especifica em todo esse DNA pode ser realizada através do método de Southern blot (E.M. Southern, 1975). Nesse método, as enzimas de restrição são utilizadas para fragmenttar o DNA e os fragmentos resultantes são separados por eletroforese e identificados por hibridização de ácidos nucleicos, utilizando uma sequência de nucleotídeos específica (sonda genética) que é capaz de reconhecer o gene de interesse.
	Polimorfismo de restrição
	Em muitas doenças, o defeito genético é desconhecido e a produção de sondas gene-específicas é muito difícil ou não é possível. Entretanto, o gene produtor da doença pode estar muito proximo (ligado) a um sítio de reconhecimento de uma enzima de restrição particular. Sabe-se que variações nas sequências de DNA ocorrem aleatoriamente através do genoma inteiro e não estão associados a uma doença específica. Estas variações (alterações de bases) resultam na perda de um sítio de restrição existente ou de aquisição de um novo sitio. Tais alterações nas sequências de DNA significam que os fragmentos, produzidos por uma enzima de restrição particular, terão diferentes comprimentos entre diferentes indivíduos e podem ser reconhecidos por suas mobilidades em eletroforese. Eles são denominados polimorfismos de tamanho de fragmento de restrição (RFLP) e são herdados como características genéticas simples obedecendo as leis mendelianas de herança. Se for demonstrado, em estudos de famílias, que um gene produtor de doença está ligado a um RFLP, este pode, então, fornecer um meio de detectar o gene defeituoso sem efetivamente conhece-lo.
Literatura recomendada
Emery, A.E. An Introduction to Recombinant DNA in Medicine, 2a. Ed., 1995, A.E.H Emery & S. Malcon, eds., Johon Wiley & Sons Ltda, Chichester, England, 206 pág.
Lewin, B. Genes V., B. Lewin, ed., 1994, Oxford University Press, New York, USA, 1272 pág.
Strachan, T. Human molecular Genetics. T. Strachan & A.P.Read, eds., 1996, Bios Scientific PublicationsLtd., Oxford, UK, 596 pág.
Watson, J. Recombinant DNA, 2a. Ed., J. Watson, M. Gilman, J. Witkowrk, M. Zoller, 1992, Scientific American Inc., New York, USA, 626 pág.�
Aula número 2
Extração de DNA genômico
Profa.Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata
Marcos de Oliveira Machado
Introdução
	O potencial de aplicações das técnicas de DNA recombinante em laboratórios de Bioquímica Clínica estão se tornando altamente evidentes, especialmente para a análise do diagnóstico das várias doenças genéticas e de outras mais. Correntemente, as análises de DNA para o diagnóstico estão disponíveis somente para algumas desordens genéticas, mas o campo de estudo está rapidamente se expandindo e novas análises estão sendo desenvolvidas. A maioria dos testes de DNA para o diagnóstico envolve a extração de DNA dos leucócitos humanos. Tradicionalmente essas técnicas de extração consomem muito tempo e possuem procedimentos pouco eficientes. A maioria dos métodos populares para esse fim, envolve digestão com proteinase K, que leva aproximadamente dois dias, e requer um grande volume de sangue (10-15 ml), ou utilizam solventes orgânicos como o fenol, clorofórmio e álcool isoamílico, os quais são altamente tóxicos. Embora esses métodos consigam recuperar o DNA de alto peso molecular de uma grande variedade de amostras, eles requerem muitos passos e podem incluir a transferência dos extratos de DNA para recipientes adicionais ou procedimentos de lavagem do material utilizando vários filtros comerciais ou colunas. Estes passos adicionais permitem o aumento das oportunidades de transferência cruzadas de amostras ou a introdução de contaminantes. Tais técnicas não são bem apropriadas para o uso na rotina dos laboratórios clínicos. Portanto, um método simples, rápido e econômico é necessário para a introdução das análises de DNA nos laboratórios de Bioquímica Clínica.
	Os estudos de ligação genética utilizando a técnica de polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP), a reação em cadeia da polimerase (PCR), a técnica de transferência de DNA (“”Southern blot””), e outras, necessitam que o DNA extraído esteja em boas condições de uso; ou esteja livre de contaminantes e interferentes que possam prejudicar a reação.
	O uso da técnica de precipitação salina para a extração de DNA utilizando como detergente o Triton X-100, evita o uso dos perigosos solventes orgânicos e o alto custo e demorada digestão da proteinase K. Esta técnica envolve a desidratação e precipitação das proteínas celulares com solução de cloreto de sódio concentrada. O DNA extraído fica livre de RNA, de proteínas e da degradação de enzimas. A quantidade e a qualidade do DNA extraído é muito boa comparada com as outras técnicas de extração. O DNA é apropiado para as técnicas de biologia molecular, como as que utilizam o PCR e a digestão com enzimas de restrição.
Preparação e análise de ácidos nucleicos
	Os métodos de isolamento e purificação dos ácidos nucleicos consistem de três etapas: (1) lise das células e solubilização do DNA ou RNA; (2) médodo enzimático ou químico para remover as proteínas contaminantes e outras macromoléculas; e (3) precipitação alcoólica para isolamento do DNA. Os protocolos básicos geralmente são aplicáveis a um ampla variedade de materiais. 
1. Isolamento de DNA genômico de tecidos e células:
	O método básico compreende a ruptura do tecido com um homogeinizador, a lise celular com o detergente iônico SDS, extração fenólica das proteinas e precipitação etanólica do DNA. Este método é útil para preparação de DNA genômico de muitas amostras de tecido ou de linhagens celulares, com um mínimo de consumo de tempo e trabalho. O DNA genômico produzido é adequado para amplificação por PCR ou para a disgestão com enzimas de restrição e análise de transferência de DNA. Uma quantidade substancial de RNA acompanha o DNA genômico, o que dificulta a quantificação por espectroscopia no UV. Algumas amostras de DNA não amplificam bem por PCR ou não são completamente digeridas com enzimas de restricão e devem, portanto, ser reextraidas. 
	Outro método compreende a solubilização dos tecidos ou células com SDS, que inativa as DNAses endógenas. A proteinase K é usada para digerir as proteinas celulares, seguida de digestão com Rnase para remover a maioria do RNA celular. O isolamento do DNA segue basicamente o princípio anterior. Este método é adequado para extrair DNA genômico para análise de DNA por Southern blot ou construção de bibliotecas genômicas. Porém não é adequado para extrair DNA de tecidos pois não há etapa de ruptura do tecido conectivo..
