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ESTÉTICA E BELEZA CONTEÚDO ROTINAS LABORATORIAIS Copyright © Portal Educação 2013 – Portal Educação Todos os direitos reservados R: Sete de setembro, 1686 – Centro – CEP: 79002-130 Telematrículas e Teleatendimento: 0800 707 4520 Internacional: +55 (67) 3303-4520 atendimento@portaleducacao.com.br – Campo Grande-MS Endereço Internet: http://www.portaleducacao.com.br Dados Internacionais de Catalogação na Publicação - Brasil Triagem Organização LTDA ME Bibliotecário responsável: Rodrigo Pereira CRB 1/2167 Portal Educação P842r Rotinas laboratoriais / Portal Educação. - Campo Grande: Portal Educação, 2013. 148p. : il. Inclui bibliografia ISBN 978-85-8241-700-3 1. Química - laboratório. 2. Bioquímica – princípios. I. Portal Educação. II. Título. CDD 542.1 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 2 REGRAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO 2.1 SEGURANÇA NO TRABALHO 2.1.1 Risco Físico 2.1.2 Risco Químico 2.1.3 Risco Biológico 2.1.4 Grupos de Riscos Biológicos 2.2 CÓDIGO DE PRÁTICAS 2.2.1 Normas de Acesso 2.2.2 Normas de Proteção Individual 2.2.3 Normas de Procedimento 2.2.4 Controle da Segurança Biológica 3 O LABORATÓRIO CLÍNICO 3.1 INSTALAÇÕES 3.2 EQUIPAMENTOS E MATERIAIS DE LABORATÓRIO 4 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA 4.1 CARBOIDRATOS 4.1.1 Monossacarídeos 4.1.2 Polissacarídeos 4.2 PROTEÍNAS 4.2.1 Aminoácidos 4.2.2 Peptídeos e Proteínas 4.2.3 Enzimas 4.3 LIPÍDIOS 4.3.1 Ácidos Graxos 4.3.2 Triglicerídeos 4.3.3 Fosfolipídios 5 PRINCÍPIOS DE MICROBIOLOGIA 5.1 ESTRUTURAS PROCARIONTES 5.1.1 Membrana Citoplasmática 5.1.2 Parede Celular 5.1.3 Cílios e Flagelos 5.1.4 Material Genético 5.1.5 Componentes citoplasmáticos 5.2 NUTRIÇÃO E METABOLISMO 5.3 CRESCIMENTO MICROBIANO 5.3.1 Ciclo de Crescimento 6 PRINCÍPIOS DE HEMATOLOGIA 6.1 PLASMA 6.2 HEMÁCIAS 6.3 LEUCÓCITOS 6.4 PLAQUETAS 7 PRINCÍPIOS DE IMUNOLOGIA 7.1 IMUNIDADE INATA 7.1.1 Fatores Físicos 7.1.2 Fatores Químicos 7.1.3 Fatores Biológicos 7.2 IMUNIDADE ADQUIRIDA 7.3 ANTICORPOS E ANTÍGENOS 8 INTRODUÇÃO 9 TÉCNICAS DE PIPETAGEM E MICROPIPETAGEM 9.1 PIPETAS 9.2 MICROPIPETAS 9.2.1 Pipetagem Direta 9.2.2 Pipetagem Reversa 10 USO DE CAPELA E CABINES DE SEGURANÇA BIOLÓGICA 10.1 CAPELA 10.2 CABINES DE SEGURANÇA BIOLÓGICA 10.2.1 CBS Classe I 10.2.2 CBS Classe II 10.2.3 CBS Classe III 10.3 TRABALHANDO COM CABINES DE SEGURANÇA BIOLÓGICA 10.3.1 Luz ultravioleta 10.3.2 Limpeza 10.3.3 Cuidados durante operação CBS 10.3.4 Resumo de Utilização de CBS 11 QUALIDADE E AUTOMAÇÃO NO LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS 12 PREPARO DE SOLUÇÕES 12.1 DEFINIÇÕES 12.2 CÁLCULOS 12.2.1 Percentual (%) 12.2.2 Concentração (g/l) 12.2.3 Molaridade (M) 12.2.4 Diluição 12.2.5 Mistura de Soluções 12.3 CUIDADOS NA PREPARAÇÃO DE SOLUÇÕES 12.4 ROTEIRO ILUSTRATIVO 13 PREPARO DE MEIOS DE CULTURA 13.1 CLASSIFICAÇÃO QUANTO AO ESTADO FÍSICO 13.2 CLASSIFICAÇÃO QUANTO A CONSTITUIÇÃO 13.3 CLASSIFICAÇÃO QUANTO A FINALIDADE 13.4 PROCEDIMENTOS GERAIS PARA PREPARO DE MEIO DE CULTURA 13.4.1 Preparação e Distribuição 13.4.2 Controle de Qualidade 14 LAVAGEM E ESTERILIZAÇÃO 14.1 LAVAGEM 14.2 EMBALAGEM 14.3 ESTERILIZAÇÃO 14.3.1 Métodos Físicos 14.3.1.1 Calor Seco 14.3.1.2 Calor Úmido 14.3.1.3 Filtração 14.3.1.4 Radiação 14.3.2 Métodos Químicos 14.3.2.1 Óxido de Etileno 14.3.2.2 Formaldeído 14.3.2.3Composto de amônia 14.3.2.4 Ácido Paracético 15 ORGANIZAÇÃO DO AMBIENTE DE TRABALHO 15.1 FLUXO DE TRABALHO 15.2 EQUIPAMENTOS 15.3 CONTROLE DE ESTOQUE 15.4 REGISTROS REFERÊNCIAS 1 INTRODUÇÃO O trabalho em um laboratório é extremamente prazeroso e traz muito conhecimento aos colaboradores atuantes nesta área. Porém, também existem várias regras e conhecimentos específicos necessários para a realização de um trabalho de qualidade e seguro. Ter comprometimento e perfil para assumir um lugar nesta rotina são os pré-requisitos desta área. O funcionário deve ser detalhista, paciente, saber trabalhar em equipe, ser