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Sistema de Dois Híbridos
Sistema de dois híbridos: O propósito é identificar a interação de proteínas.
	=> Importante para saber a real função de uma proteína ao juntá-la com outras.
Y2H
Utiliza vetores de levedura.
Quimera: híbrido de proteínas.
1- Pegar a sequência codificante da proteína X e colocar em um vetor de expressão em levedura. Pegar a sequência codificante da proteína Y e colocar em outro vetor de expressão em levedura.
2- O vetor quando clonado, irá produzir das quimeras. Azul e laranja (Gal4BD e X); e vermelho e verde (Gal4AD e Y).
3- Deve-se ter um sistema reporter, ou seja, um gene que está sob o controle de uma determinada sequência regulatória. 
	Obs: Os fatores de transcrição orientam o recrutamento do complexo de transcrição para uma determinada região de início da codificação de um gene. (Reconhecem uma região regulatória e recrutam o complexo transcricional).
4- A proteína X é fusionada a um domínio de ligação ao DNA que reconhece exatamente a região regulatória do meu gene (?) [17:50]
5- A sequência em azul (Gal4 BD) reconhece a região regulatória do sistema reporter. A sequência vermelha recruta os fatores de transcrição. 
	Se X interagir com Y, o domínio azul fica próximo ao domínio vermelho e artificialmente forma-se um complexo que funciona como um fator de transcrição. Se X e Y interagirem, o gene reporter é expresso. O gene reporter quando transcrito é o resultado da fusão das duas proteínas.
pACT2
- Vetor que vai receber a biblioteca de expressão, ou seja, o cDNA. 
- Vetor de expressão em levedura.
- Gal4AD: é um gene de ativação transcricional.
- Como fazer a seleção?
	=> O cassete LEU2 (presente no vetor pACT2) codifica uma enzima importante para a síntese de leucina das levedura.
	=> Utiliza-se uma sepa de levedura que é LEU- (ou seja, leucina negativa; tem o gene LEU2 disfuncional) que é engenheirada para fazer a seleção das células que receberam o vetor daquelas que não receberam. 
	=> As leveduras são colocadas em um meio sem leucina, portanto elas tem que sintetizar esse composto para sobreviver. As células que receberem o vetor pACT2 vão conseguir sintetizar, pois por mais que a levedura tenha o gene LEU2 disfuncional, este está presente no vetor, permitindo que a levedura produza a enzima que irá sintetizar leucina. Aquelas que não receberem o vetor irão morrer, pois o gene LEU2 delas mesmas estão disfuncionais.
pGBKT7
- Também é um vetor de expressão em leveduras.
- Vai codificar a síntese de um domínio de ligação ao DNA fusionado ao gene que foi colocado dentro do vetor.
- Neste ensaio estamos clonando a "isca".
- Quando esse vetor é colocado na levedura, esta produz uma proteína de fusão, ou seja um híbrido. (Este híbrido é a sequência de cDNA colocada no vetor [a isca] mais um domínio de ligação ao DNA.
Assim como o pACT2 há um vetor (pB42AD) que possui um cassete para resistência a antibiótico (canalicina), que pode matar a levedura, podendo assim ser usado também como via alternativa de seleção das células que receberam o vetor daquelas que não receberam. Mas o mais importante é a presença de um cassete que codifica o gene TRP1 (gene que codifica uma enzima que irá sintetizar triptofano). A própria levedura também apresenta o gene TRP1 disfuncional, podendo somente produzir triptofano se tiver esse vetor.
Um meio sem leucina e sem triptofano levam a morte da levedura. Para a levedura sobreviver, esta precisa ter necessariamente um clone da biblioteca (que possui o gene TRP1) e outro clone com a sequência "isca" (que possui o gene LEU2). Portanto, deve-se ter 2 vetores dentro da mesma levedura.
Como vou saber que a proteína "isca" codificada (fusionada ao domínio de ligação ao DNA) interage com a proteína codificada pela biblioteca (que ta sendo produzida fusionada com o ativador transcricional)?
	=> Utilizando o vetor pBop-lacZ.
EGY 48: sepa de levedura (HIS3-; TRP1-; URA3-; LEU2 sob controle do operador LexA)
Operado LexA: são sequências (chamadas de operadoras) que regulam o gene LEU2, ou seja, regula a expressão de LEU2. LexA é um fator de transcrição de bactérias! Então a levedura não consegue produzir LEU2.
pLexA: a proteína produzida por esse vetor possui um domínio de ligação ao LexA (reconhece os operadores da sequência de LexA) e a proteína "isca". 
pB42AD: possui a biblioteca fusionada ao domínio de ativação transcricional.
pBop-lacZ: vetor que vai funcionar como um sistema reporter. O LexA presente nesse vetor irá controlar o gene lacZ. Há um segundo reporter genômico, ou seja, que está no próprio DNA genômico da levedura, que é o gene LEU2 que está sob o controle dos mesmos operadores de LexA que o lacZ tem. 
Depois de crescer as leveduras em um meio sem uracila, triptofano e histidina, pegar as colônias que cresceram e colocar em uma outra placa sem os mesmos compostos, porém agora com XGAL e sem Leucina.
	=> Para a levedura sobreviver nesse meio, ela precisa passar a produzir leucina, pois não tem mais no meio. A produção de leucina pela levedura só será possível se for criado um sistema na qual a "isca" interaja com o clone da biblioteca e haja uma aproximação do domínio de ligação ao LexA com o domínio de ativação transcricional, reconstituindo assim o equivalente a um fator de transcrição. 
	=> O gene lacZ também está sob o controle do gene LexA, então a levedura também passa a ser capaz de produzir o fragmento ômega da beta-galactosidase. Com a presença de XGAL, essa enzima irá clivá-lo formando assim um monômero de açúcar e um corante azul.
	=> As colônias azuis significam que a "isca" interage com um cDNA da biblioteca.
	=> Todas as colônias nesse meio sobrevivem no meio SEM leucina. Mas só algumas produzem o lacZ e ficam azuis.
	=> As colônias azuis e brancas se diferem na seguinte questão: interação. Haverão colônias que terão complexos com uma forte interação e colônias que terão complexos com baixa interação. Os de forte interação garantem quem a interação da isca com o clone da biblioteca sejam muito estáveis mantendo o fator de transcrição ativo e estabilizado. Nas interações mais fracas também há essa interação entre a isca e o clone da biblioteca, porém essa ligação é formada e dissociada o tempo todo (complexo instável), levando a levedura a não conseguir codificar ou codificar pouco o gene do lacZ. 
	=> Interação forte: haverá transcrição do gene lacZ e mais o fator de sobrevivência (leucina). Interação fraca: não haverá ou haverá pouca transcrição do gene lacZ, privilegiando o fator de sobrevivência (leucina). Se a levedura prevalecer a transcrição do gene lacZ e não da leucina, ela morre.
Como saber qual é o clone da biblioteca que apresentou essa interação?
	=> Isolar cada colônia em culturas individuais, purificar o DNA plasmidial e sequenciar. Utiliza-se o primer do vetor da biblioteca ta clonada. Depois de sequenciar, identificar qual é essa proteína no banco de dados.