	O protocolo mais adequado à rotina laboratorial para avaliação de polimorfismos e mutações genéticas compreende a lise celular com SDS, remoção das proteinas por precipitação com cloreto de sódio concentrado (“salting-out”) e isolamento do DNA genômico por precipitação etanólica.
2. Isolamento de RNA de células ou de amostras biológicas
	A maioria dos procedimentos de purificação e concentração de RNA são semelhantes aos utilizados na purificação de DNA, exceto que 2,5 volumes de etanol devem ser usados rotineiramente para precipitação do RNA. É essencial que toda água usada diretamente ou nos tampões seja tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) para inativar as RNases.
	O método mais adequado para preparar RNA de boa qualidade envolve a solubilização simultanea do tecido ou células e inativação de Rnases endógenas na presença de isotiocianato de guanidina, com subsequente separação do RNA do DNA e das proteínas por ultracentrifugação em gradiente de cloreto de césio. Dois outros métodos que não requerem ultracentrifugação podem se utilizados: (1) lise com detergente não-iônico para proporcionar um método rápido para preparação de amostras de RNA citoplasmático e (2) lise celular com isotiocianato de guanidina, remoção das proteinas pela extração fenólica em pH ácido, seguida de precipitação do RNA. O segundo método é frequentemente utilizado para isolamento de genoma dos virus RNA a partir de amostras biológicas 
	Outros métodos de isolamento e identificação do RNA podem ser : (1) isolamento do mRNA por cromatografia com oligo-dT celulose; (2) separação eletroforética do RNA em gel de agarose contendo formaldeido para detecção e quantificação de espécies específicas de RNA por Northern blotting e hibridização; entre outros. 
3. Isolamento de DNA genômico de bactérias
	As bactérias de uma cultura líquida saturada são lisadas e as proteinas removidas por digestão com proteinase K. Os debris de parede celular, polissacarídeos e as proteinas remanescentes são removidas pela extração fenólica e o DNA genômico é recuperado do sobrenadante resultante pela precipitaçao com etanol.
Purificação e concentração de DNA de soluções aquosas
	Os procedimentos de isolamento de dsDNA e ssDNA a partir soluções aquosas são úteis quando proteinas ou solutos necessitam ser removidos, ou quando soluções de DNA necessitam ser concentradas. O protocolo básico é apropriado para purificação de DNA a 1 mg/mL a partir de volumes menores que 0,4 ml.
1. Extração fenólica e precipitação etanólica
	Um dos métodos mais úteis e usados para isolamento e concentração de ácidos nucleicos de soluções aquosas é a extração com fenol/clorofórmio seguida de precipitação com etanol. Durante a extração orgânica, as proteinas contaminantes são denaturadas e mantidas na fase orgânica ou na interface entre as fases orgânica e aquosa, enquanto que os ácidos nucleicos permanecem na fase aquosa. O fenol usado nesse protocolo deve ser tamponado para prevenir que os produtos oxidados presentes no fenol danifiquem os ácidos nucleicos. Alcool amílico frequentemente é adicionado à mistura fenol/clorofórmio quando ocorre a formação excessiva de espuma durante a extração. 
	Durante a precipitação com etanol, os sais e outros solutos como os resíduos da extração fenol/clorofórmio permanecem em solução enquanto os ácidos nucleicos formamum precipitado que pode ser facilmente separado por centrifugação. Na presença de altas concentrações de cátions monovalentes (0,1 a 0,5 M), o etanol induz uma transição estrutural nas moléculas de ácido nucleico promovendo a agregação e precipitação das mesmas. Entretanto, como vários sais e pequenas moléculas orgânicas são solúveis em etanol a 70%, a precipitação etanólica e lavagem do sedimento elimina os sais no DNA. Embora cloreto de sódio, acetado de sódio, e acetato de amonio sejam capazes de induzir a precipitação, é mais difícil remover cloreto de sódio devido a sua baixa solubilidade em etanol a 70%. O sal recomentado para a maioria das aplicações de rotina deste método é o acetato de sódio a 0,3 M (concentração final), que é mais solúvel em etanol que cloreto de sódio a 0,3 M e, portanto, menos facilmente precipitável com a amostra de ácido nucleico. Para amostras contendo dodecil sulfato de sódio (SDS), o sal recomendado é cloreto de sódio 0.2 M, pois o SDS é solúvel em etanol nessas condições.
	Soluções de DNA diluídas: quando soluções de DNA estão diluidas (< 10 g/mL) ou quando menos que 1 g de DNA está presente, deve-se aumentar a proporção de etanol para o volume aquoso (3:1) e aumentar o tempo de precipitação (4 a 16 horas), incubando-se a -20oC (ou em gelo seco). A centrifugação para separação do DNA precipitado deve ser feita a baixa temperatura para assegurar o máximo de recuperação do DNA dessas soluções.
	Pequenas quantidades de DNA (nanogramas): pode-se utilizar um ácido nucleico carreador, como o tRNA de E. coli, levedura ou fígado bovino, em concentrações de 10 g/mL. Nessa condição o DNA é coprecipitado com o tRNA. O tRNA não interfere com a maioria das reações enzimáticas, mas será eficientemente fosforilado pela T4 polinucleotídeo quinase e não poderá ser usado se esta enzima for usada em marcações subsequentes. Recuperação de pequenas quantidades de fragmentos curtos de DNA e oligonucleotídeos pode ser aumentada pela adição de cloreto de magnésio a uma concentração inferior a 10 mM antes da adição do etanol. Entretanto, o DNA precipitado de soluções mais concentradas que 10 mM de íons magnésio ou fosfato são dificeis de dissolver e devem ser dulidas antes da precipitação com etanol. Se a amostra de DNA está em baixa concentração em um grande volume, o volume pode ser reduzido pela extração repetida com sec-butanol (2-butanol). Cabe lembrar que apenas a água é removida com essa extração, todos os solutos e sais são concentrados com os ácidos nucleicos. Após essa etapa, o ácido nucleico deve ser extraido com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. 