habilidoso, criativo e interessado em aprender. O trabalho em um laboratório não é como em um escritório, onde se pode parar quando chegar o horário do fim do expediente. As células e microrganismos não esperam. É preciso obedecer ao tempo ‘deles’. Por isso a organização é um dos elementos fundamentais para uma rotina bem- sucedida. Programar os ensaios e atividades é a chave do sucesso para a organização eficiente do tempo. Além disso, como se comportar em um laboratório, quais são os instrumentos disponíveis para o trabalho neste ambiente, os ‘porquês’ e ‘como’ das técnicas usadas nas análises, tudo isso abordaremos aqui neste conteúdo. Com informações importantes para o dia a dia de um analista e com informações teóricas sobre o conteúdo de Rotinas Laboratoriais visa trazer ao aluno conhecimentos da vida prática de um laboratório e introduzi-lo à vida no laboratório. 2 REGRAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO 2.1 SEGURANÇA NO TRABALHO A presença de materiais perfurocortantes, vidrarias que podem se quebrar e causar cortes, soluções químicas, materiais biológicos potencialmente contaminados, além de inúmeros outros fatores presentes em um laboratório podem levar a um acidente de trabalho. Por isso é necessário que haja procedimentos específicos predeterminados e difusão desse conhecimento dentro da equipe técnica para a prevenção de acidentes e manutenção da qualidade do ambiente de trabalho. Para a manutenção da Segurança do Laboratório é preciso avaliar fontes e fatores de risco à saúde do trabalhador e promover condições e procedimentos para minimizar acidentes de trabalho. Vamos inicialmente conhecer os riscos possíveis dentro de um ambiente laboratorial: 2.1.1 Risco Físico São os riscos causados por fontes que gerem danos físicos ao operador, dentre esses podemos citar: Perfurocortantes São provocados por instrumentos ou materiais perfurocortantes, como por exemplo, perfurações com agulhas, lancetas ou cortes com bisturi, tesoura ou vidraria quebrada. Radiações (Luz ultravioleta, infravermelho) Exposição a fontes de radiação. Existem métodos de desinfecção e esterilização que utilizam radiações com luz infravermelho, luz ultravioleta e raio gama. Estas em contato com o operador, sem proteção específica, podem gerar danos físicos e até mutagênicos. Calor O laboratório biológico é rico em fontes de calor que podem causar acidentes: bico de Bunsen, fornos de esterilização, estufas, autoclaves, são todas fontes que chegam a altas temperaturas que sem o devido cuidado podem provocar sérios acidentes. 2.1.2 Risco Químico Existem muitos produtos químicos que podem causar danos e estes podem ser inflamáveis, tóxicos, carcinogênicos ou cáusticos. FIGURA 1 FONTE: Disponível em: <http://commons.wikimedia.org>. Acesso em: 22 fev. 2012. As soluções químicas sempre trazem em seu rótulo o fator de risco presente e as condições de armazenagem necessárias, por isso é importante sempre ler o rótulo antes de guardar os reagentes e de manipulá-los. http://commons.wikimedia.org/ 2.1.3 Risco Biológico No caso de um laboratório de análises clínicas, por exemplo, esta é a principal fonte de risco. Alguns exemplos são Culturas células, Micro-organismos, Parasitas e Toxinas produzidas por micro-organismos. São necessáriosprocedimentos especiais para a manipulação e descarte dos materiais biológicos. 2.1.4 Grupos de Riscos Biológicos Os agentes biológicos são divididos de acordo com os seguintes critérios: grau de patogenicidade, alteração genética, estabilidade, virulência, modo de transmissão, endemicidade e disponibilidade de medidas profiláticas e tratamento eficaz. A ANVISA divide os agentes biológicos em 5 classes, levando em conta o risco para o ser humano, animais, meio ambiente e consequências epidemiológicas e a OMS possui uma classificação específica para trabalho laboratorial, com 4 Grupos de Riscos. Por nosso conteúdo se tratar de Rotinas laboratoriais utilizaremos o critério de classificação da OMS. Grupo de