	DNA em grandes volumes aquosos: a extração pode ser simplesmente ampliada usando o mesmo procedimento. (tubos de poliestireno não resistem a mistura fenol/clorofórmio). As etapas de centrifugação à temperatura ambiente não podem exceder velocidades de 2500 rpm (1200 x g), pro 5 minutos. O precipitado etanólico deve ser centrifugado em um tubo Corning de parede reforçada por 15 minutos em fotor de angulo fixo a 10.000 rpm (8000 x g), a 4oC. Tubos de vidro devem ser siliconizados para facilitar a recuperação de pequenas quantidades de DNA (< 10g). 
	Remoção de oligonucleotídeos e trifosfatos: Pequenos oligonucleotídeos (< 30 bp) e nucleotídeos não incorporados usados na marcação ou outras reações de modificação do DNA podem ser efetivamente removidos das soluções contendo DNA por duas etapas de precipitação com etanol na presença de acetato de amonia. Este procedimento não é suficiente para remover completamente grandes quantidades de ligadores (“linkers”) utilizados nos procedimentos de clonagem. Acetato de amonia não é recomendável se a amostra de ácido nucleico for fosforilada na extremidade 5’ pela T4 quinase ou na extremidade 3’ com a transferase terminal, pois os íons de amonio tesiduais inibem essas duas enzimas.
	Variações do procedimento de precipitação: O isopropanol pode substituir o etanol, quando se deseja manter mínimo o volume dos ácidos nucleicos precipitados. O isopropanol é menos volátil que o etanol e é, portanto, mais difícil de remover por evaporação. Alguns sais são menos solúveis em isopropanol, e podem ser precipitados com os ácidos nucleicos. É recomendado que a precipitação com isopropanol seja seguida imediatamente por uma precipitação onvencional com etanol para eliminar isopopropanol residual e o sal. Alternativamente, cloreto de lítio pode ser usado como o sal de precipitação, pois o cloreto de lítio é muito mais solúvel no etanol e o precipitado resultante é relativamente isento de sal. Cloreto de lítio deve ser evitado, entretanto, se o precipitado de RNA for usado como molde para a transcrição reversa após precipitação.
	Grandes mRNA e rRNA podem ser purificados de dsDNS e pequenos RNAs (tRNA e 5S RNA) por duas etapas de precipitação seletiva com cloreto de lítio na ausencia de alcool, seguida de uma precipitação convencional com etanol. 
	Soluções concentradas de ácidos nucleicos: se a concentração de ácidos nucleicos é muito alta ( > 300 g/mL), um precipitado pode-se formar sem resfriamento durante a precipitação etanólica. Se um precipitado visível é formado, não é necessário esfriar a amostra ou aguardar algum tempo antes de separar o precipitado por centrifugação.
2. Fracionamento dos ácidos nucleicos
	Geralmente todos os protocolo em biologia molecular requerem, em alguma etapa, o fracionamento dos ácidos nculeicos. Técnicas cromatográficas são apropriadas para algumas aplicações e podem ser usados para separação dos plasmídeos do DNA genômico, bem como separação de DNA genômico dos debris no lisado celular. A eletroforese, entretanto, tem muito mais resolução que métodos alternativos e é geralmente o método de fracionamento de escolha. As separações eletroforéticas podem ser analíticas ou preparativas e podem envolver fragmentos com peso moleuclar variando de menos que 100 Da a mais que 108 Da. Uma variedade de sistemas eletroforéticos foram desenvolvidos para acomodar essa ampla faixa de variação. Além disso, um fragmento individual pode ser identificado por tecnica de hibridização após a separaração eletroforética de uma mistura complexa (Southern blot). Este método tem contribuido grandemente para ao mapeamento e identificação de sequencias de cópia única ou múltipla em genomas complexos, e facilitado os experimentos iniciais de clonagem de DNA eucarioto.
3. Purificação e isolamento de DNA
	Os protocolos utilizados para purificação de DNA são geralmente divididos em três categorias: (1) eluição do DNA de um gel de agarose por diálise, (2) dissolução do gel de agarose e recuperação do DNA por ligação a partículas de vidro, e (3) eluição pelo aquecimento da agarose de baixo ponto de fusão a 70oC, e recuperação do DNA pela extração fenólica e precipitação etanólica ou usando uma matrix que liga especificamente o fragmento de DNA. Atualmente, há vários sistemas de purificação de fragmentos de DNA no mercado. Esses sistemas diferem no tamanho e o tipo de ácido nucleico que pode ser eficientemente isolado; nos efeitos dos sais, dos solventes orgânicos e de outras substâncias na eficiência de ligação da matriz; e no tipo de solvente que é usado para eluir o oligonucletídeo ou o polinucleotídeo da matriz. 
	Matriz de sílica (vidro) - na presença de iodeto de sódio, DNA e RNA ligam-se seletivamente à matriz de sílica. Outras substâncias presentes (sais, solventes, nucleotídeos, proteinas, nucleotídeos etc) são lavados com uma solução de etanol tamponada. O polinucleotídeo ligado é eluido em um reduzido volume de tampão Tris-EDTA (TE) ou água. 
	Resina de purificação - é uma resina de purificação com propriedades similares aos sistemas de matriz de sílica (Magic1, Promega). Esta matriz liga polinucleotídeos de dupla fita mais eficientemente que os de fita simples, e pouco eficientemente os RNAs pequenos (tRNA), DNA de dupla fita de menos que 220 bp ou oligonucleotídeos. 
	Adsorção - é um sistema de purificação de ácidos nucleicos,que contém um adsorvente estável (NENSORB 20, DuPont-NEN) que liga quantitativamente proteinas, RNA e DNA, incluindo oligonucleotídeos contendo menos que 12 resíduos. A ligação não é afetada por altas concentações de sais, ureia, ou outras substâncias, mas inibida por alguns solventes orgânicos. O material não ligado é removido com água e o DNA ou RNA (mas não proteinas) é quantitativamente eluido com um solvente alcoólico. 
	Gel filtração - os ácidos nucleicos podem ser purificados, separados e fracionados usando colunas de gel filtração ou colunas de centrifugação (spin columns). 
Quantificação dos ácidos nucleicos
	A concentração de DNA ou RNA pode ser estimada por espectrofotometria de absorção no UV ou a concentração de DNA pode ser realizada por espectroscopia de fluorescencia. Cubetas de quartzo devem ser utilizadas para a espectrofotometria no UV, enquanto que as de plástico ou vidro podem ser usadas para a região do visível. Um método alternativo é o método de placa de brometo de etídio agarose. . 
Literatura recomendada
Davis, L.G. Basic Methods in Molecular Biology. 2a. Ed., L.G. Davis, W. M. Kuehl, J.F. Battey, Eds. 1994, Appleton & Lange, Norwalk, CN, USA, 777 p. 	
Ausubel, F.M. Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., F.M. Ausubel, Ed.; Green Publising Associates and John Wiley & Sons, 1992, New York, NY.
Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratorial manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniats, 3 volumes, 2nd ed., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY.�
Aula número 3
Princípios de Eletroforese
Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata
Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata
Introdução
	Eletroforese é uma técnica de separação que envolve o movimento de partículas com cargas em solução, sob ação de um campo elétrico. Portanto, qualquer partícula ou molécula carregada pode se mover nessas condições, e consequentemente podem ser separadas, desde que tenham diferentes cargas.
A separação eletroforética das partículas pode ser realizada em meio líquido(eletroforese livre de Tisellius) ou em um suporte inerte.
	A carga eletrica aplicada sob a solução é realizada através de eletrodos que são colocadas na solução. Um ion migra através da solução na direção ao eletrodo de carga oposta. Portanto, uma partícula carregada positivamente(catiosn) migra para o polo negativo (catodo), enquanto as partículas negativas(anions) migram para o polo positivo(anodo).
Princípios básicos da eletroforese
Terminologia:
ânion: partícula carregada negativamente ou íon
cátion: partícula carregada positivamente
tampão: Uma mistura de substâncias que doam e aceitam proton com a função de manter a concentração do proton (pH) constante ou dentro de um valor próximo. Um tampão pode ser feito com uma mistura de um ácido fraco com o respectivo sal. Ex: ácido acético e acetato de sódio.
Condutividade: a propriedade de uma substância conduzir a corrente elétrica. Numa solução iônica, a soma do produto da concentração da carga e a mobilidade da mesma.
eletrodos: substâncias em contato com um condutor. A substância estão conectadas a fonte elétrica.
Fonte elétrica: Equipamento que transforma corrente alternada em corrente contínua, que possa ser controlada por um potenciometro, que permite variar a tensão, a corrente, a carga elétrica que se quer aplicar no sistema. Esse equipamento, pode medir a tensão elétrica (em Volts), a corrente elétrica(Amperagem), e a potência elétrica (Watts).
eletro-osmose; tendência da solução se mover em relação a uma substâncias estacionária adjacente, quando uma diferença de potencial é aplicada.
força iônica: É a soma da concentração de todos ions na solução, medido pelo quadrado de suas cargas.
mobilidade: a velocidade de uma partícula ou ion que é dado pela voltagem aplicada. Uma medida relativa de quanto rápido um ions se movimenta em um campo elétrico.
Mobilidade efetiva: A real mobilidade de uma substância sob certas condições. Geralmente é menor que a mobilidade devido a menor carga, ou resistência do suporte ou meio.
poder de resolução: E’ a habilidade de separar substâncias que migram muito próximas.
gel: É uma malha de fibras, ou de polímeros que é sólida, mas retém uma grande quantidade de solventes nos poros ou nos canais internos das malhas.
Fatores que influenciam na separação e mobilidade
 eletroforética
	A aplicação de um campo elétrico a uma solução que contém partículas carregadas pode separá-los. A separação depende de vários fatores que influenciam e que podem ser resumidas em: Força aplicada nas partículas (voltagem), carga da partícula, pH do meio, condutividade do meio, resistência da matrix, conformação da partícula, força iônica do meio, temperatura, eletroendosmose, etc
1. Força na partícula
	 A força exercida em uma partícula carregada depende do campo elétrico, voltagem ou volts por centímetro, e a carga da partícula, Q. A força sob a partícula carregada é o produto: 
Feletrica=QV
	A força elétrica, Feletrica, quando exercida na partícula, causará o seu movimento. No entanto, o movimento da partícula no solvente será também influenciado pela resistência, devido a viscosidade, a resistência, a qual exerce uma força é proporcional a velocidade:
Fresistência= fv
	A constante de proporcionalidade, f é chamada de coeficiente de fricção (medida de resistência de uma partícula oferece quando em movimento em um solvente).
2. Coeficiente de fricção depende da viscosidade do solvente e do tamanho, e forma da partícula	Quanto maior a viscosidade, menor o movimento. Quanto maior ou mais assimétrica a partícula, menor seu movimento através do solvente. O coeficiente de fricção de uma grande partícula tais como proteinas é uma propriedade característica de cada elemento.
3. Mobilidade da partícula
	Quando um campo elétrico é aplicado em uma partícula carregada, ela inicia a migração. A força eletroforética e a fricçional se opõe uma a outra, e a velocidade dessa aumenta até as forças se igualarem (Feletrico = Fresistencia ). A velocidade, v, que uma particula alcança em um campo elétrico, V, é determinado por duas propriedades das partículas - sua carga e seu coeficiente de fricção. Consequentemente, o valor de v/V é também uma propriedade característica das partículas e é importante o suficiente para receber o seu próprio nome: mobilidade.
4. Efeito do pH do meio
	Cada íon possui sua carga e mobilidade muito particular. No entanto, quando a solução contém uma substância a qual o pK é próximo do pH do meio, esta substância ocorre em ambas as formas: a carregada e a não carregada.
	A fração com uma carga será dependente do pK da substância e o pH da solução. Quando o pH é igual ao pK de um ácido fraco, somente 50% das partículas estarão carregadas. Uma unidade de pH abaixo da pKa, 90% das partículas estarão sob a forma carregada. Desde que a carga efetiva de uma substância varia com o pH, a sua mobilidade efetiva também varia com o pH.
	O pH da solução é escolhido de tal forma, que a partícula a ser separada pela eletroforese, se mantenha em um estado máximo de carga, para sua máxima separação. Os tampões são substâncias iônicas por si, portanto, exercem a função de manterem o pH o mais próximo possível da ideal e fazem parte do processo.