Risco 1 (nenhum ou baixo risco individual e coletivo) Um microrganismo que provavelmente não pode causar doença no homem ou em um animal. Grupo de Risco 2 (risco individual moderado, risco coletivo baixo) Um agente patogênico que pode causar uma doença ao homem ou animais, mas que é improvável que constitua um perigo grave para o pessoal dos laboratórios, à comunidade, o gado ou o ambiente. A exposição a agentes infecciosos no laboratório pode causar uma infecção grave, mas existe um tratamento eficaz e medidas de prevenção e o risco de propagação de infecção é limitado. Grupo de Risco 3 (alto risco individual, baixo risco coletivo) Um agente patogênico que causa geralmente uma doença grave no homem ou no animal, mas que não se propaga habitualmente de uma pessoa a outra. Existe um tratamento eficaz, bem como medidas de prevenção. Grupo de Risco 4 (alto risco individual e coletivo) Um agente patogênico que causa geralmente uma doença grave no homem ou no animal e que se pode transmitir facilmente de uma pessoa para outra, direta ou indiretamente. Nem sempre está disponível um tratamento eficaz ou medidas de prevenção. 2.2 CÓDIGO DE PRÁTICAS Cada laboratório possui um Código específico, de acordo com riscos conhecidos e potenciais presentes. Porém, algumas normas são essenciais para a manutenção das Boas Práticas Laboratoriais e aqui descreveremos uma lista básica de requisitos para o trabalho em laboratório biológico. 2.2.1 Normas de Acesso FIGURA 2 FONTE: Manual de Segurança Biológica em Laboratório – OMS. 1. O símbolo internacional de risco biológico (Figura acima) devem estar expostos nas portas das salas onde se estão a manusear microrganismos do Grupo de Risco 2 ou acima. 2. Só o pessoal autorizado deve entrar nas áreas de trabalho do laboratório. 3. As portas do laboratório devem permanecer fechadas. 4. É proibida a presença de pessoas não autorizadas nas áreas do laboratório. 5. O acesso aos compartimentos de animais requer autorização especial. 6. Nenhum animal deve entrar no laboratório, além dos necessários aos procedimentos. 2.2.2 Normas de Proteção Individual FIGURA 3 FONTE: Disponível em: <http://biomedicinaemicro.blogspot.com>. Acesso em: 22 fev. 2012. 1. Uso obrigatório de jalecos, aventais ou uniformes exclusivos ao trabalho no laboratório. 2. PROIBIDO uso do avental fora do laboratório (cantina, cafetaria, escritórios, biblioteca, salas do pessoal e banheiros). Ele deve ser considerado potencialmente contaminado podendo, portanto, contaminar o ambiente externo e também o inverso, trazer contaminações do ambiente externo para dentro do laboratório. 3. Obrigatório uso de luvas de procedimento em todos os trabalhos com contato direto ou potencial com sangue, fluidos corporais, materiais ou animais potencialmente infecciosos ou infectados. Após utilização, devem tirar-se as luvas sem tocar a parte externa destas e lavar as mãos. Se necessário, utilizar dois pares de luvas de procedimentos. 4. Uso de máscara. As máscaras de proteção são necessárias para a proteção tanto da amostra quanto do operador. No caso de manipulação amostras potencialmente contaminadas ou com presença confirmada de agentes biológicos do grau de risco 3 e/ou 4 a máscara deverá possuir sistema de filtração. 5. Lavagem das mãos antes e depois dos procedimentos técnicos e antes de sair do laboratório. A lavagem das mãos deve ser feita nas palmas, costas e embaixo das unhas e depois do enxágue, usar uma toalha ou papel para fechar a torneira. 6. Uso de óculos de segurança, viseiras ou outros dispositivos de proteção, sempre que for necessário proteger rosto e olhos contra impactos, produtos químicos, radiação e manipulação de material biológico potencialmente contaminado. 7. Obrigatório o uso de sapato fechado. Sandálias e chinelos não devem ser utilizados nos laboratórios. 8. É proibido comer, beber, fumar e colocar lentes de contato nas áreas de trabalho do laboratório. 9. É proibido guardar alimentos nas áreas de trabalho do laboratório. 10. A roupa de proteção laboratorial utilizada no laboratório não deve ser guardada nos mesmos locais da roupa normal. 11. É proibida a utilização de acessórios tais como: anéis, brincos, colares e de maquiagem. 2.2.3 Normas de Procedimento 1. Proibido pipetagem com a boca. 2. Nenhum material deve ser colocado na boca ou cheirado. 3. Todos os procedimentos técnicos devem ser efetuados de forma a minimizar a formação de aerossóis e gotículas. 4. A utilização de agulhas e seringas hipodérmicas deve ser limitada, essas não devem ser utilizadas como substitutos de pipetas ou qualquer outro fim, além de injeções ou aspiração de fluidos de animais de laboratório. 5. Qualquer derrame, acidente, exposição efetiva ou potencial a materiais infecciosos deve ser notificado ao supervisor do laboratório. Deve manter-se um registro escrito de tais acidentes e incidentes. 6. Devem ser elaboradas normas escritas para a limpeza destes derrames e devidamente aplicadas. 7. Os líquidos contaminados devem ser (química ou fisicamente) descontaminados antes de serem lançados nos esgotos sanitários. Pode ser necessário um sistema de tratamento de efluentes, segundo a avaliação de riscos do agente manuseado. 8. O laboratório deve estar arrumado, limpo e sem materiais que não sejam pertinentes para as suas atividades. 9. As superfícies de trabalho devem ser descontaminadas após qualquer derrame de material potencialmente perigoso e no fim de um dia de trabalho. 10. Todos os materiais contaminados, espécimes e culturas devem ser descontaminados antes de serem descartados ou reutilizados. 11. A embalagem e o transporte devem obedecer aos regulamentos nacionais e/ou internacionais pertinentes. 2.2.4 Controle da Segurança Biológica O trabalho com materiais biológicos deve sempre ser controlado para a segurança tanto da amostra analisada, para a garantia da qualidade do diagnóstico, quanto para preservar a saúde do operador. Para tanto é necessária à adoção de algumas medidas para controle da segurança biológica dentro de um laboratório. Em um laboratório sempre há um diretor ou um supervisor que irá nomear, se não for ele próprio, um Responsável Técnico pelo Laboratório. Este será o colaborador responsável pela tomada de decisões no dia a dia, por implantar e atualizar os procedimentos e pela elaboração e manutenção de um plano para garantia da segurança. Este plano pode ter vários nomes, dependendo de cada empresa, mas aqui chamaremos de Plano de Controle de Segurança Biológica. O responsável técnico do laboratório pode designar um outro colaborador a seu critério para a elaboração deste plano. Todos os funcionários são responsáveis pela manutenção da Qualidade e Segurança dentro de um laboratório e por isso é necessário o treinamento e atualização de todos os envolvidos para o laboratório ser um ambiente mais seguro. É preciso ter um Manual de Segurança e/ou Operacional, com todasas regras e procedimentos que devem ser adotados. É imprescindível que todos realmente saibam e sigam este manual e por isso são necessários treinamentos periódicos destas normas. Para não se tornar maçante e para melhor entendimento das informações e conceitos do Manual podem ser realizados além dos treinamentos, cursos de reciclagem e aperfeiçoamento para toda a equipe. O Manual de Segurança deve ser conhecido por todos e disponível dentro do laboratório, para ser consultado sempre que necessário. A manutenção da limpeza do laboratório é obrigatória e deve ser realizada frequentemente, além de sua higienização também é necessária à desinfecção do ambiente com produtos antimicrobianos. Também é necessário um controle para evitar a entrada e presença de pragas como roedores e de artrópodes, que podem atuar como fonte de contaminação para o ambiente. É recomendado o laboratório ter portas e janelas com vedação ou com sistemas que impeçam a invasão de artrópodes, como por exemplo, telas e um programa de dedetização periódico. 