5. Condutividade e movimento dos íons
	Em qualquer sistema elétrico, a corrente produzida é proporcional a voltagem aplicada;
V = resistência X Corrente
ou
V = corrente___
condutividade
	Na eletroforese, a corrente é um fluxo de íons(em ambas direções). A condutividade é a soma das concentrações multiplicado pela mobilidade efetiva de todos os ions presentes. Um íon com maior mobilidade efetiva carreia uma maior fração da corrente
	A voltagem, condutividade, e a corrente portanto estão todos relacionados. Se a condutividade está aumentada pelo aumento da concentração salina a corrente se mantém constante,a voltagem deve decrescer. Se decresce a voltagem reduz a força elétrica, Feletrica, nas partículas carregadas, diminuindo o movimento das macromoléculas. O aumento do tempo seria necessário para uma separação, e a resolução diminui devido ao aumento da difusão. Se a condutividade está aumentada numa voltagem fixa, a corrente deve aumentar, portanto aumentando o calor elétrico gerado pelo sistema, desde que o aquecimento é proporcional ao quadrado da corrente. O excesso do aquecimento produz distúrbios convectivo nas soluções, a qual distorce o padrão eletroforético e pode também desnaturar as macromoléculas. Desde que o aumento da condutividade mesmo em voltagem fixa ou corrente tenha efeito deletério, resultados ótimos podem ocorrer quando se conserva a concentração dos ions e portanto a condutividade em valores moderados.
6. Carga e conformação
	Como já se discutiu, o que determina a migração eletroforética é a carga da partícula que se quer separar. Muitas vezes, a distribuição das cargas não estão desvinculadas a sua conformação estérica, portanto, pode-se alterar a carga de uma partícula dependendo de sua conformação, principalmente em se tratando de macromoléculas. As macromoléculas, em seu estado relaxado, tendem a apresentar alguns eletrólitos ligados fortemente, portanto levando a uma alteração na sua mobilidade.
7. Atmosfera iônica e o potencial zeta
	Contra-íons, ou íons de carga oposta, naturalmente tendem a circundar próximos a grupos carregados das macromoléculas. No entanto, eles não chegam a neutralizar as cargas das macromolécuals mas, por sua vez estão localizados próximos dos grupos carregados das macromoléculas, formando uma dupla camada de carga em torno dessas, denominadas de atmosfera iônica.
As macromoléculas movem-se com a camada de hidratação e com os contra ions. Esses reduzem a carga efetiva das macromoléculas, a um nível dado pelo potencial zeta. Esse potencial significa a energia produzida pela carga efetiva das macromoléculas na superfície de contato, que é a região limite do complexo macromolecular na solução e o material que o está envolvendo.
8. Suportes 
	A grande meta da eletroforese é a separação de uma mistura heterogênea de substâncias iônicas seja ela macromoléculas ou íons simples, em zonas completamente identificáveis. Os suporte devem permitir a penetração do material a ser separado o máximo possível e ainda delimitar o fluxo de volume (eletroforese convencional). A maioria dos suportes oferecem esse princípio determinando o tamanho do poro para o movimento eletroforético das macromoléculas. O tubo capilar também exerce esse efeito.
9. Eletroendosmose
	O suporte não deve interagir com as moléculas a ser separadas, isso poderia impedir ou inibir a separação. Uma interação comum que pode ocorrer, não é a adsorção usual do material. Mais comumente é o efeito dos grupos carregados que estão ligados ao suporte, que resulta em eletro-endosmose. Como exemplo típico temos o suporte ágar, que é muito utilizado na eletroforese. O ágar é uma mistura de agarose e agaropectina. A agaropectina tem um número relativamente grande de grupos carboxil, que em pH neutro tem contra-íons. Se o campo elétrico for aplicado, os contra-íons irão se mover, mas o grupo carboxil ligados a matrix (agar) não migrarão. Os contra-íons carreia solvente o suficiente para que produza um fluxo significativo nesta direção, esse fenomeno denomina-se de eletro-osmose, que as vezes é denominado de endosmose.
Tipos de suporte
Os tipo de suporte podem variar desde uma solução de sacarose até em substância pouco solúveis como fibras de celulose. Os suportes de meio contínuo mais comuns são: agar, agarose, poliacrilamida e amido.
A porosidade ou a média do tamanho do poro em alguns suportes é fixo. Entretanto, em alguns suportes podem ser controlados. Como exemplo, a mudança da concentração do gel de agarose, agar e amido, pode mudar o tamanho do poro. O tamanho dos poros do gel de poliacrilamida mais utilizados para macromoléculas está em torno de 5% a 10%, que separam proteínas de 15.000 a 250.000 Daltons. Esse tipo de suporte separa tanto pelo tamanho do poro como por carga elétrica.
Tipos de eletroforese.
a. Dependendo da matrix
	Eletroforese livre de Tiselius
	Eletroforese em acetato de celulose
	Eletroforese em gel de agar
	Eletroforese em gel de agarose
	Eletroforese capilar
b. pH de separação
	pH ácido
	pH neutro
	pH alcalino
 Aplicações da eletroforese nas técnicas moleculares
1. Gel de Agarose
	Um dos métodos eletroforéticos mais comuns utilizados na prática diária em biologia molecular é a de gel em agarose. Essa técnica muito simples, rápida, prática e apresenta boa resolução na separação dos fragmentos de DNA, se comparados com outras bem mais demoradas como a separação por ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose.
Uma boa separação eletroforética do DNA utilizando gel de agarose depende de vários fatores:
1.1. Tamanho molecular do DNA.
	As moléculas lineares, dupla fita de DNA migram inversamente proporcional ao log10 do peso molecular através do gel de agarose.
1.2. concentração da agarose.
	O fragmento do DNA migra em diferentes proporção através do gel contendo diferentes concentraçào da agarose. Existe uma relação linear entre a mobilidade logaritimica do DNA e a concentração do gel que é baseada numa equação matemática(Helling e cols , 1974) figura 1.
Log=logo- Kr
	Onde o é a mobilidade eletroforética livre e Kr é o coeficiente de retardamento,  = a constante que é relacionada as propriedades do gel e o tamanho e a forma da molécula em migração.
	Baseada nessa correlação podemos separar várias moléculas de DNA (de variado tamanho) nas diferentes concentrações de agarose.