3 O LABORATÓRIO CLÍNICO A função principal do trabalho de um Laboratório Clínico é fornecer subsídios clínicos aos médicos para que possam confirmar ou rejeitar um diagnóstico e/ou monitorar pacientes em tratamento. Dessa forma, a obtenção de um resultado laboratorial é apenas uma parte da rede necessária para um diagnóstico e/ou tratamento de um paciente. Trata-se de uma importante etapa, pois se houver algum erro, por motivos técnicos ou de manipulação, pode haver uma falsa interpretação pelo médico e consequente ineficácia no tratamento ou prejuízos maiores ainda. O trabalho dentro do laboratório exige uma série de procedimentos que devem ser padronizados e sempre reavaliados quanto à sua eficácia, além de passar por constante controle de qualidade de todas as etapas envolvidas: equipamentos, insumos, amostras, procedimentos e equipe técnica. Aliás, a responsabilidade e execução de atividades de um laboratório é sempre desenvolvida e pensada como um trabalho em equipe. A equipe do Laboratório Clínico é composta por vários profissionais como: Médicos, Biólogos, Biomédicos, Técnicos, Auxiliares, Secretárias e Equipe de limpeza. Sem o médico o paciente não pode ter uma receita para continuar seu tratamento e sem a faxineira, por exemplo, o ambiente não mantém as condições de limpeza e qualidade necessárias para a realização dos exames. Por isso é que todos os membros da equipe são necessários e importantes para a garantia da qualidade do resultado final. Um laboratório clínico pode contar com diversos setores ou atuar com um ou mais tipos de exames em um ambiente único. Algumas das especialidades encontradas são: Citologia, Hematologia, Bioquímica, Imunologia, Parasitologia e Biologia Molecular. Em todas essas especialidades é necessária uma estrutura básica 3.1 INSTALAÇÕES FIGURA 4 FONTE: Disponível em: <http://miltonkennedy.blogspot.com/2011_04_01_archive.html>. Acesso em: 12 mar. 2012. As instalações laboratoriais, além de compatíveis com as regulamentações municipais, estaduais e federais, devem ser de acordo com o grau de segurança biológica necessária para o trabalho. Isto é, dependendo do grupo de risco do material manipulado é o nível de segurança exigido para o laboratório. Segundo a ANVISA são quatro os níveis de Biossegurança: NB-1, NB-2, NB-3 e NB-4 e esses estão relacionados com os requisitos crescentes de segurança para o manuseio de agentes biológicos, de acordo com o grau de risco. O nível de Biossegurança exigido para um ensaio é determinado pelo agente biológico de maior classe de risco envolvido no laboratório e quando o potencial patogênico é desconhecido é preciso ser feita uma análise de risco para saber em qual nível de segurança deverá ser manipulado o agente. Independente do nível de segurança biológica alguns critérios são os mesmos e os descreveremos a seguir. A instalação deve ter paredes e piso lisos, não porosos, com cantos arredondados, com acabamentos impermeáveis e resistentes a produtos químicos, para facilitar a limpeza e a descontaminação da área. O chão deve ser de material antiderrapante e é proibido encerar o chão. Também é proibido o uso de carpetes, cortinas, persianas ou similares e quando necessário utilizar películas protetoras ou outras formas para proteção solar. As janelas e as Você sabia? Que para entrar nos Laboratórios de Biossegurança níveis NB-3 e NB-4 é preciso trocar de roupa e para sair é preciso tomar banho? portas devem ser de materiais que facilitem a limpeza e a manutenção e com acabamentos que retardem o fogo. As instalações físicas devem estar de acordo com as regulamentações de segurança do Corpo de Bombeiros em relação à proteção contra incêndio e as rotas de fuga e saídas de emergência devem estar identificadas e conhecidas por todos. Os laboratórios devem possuir portas para o controle do acesso ao público. As portas devem ser mantidas fechadas e possuir visores, exceto quando haja recomendação contrária. Pisos e bancadas devem ser nivelados e a bancada também deve ser de material liso, impermeável