Porcentagem de agarose
intervalo da efficiência da separação da molécula de DNA em Kb
0,3%
5 a 60
0,6%
1 a 20
0,7%
0,8 a 10
0,9%
0,5 a 7
1,2%
0,4 a 6
1,5%
0,2 a 4
2,0%
0,1 a 3
1.3. Conformação do DNA
	 A forma circular (forma I), forma circular contorcida(forma II) e forma linear (forma III) do DNA com a mesmo peso molecular migra através do gel de agarose em diferentes posições (Thorne, 1966, 1967). A mobilidade relativa das 3 formas são dependentes primariamente da concentração do gel, mas são também influenciados pela corrente aplicada, força iônica do tampão e da densidade superhelicoidal da torção na forma I do DNA (Johnsom and Grossman , 1977). Em algumas condiçoes, a forma I do DNA migra mais rápido que a forma III, em outras condições pode ser de ordem inversa. Um método geral para identificar as diferentes conformações do DNA é utilizar na corrida eletroforética em agarose diferentes concentrações de brometo de etídio(concentração crescente). Quanto mais brometo de etidio mais se liga ao DNA. As torções superhelicoidal negativas da a forma I do DNA vão sendo progressivamente removida e seu índice de migração diminui. Numa concentraçao crítica do corante livre, onde não permanece a forma superhelicoidal, o índice de migração da forma I do DNA esta no seu mínimo valor. Se ainda mais brometo de etídio for adicionado, torções superhelicoidais positivas são gerados e a mobilidade da forma I do DNA aumenta rapidamente. Simultaneamente, as mobilidades das formas II e formas III do DNA são diferentemente diminuidas como consequência da neutralização da carga e da maior tenacidade é dada ao DNA pelo brometo de etídio. Para a maioria das formas I de DNA, a concentração critica do brometo de etídio livre é de 0,1 a 0,5 g/ml
A corre	nte aplicada: A baixa voltagem, a razão da migração dos fragmentos de DNA linear é proporcional a da voltagem aplicada. Entretanto, a medida que a carga elétrica aumenta, a mobilidade dos fragmentos de DNA de alto peso molecular aumenta diferentemente. Dessa maneira o intervalo efetivo da separação do gel de agarose decresce a medida que a voltagem aumenta. Para obtera máxima resolução dos fragmentos de DNA, o gel deve ser submetido a uma corrente de no máximo 5V/cm
Composição das bases e temperatura: O comportamento eletroforético do DNA em gel de agarose não é significantemente afetado pela composição das bases do DNA ou pela temperatura do gel na corrida. Dessa forma, os geis de agarose e a mobilidade eletroforética dos fragmentos de DNA de diferentes tamanhos não muda entre 40C a 300C. Em geral, os geis de agarose são submetidos a corrida em temperatura ambiente. No entanto, em concentrações muito baixas (0,5%) os géis são pouco consistentes, sendo convenientes trabalhar em baixas temperaturas, pois esses géis ganham mais firmeza, da mesma forma os géis de agarose de baixo ponto de fusão(“low melting” agarose).
1.4. Tampões utilizados
	Existem uma variedade de tampões que podem ser utilizados para separação eletroforética de DNA.
Tampões
concentração
formulação
Tris-acetato (TAE)
0,04M Tris acetato
0,01M EDTA
50X 242g tris base
 57,1 ml ácido acético
 100ml EDTA 0,5M(pH8,0)
Tris-fosfato (TPE)
0,08M Tris-fosfato
0,002M EDTA
10X 108 g Tris Base
 15,5ml de ac. fosfórico 85%
 40ml EDTA 0,5M (pH8,0)
Tris-borato (TBE)
0,089M Tris borato
0,089M ac. bórico
0,002M EDTA
5X 54g Tris-base
 27,5g ác. bórico
 20 ml EDTA 0,5M (pH8,0)
1.5. Tipos de Agarose
	Muitos tipos de agarose estão disponíveis, o que se recomenda para uso diário é o tipo II, baixa eletroendosmose. O inconveniente desta agarose é que possue contaminantes de polissacárides sulfatados que inibem enzimas, como ligases, polimerases, e endonucleases. No entanto, a sua utilização é muito difundida, pois o DNA pode ser purificado e ser utilizado com sucesso nas clonagens e como substratos de reações com essas enzimas
1.6. Coloração do DNA em gel agarose
	O método mais conveniente para visualizar o DNA no gel de agarose é a coloração por brometo de etidio, que fluoresce sob luz ultra violeta. Esse composto contém um grupo planar, que intercala entre as bases do DNA. A posição fixa do grupo e sua proximidade às bases causa uma ligação do corante com o DNA, que se destaca com um aumento da fluorescência comparada com o corante em solução sob a forma livre. A radiação UV absorvida pelo DNA a 260 nm é transmitida para o corante, ou a irradiação absorvida a 300 nm e 360 nm pelo corante ligado propriamente dito, é emitido a 590nm na região da cor vermelho alaranjada, do espectro visível.
	O brometo de etídio pode detectar tanto os ácidos nucleicos de simples ou de dupla fita. No entanto, a afinidade do corante pela fita simples é relativamente baixa, e a fluorescência emitida é fraca.
Geralmente o brometo de etídio é incorporado no tampão de corrida e no gel a 0,5ug/ml. Nesse caso devemos considerar que a mobilidade linear das fitas duplas está reduzida na presença do corante em aproximadamente 15%. Uma vantagem deste procedimento é a possibilidade de visualizar o gel durante a separação eletroforética, sem a necessidade de remover o gel do suporte e da cuba, simplesmente incidindo a luz UV sob o gel. Mas, se houver necessidade da coloração posterior basta imergir o gel numa solução de brometo de etídio, no próprio tampão de corrida, po r 45 minutos a temperatura ambiente. A descoloração normalmente é dispensada, exceto se houver excesso de corante. Quando a quantidade de DNA é muito reduzida, a pouca fluorescência do brometo de etídio pode interferir na visuallização da banda de DNA. Neste caso recomenda-se imergir o gel em uma solução de sulfato de magnésio a 1mM por uma hora, a temperatura ambiente
1.7. Documentação:
	O gel de agarose é facilmente documentado, utilizando um sistema de fotografia instantânea ou sistema automatizado de captura de imagem. 	O filme mais sensível para essa finalidade é fornecida pela Polaroid, tipo 57 ou 667, asa 3000. Sob a luz UV de no mínimo 2500uW/cm2 e uma boa máquina , utilizando filtro laranja, expõe-se por alguns segundos. Recomenda-se para a máquina Polaroid modelo DS 34 uma abertura de 5,6 ou 8 e uma velocidade de 4 ou 8 segundos, mas pode variar com a intensidade das bandas e do tamanho do gel. Para padronização tente vários tempos de exposição com várias aberturas.