e de fácil limpeza, resistente a calor moderado e ação de solventes orgânicos, ácidos, álcalis e solventes químicos. O mobiliário deve ser robusto e de fácil limpeza, a circulação dentro do laboratório deve ser facilitada com espaçamento entre bancadas, cabines e equipamentos. Todos os equipamentos, bancada e mobiliário devem ter espaço na parte inferior para facilitar a limpeza e descontaminação. O ambiente deve ser bem iluminado e possuir circulação de ar – mesmo que artificial e temperatura amena. Prevendo casos de falta de energia elétrica a instalação deve ser equipada com um sistema de iluminação de emergência e fonte de energia alternativa (gerador, no-break) para abastecimento de equipamentos de uso contínuo essencial como: congeladores, geladeiras, estufas entre outros. Deve haver pia separada, para lavagem e higienização das mãos, e ambientes, fora do laboratório, para descanso, alimentação e guarda de objetos pessoais como, bolsas, carteiras e roupas. Resumo Características Físicas Laboratório: 1. Paredes, chão e bancadas lisos, impermeáveis e fáceis de limpar e descontaminar; 2. Chão e bancadas niveladas; 3. Espaço entre mobiliário e bancadas para circulação do pessoal; 4. Chão antiderrapante; 5. Ambiente bem iluminado; 6. Boa circulação de ar; 7. Sistema de geração de energia em casos de falta de luz; 8. Sistemas de segurança contra incêndios; 9. Sistema de controle de acesso de pessoas ao laboratório; 10. Local separado para: lavagem das mãos, descanso e alimentação. 3.2 EQUIPAMENTOS E MATERIAIS DE LABORATÓRIO Há vários equipamentos e materiais para o auxílio das técnicas no Laboratório, e a cada dia são desenvolvidos e aperfeiçoados para facilitar o dia a dia do operador e tornar a rotina mais ágil e eficaz. A seguir está uma relação dos equipamentos e materiais mais comuns. Capela É uma cabine com sistema de exaustão para o trabalho com reagentes tóxicos e voláteis. Existe uma barreira, de vidro ou acrílico, entre o operador e o material manipulado. É considerado um Equipamento de Proteção Coletiva. FIGURA 5 Cabines de Segurança Biológicas São usadas para proteção do operador e/ou da amostra manipulada. Existem vários tipos de Cabines de Segurança Biológicas (CBS) e esses variam de acordo com o grau de risco. A mais simples é a Cabine de Fluxo Laminar que é usada apenas para a proteção do material FONTE: Disponível em: < http://www.nalgon.com.br/imagens/prod3700.jpg >. Acesso em: 12 mar. 2012. manipulado – como no caso de preparo de meios de cultura e soluções estéreis. Outros modelos de Cabines de Segurança Biológica variam da classe I a III, onde protegem amostra e operador, e a cadanível que aumenta possuem mais filtros e dispositivos de segurança. FIGURA 6 FIGURA 7 Estufa Pode ser utilizada tanto para secagem de amostras e materiais ou para cultura bacteriológica (não a mesma estufa, uma para cada finalidade). Chega a temperaturas altas, geralmente em torno de 150ºC. Existem variações destas estufas com mais recursos, como controle de umidade e de CO2. FONTE: Disponível em: < http://www.sotelab.com.br/produtos/imagens/cabin es/cabine_de_seguranca.png />. Acesso em: 12 mar. 2012. FONTE: grupo tchê química FIGURA 9 - FONTE: Disponível em: < http://www.tecmed.ind.br/autoclaves/i mg%27s/P23avs.gif >. Acesso em: 12 mar. 2012. Forno Pasteur Forno utilizado para esterilização a seco. Chega a altas temperaturas, entre 250 e 300ºC. Autoclave Equipamento usado para esterilização úmida. Funciona como uma grande panela de pressão, utiliza temperaturas em torno de 120ºC e 1 a 1,5 atm de pressão. FIGURA 10 Centrífuga Equipamento utilizado para acelerar a decantação (sedimentação) de amostras e soluções. Existem variações quanto ao tipo e tamanho de tubo utilizado - podem ter rotores com capacidade para tubos de 100 ml a 100ul - capacidade de tubos - de 4 a 100 tubos, por exemplo – velocidade rotacional - de 100 rpm (rotação por minuto) a 10.000rpm – e com ou sem refrigeração. FIGURA 8: FONTE: Disponível em: <laboratorioscolasticocde.myblog.it>. Acesso em: 10 jan 2012. FONTE: Disponível em: <www.eppendorf.com>. Acesso em: 12 mar. 2012. http://laboratorioscolasticocde.myblog.it/ Usado para homogeneização de amostras líquidas. Há grande variedade de modelos: Agitadores FIGURA 11 Vortex: tem por princípio a agitação do tubo FIGURA 12 Agitador orbital: possui uma agitação mais ‘delicada’, onde uma bandeja faz movimentos planos. - FONTE: Disponível em: <www.analiticaweb.com.br>. Acesso em: 12 mar. 2012. FONTE: Disponível em: <www.analiticaweb.com.br>. Acesso em: Acesso em: 12 mar. 2012. Agitador magnético: dentro do frasco (balão, erlenmeyer, etc.) é colocada uma barra magnética e o imã na plataforma do agitador movimenta esta barra em movimentos circulatórios. FIGURA 13 Microscópio Um instrumento essencial para grande parte das técnicas laboratoriais clínicas, sobretudo as citológicas e hematológicas. Existem muitos tipos de microscópios, porém os mais conhecidos são: Microscópio Óptico: tipo mais comum usa luz para iluminar as estruturas e a observação é feita através de lentes de refração e oculares de vidro. Uma variação é o Microscópio Fluorescente, que possui o mesmo princípio porém usa um comprimento de onda diferente. Também existe uma versão de Microscópio óptico digital onde uma câmera de vídeo é associada para visualização em monitor. FONTE: Disponível em: <www.analiticaweb.com.br>. Acesso em: 12 mar. 2012. Barra magnética FIGURA 14 Microscópio Eletrônico: Utiliza elétrons para tornar a estrutura visível. Existem microscópios eletrônicos que produzem imagem em 2D (Transmissão) e em 3D (Varredura). FIGURA 15 Banho-maria Microscópio óptico comum Microscópio óptico digital FONTE: Disponível em: <http://www.biomedicinapadrao.com>. Acesso em: 12 mar. 2012. Microscópio eletrônico Imagem vírus da poliomielite por um microscópio de transmissão Imagem de grãos de pólen por um microscópio de varredura FONTE: Disponível em: <commons.wikimedia.org>. Acesso em: 12 mar. 2012. Equipamento para aquecimento e incubação de amostras, soluções e cultura. Existem modelos com funções adicionais como, timer, agitação ou suportes acoplados para frascos específicos. FIGURA 16 Bico de Bunsen É a fonte de calor mais comum usada em laboratório. Consiste em um bico de gás com uma válvula para controle da intensidade da chama. FIGURA 17 Entrada de ar (janela) Entrada de gás FONTE: Disponível em: <www.cial-paulinia.com.br>. Acesso em: 12 mar. 2012. FONTE: Disponível em: <www.rapidonline.com>. Acesso em: Acesso em: 12 mar. 2012. Para ligar o bico de bunsen a entrada de ar (janela) deve estar fechada, para evitar que entre acidentalmente uma chama pela tubulação de gás. Quando a janela está fechada o bico produz uma chama amarela – chama ‘fria’, pouco oxidante e inadequada para o aquecimento – e quando a janela está aberta, devido à entrada de ar que alimenta a chama, ela torna-se azul e é chamada de ‘quente’ por possuir maiores temperaturas. Considera-se a área ao redor da chama – cerca de 30 cm – como zona estéril. FIGURA 18 Balança analítica e semianalítica As balanças mais utilizadas são as analíticas e semianalíticas. A diferença entre elas é o grau de precisão na medição. Enquanto a semianalítica tem uma precisão de até três casas decimais (0,001g) a analítica chega até quatro a cinco casas decimais. O tipo de balança encontrada então dependerá da necessidade de precisão nas técnicas utilizadas. Existem vários detalhes envolvidos para a realização de uma medição técnica adequada: a bancada deve estar nivelada e sem pessoas circulando perto ou trabalhando na mesma bancada – para evitar vibrações que alterariam o valor do resultado medido, deve haver uma verificação da calibração Chama amarela ‘fria’ Chama azul ‘quente’ FONTE: Disponível em: <commons.wikimedia.org>. Acesso em:: 12 mar. 2012. FONTE: Disponível em: <www.sxc.hu>. Acesso em: 12 mar. 2012. com pelo menos 1 hora de antecedência ao primeiro uso do dia, o prato e cabine devem ser