2. Gel de poliacrilamida
O gel de poliacrilamida é um suporte bastante utilizado em biologia molecular para separação e caracterização de fragmentos de tamanho menores de DNA, que se tem dificudade por geis de agarose. Descrito por Raymond & Weintrab em 1959. O produto de polimerização da acrilamida, que é o monômero, com a N.N'metilenobisacrilamida, que realiza a reação de "cross linking" ou reação cruzada, gera o suporte de poliacrilamida. A polimerização ocorre por ligação vinílica, sob ação de catalisadores, o perssulfato de amônia, cuja fonte de radicais livres é o N,N,N'N' tetrametilenodiamina(TEMED). Portanto, o oxigênio é um inibidor da reação. O polímero formado são cadeias lineares de poliacrilamida, cuja reação cruzada entre elas é dada pela bisacrilamida. O comprimento médio das cadeias é determinado pela concentração relativa da acrilamida e a quantidade de bisacrilamida. Portanto a relação entre a quantidade de acrilamida e bisacrilamida determina as propriedades físicas do gel, que darão subsídios para separação nesse tipo de gel.
	O gel de poliacrilamida é utilizado para os fragmentos menores que 1kb. Eles podem ser preparados em uma variada concentração (3,5% a 20%), dependendo do tamanho do fragmento de interesse para a separação e identificação.
Acrilamida (%)
Intervalo de separação (nucleotídeos)
3,5
10-1000
5,0
80-500
8,0
60-400
12,0
40-200
20,0
10-100
	Os géis de poliacrilamida devem ser preparados entre duas placas de vidro, pois necessita de um ambiente isento de oxigêncio para se polimerizar.
	O tamanho do gel pode variar de 10cm de altura por 10cm de largura até 20 a 30cm de largura por 40 a 100 cm de altura dependendo da necessidade do sistema; de espessura normalmente para DNA utiliza-se 0,75 a 1,5 mm.
Literatura recomentada
Kaplan, L.A. & Pesce, A.J. Clinical Chemistry: Theory, Analysis, Correlation, 3a. Ed., J.F. Shanahar & J. Roche, eds., 1996, Mosby-Year Book, Inc., St Louis, USA.
Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratorial manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniats, 3 volumes, 2nd ed., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY.
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Aula número 4
REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM CADEIA (PCR)
Prof. Assoc.Mario Hiroyuki Hirata
Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata
 PRINCÍPIOS DA REAÇÃO de pcr
	A reação de polimerização em cadeia (“Polimerase chain reaction”, PCR) é a técnica que permite a amplificação do DNA ou RNA in vitro, utilizando-se basicamente de uma reação enzimática catalizada pela polimerase (enzima termoestável) cuja atividade depende de ions Mg++, e ocorre em 3 etapas: “Melting”(ou desnaturação que consiste na separação da dupla fita do DNA a ser amplificado), “annealing”( anelamento ou hibridização- ligação do iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado) e “extension”(extensão ou seja a polimerização propriamente dita) Metodologicamente a técnica de PCR requer três passos (SAIKI et al., 1.988): 
Desnaturação - Inicialmente é necessário que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam separadas. A elevação da temperatura entre 90 a 95 ºC promove a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples. Este procedimento é chamado “Desnaturação” ou “melting”, e muitas vezes a temperatura de desnaturação é determinada empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de guanina e citosina (GC) do fragmento DNA alvo ou de interesse. 
Anelamento - A polimerase para assumir suas funções, isto é, anexar as bases complementares, transformando as fitas simples em fitas duplas, necessita de um fragmento de DNA já ligado na região previamente escolhida. A solução, então, é demarcar as extremidades do DNA-procuradoou de interesse nas duas longas fitas simples, tornando-as duplas, apenas nesse intervalo. Para isso adicionam-se, à solução, os “primers” ou iniciadores que são pequenos fragmentos sintéticos de DNA de fita simples, oligonucleotídeos de 20 a 30 bases nitrogenadas de comprimento, que são sintetizados in vitro baseado na sequência do DNA a ser amplificado sendo eles complementares à seqüência do segmento de DNA de interesse. O conhecimento da seqüência procurada é naturalmente pré-requisito para a síntese dos “primers”. Os “primers” perseguem na reação as regiões, as quais foram escolhidas, para hibridizar-se às seqüências complementares nas duas fitas simples (usualmente 5’). Nas duas fitas surgem, assim, um pequeno fragmento de DNA de dupla fita intacta. A hibridização dos “primers” descrito como “Annealing” (do inglês), deve ser feito a uma tempertura inferior à da desnaturação (45 a 60 C).
Extensão - Quando os “primers” encontram e ligam-se aos segmentos complementares, a DNA-Polimerase pode assumir sua função. Inicia-se a partir dos pequenos fragmentos de DNA de fita dupla (resultado do anelamento do “primer”), incorporando um a um os nucleotídeos correspondentes, isto é, as bases juntamente com as moléculas de açúcar e fosfato. A DNA-Polimerase liga os nucleotídeos entre si, completando assim as fitas simples e tornando-as duplas (extensão). A DNA-Polimerase não reconhece apenas o bloco de início como também consegue diferenciar as duas extremidades dos “primers” (3’ e 5’). Ela inicia a reação sempre pela extremidade 3’ do “primer”, completando a fita simples daí em diante, portanto, sempre na direção do fragmento procurado.
	Os fragmentos de DNA recém-formados fornecem mais moldes para a montagem de novas fitas nos ciclos subseqüentes, no entanto, com região já determinada, resumindo, temos uma reação em cadeia. Após cada ciclo, o número de fragmentos se duplica: de um formando-se 2, e então novamente 4, 8, 16, 32, 64, 128... de tal forma que pode ser definida matematicamente por:
				
				N = número de moléculas amplificadas
				No = número de moléculas iniciais
				n = número de ciclos de amplificação
	O modelo teórico considera que a eficiência do processo de amplificação corresponde a 100%, o que não é observado na prática. Experimentalmente, a eficiência da reação está abaixo da ideal e gira entorno de 78% a 97%, dependendo do gene amplificado. Teoricamente após 20 ciclos têm-se cerca de um milhão; após 30 ciclos, cerca de um bilhão de cópias do fragmento de DNA de interesse.
	Automação da PCR
	O procedimento da PCR foi tão aperfeiçoada desde a sua primeira descrição, que na atualidade transcorre de forma totalmente automática. Uma importante condição para isto foi a substituição da DNA-Polimerase originalmente utilizada (extraída de E. coli) por uma DNA-Polimerase termoestável extraída da bactéria Thermus aquaticus (Taq-polimerase). Desta forma, os vários ciclos transcorrem, seguidamente, em um único tubo de ensaio, sem necessidade de interrrupção para a adição de nova DNA-Polimerase ativa. Todos os reagentes necessários (o DNA-template, os “primers”, a DNA-Polimerase, e os dNTPs) são misturados com uma solução tampão que ajusta o pH ótimo da reação. 
	Um aparelho de PCR ou um termociclo repete o correspondente programa de temperaturas. O operador deve apenas programar e dar início para que transcorra a amplificação. Um ciclo dura em média três minutos. Assim, em uma hora, podem ser produzidas cerca de um milhão de cópias e, em menos de duas horas, cerca de um bilhão de cópias da seqüência de DNA de interesse.
O produto amplificado pode alcançar aproximadamente 106 cópias em 30 ciclos e pode ser realizado em 2 horas. 
A PCR é uma ferramenta na biologia molecular tão poderosa quanto a descrição das enzimas de restrição e o Southern blot. Anunciado na Conferência da Sociedade Americana de Genética Humana de 1985, a técnica de PCR tem sido utilizada de forma multidisciplinar com um número crescente de publicações por ano(exemplo de 1985 a 1990 mais de 600). Técnicamente muitas mudanças tem sido introduzidas melhorando cada vez mais e ampliando a sua utilização. No entanto, é preciso salientar que para cada situação experimental, novas modificações têm de ser introduzidas, de tal forma que é muito difícil descrever um único procedimento para um uso generalizado. Por outro lado, é fundamental o conhecimento básico das etapas envolvidas na técnica, para um desenho experimental com sucesso.
	A utilização de PCR é tão ampla que podem ser editados compêndios sobre a metodologia de PCR em cada especialidade diagnóstica. Na aplicação diagnóstica e, particularmente, na Microbiologia a atuação da biologia molecular é muito ampla, apesar de estar ainda no cunho de afirmação e de uso restrito à pesquisa e ao ensino. Porém, muitas doenças infecciosas dependem de um diagnóstico rápido e seguro, que com certeza a única solução está na PCR. A liberação para uso rotineiro no laboratório clínico ainda não é permitido para toda as possíveis aplicações, no entanto, a necessidade de meios mais sensíveis e precisos farão com que a técnica de PCR se torne uma ferramenta impressindível e quase obrigatória no diagnóstico precoce de várias doenças, apesar do custo ainda estar um pouco elevado.
	A técnica de PCR é tão sensível que é capaz de amplificar uma simples molécula de DNA e tal é a sua especificidade, que uma simples cópia de gene pode ser extraida de uma mistura complexa da sequência genômica de forma rotineira e visualizada como uma simples banda no gel de Agarose. Como se pode notar, a sensibilidade e a especificidade que o método pode oferecer é algo singular. A PCR utilizando DNA polimerases termoestáveis foi descrita pela primeira vez por Kary Mullis e patenteada nos EUA sob o n 4.683.195, em julho de 1987 e n 4.683.202.
Saiki e cols, 1985, Mullis e cols,1986, Mullis e Faloona 1987 introduziram as diversas aplicações do PCR para a comunidade científica e atualmente é inesgotável a sua aplicação prática tanto na pesquisa básica como na aplicada.
	Em termos práticos, podemos dizer que um protocolo geral pode ser seguido, mas com a ressalva da necessidade da optimização para cada tipo de aplicação. Os principais problemas citados na literatura para a padronização pode-se assim resumir: Não detecção do produto, baixo rendimento do produto desejado, presença de bandas não específicas devido a “mispriming” ou “misextension” dos “primers”, formação de dímeros dos “primers” que competem pela amplificação com o produto desejado, mutação ou heterogeneicidade devido a erro de incorporação. 
Primer: é um seguimento de DNA ou RNA de 15 a 40 bases, geralmente baseado na sequência já conhecida do ácido nucleico, geralmente sintetizado quimicamente por instrumentos automáticos, que podem ser adquiridos no comércio para fins já definidos ou se escolhe a região desejada do DNA ou RNA a ser amplificada.
Sonda (probe): É um segmento de DNA ou RNA que foi marcado seja com enzimas, substratos antigenicos, substâncias quimioluminescentes ou radioativas, que podem ligar-se com alta especificidade a uma sequência complementar do ácido nucleico alvo (escolhido).
Protocolo geral para PCR
1. A reação pode ser realizada no volume de 100l ou 50l. Escolha o volume a ser usado.
2. Para o volume de 100l, colocar em um tubo de 0,5 ml com tampa com fechamento hermético.
2.1. DNA a ser amplificado 105 a 106 moléculas(“target DNA” ou “Template”)
2.2. 20 pmol de cada “primer” (ou iniciadores,Tm>55C é preferido)
2.3. 20 mM Tris-HCl (pH8,3, 20C)
2.4. MgCl 2 1,5 mM
2.5. Kcl 25 mM
2.6. Tween 20 a 0,05%
2.7. 100g/ml de gelatina autoclavada ou albumina bovina livre de nuclease
2.8. 50 M de cada dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
2.9. 0,2 a 2 unidades de Taq polimerase
3. Pré-incubar (se for DNA genômico) 10 minutos a 94o C
 
4. Programar o termociclo em:
Desnaturação: 96 C (pode variar de 94 a 96C), por 15