limpos com um pincel – para retirada de sujidades e resíduos – antes da pesagem, o operador deve utilizar luvas durante todo o procedimento – para não deixar resíduos de gordura na vidraria utilizada e evitar, assim, alteração da medida – entre outros inúmeros detalhes técnicos. FIGURA 19 FIGURA 20 Tubos de Ensaio: utilizados para fazer reações químicas em pequena escala e para aquecer soluções. FIGURA 21 Béquer: utilizado para preparo de soluções. FIGURA 22 FONTE: Disponível em: <www.splabor.com.br>. Acesso em: 12 mar. FONTE: Disponível em: <www.cdcc.sc.usp.br>. Acesso em: 12 mar. 2012. Erlenmeyer: usado para titulações. FIGURA 23 Kitassato: parte de conjunto usado para filtrações a vácuo. FONTE: Disponível em: <www.cdcc.sc.usp.br>. Acesso em: 12 mar. 2012. FIGURA 24 Balão Volumétrico: frasco calibrado de precisão utilizado para diluir e preparar soluções. FIGURA 25 Balão de fundo redondo: usado para aquecer líquidos e realizar reações que envolvam desprendimento de gases. FONTE: Disponível em: <www.onixmetrologia.com.br>. Acesso em: 12 mar. 2012. FONTE: www.pro-analise.com.br>. Acesso em: 12 mar. 2012. http://www.cdcc.sc.usp.br/ http://www.onixmetrologia.com.br/ http://www.pro-analise.com.br/ FIGURA 26 Proveta: usado para medidas aproximadas de volumes líquidos. Bureta: Serve para dar escoamento a volumes variáveis de líquidos. FIGURA 27 É uniformemente calibrada, graduada em décimos de mililitro. Possui uma torneira que permite o controle de escoamento. Pipetas Graduada: usada para medir volumes de líquidos. FIGURA 28 FONTE: Disponível em: <www.cdcc.sc.usp.br>. Acesso em: 10 mar. 2012. FONTE: boj.pntic.mec.es>. Acesso em: 09 fev. 2012. FONTE: Disponível em: <noticias.vidrado.com>. Acesso em: 09 fev. 2012. http://www.cdcc.sc.usp.br/ Volumétrica: usadapara medidas precisas de variados líquidos. FIGURA 29 Funil: usado para transferência de líquidos e para filtrações. FIGURA 30 Vidro de relógio: recipiente usado para pesagens. FIGURA 31 FONTE: Disponível em: <www.jpdiagnostica.com.br>. Acesso em: 10 fev. 2012. FONTE: Disponível em: <www.fcf.usp.br>. Acesso em: 05 fev. 2012. http://www.fcf.usp.br/ Placa de Petri: usado principalmente para cultivo – células, bactérias, fungos, etc. FIGURA 32 Bastão de vidro: usado para homogeneização e transferência de líquidos. FIGURA 33 Dessecador: Recipiente de vidro resistente que contém em seu interior substâncias que são higroscópicas (absorvem a umidade de outras substâncias). É utilizado para esfriar ou preservar algum material ou reagente sem que haja absorção de umidade. FONTE: Catálogo Brand FONTE: Disponível em: <www.frascolex.com.br>. Acesso em: 09 fev. 2012.. http://Fonte:%20www.frascolex.com.br FIGURA 34 FIGURA 35 Almofariz e pistilo: Usado para triturar sólidos, pulverizar e homogeneizar mistura e sólidos. FIGURA 36 Tela de amianto: usada para distribuir uniformemente o calor durante um aquecimento. FONTE: Grupo Tchê Química FONTE: Disponível em: <nalgon.com.br>. Acesso em: 12 mar. 2012 FONTE: www.agracadaquimica.com.br>. Acesso em: 10 fev 2012. http://www.nalgon.com.br/ Suporte universal, mufa e garra: usados na sustentação de peças para diversos fins. FIGURA 37 Tripé: usado como suporte de telas de amianto em processos de aquecimento com o bico de Bunsen. FIGURA 38 FONTE: Disponível em: <www.cgomes.uac.pt>. Acesso em: 12 mar. 2012 FONTE: www.cap-lab.com.br>. Acesso em: 12 mar. 2012. http://www.cgomes.uac.pt/ http://www.cap-lab.com.br/ Pinça de madeira: usada para segurar tubos de ensaio. FIGURA 39 Pipetador ou pera: instrumento de sucção para auxílio na pipetagem. FIGURA 40 FONTE: www.cdcc.sc.usp.br>. Acesso em: 12 mar. 2012. FONTE: images.linuxidx.com>. Acesso em: 12 mar. 2012. http://images.linuxidx.com/ FIGURA 41 Pisseta: de plástico, usado para líquidos de uso constante como: água destilada, álcool 70%. Alça para inoculação: Para inoculação em meios de cultura. Podem ser de metal (platina) ou descartáveis FIGURA 42 FONTE: Catálogo Brand FONTE: www.cdcc.sc.usp.br>. Acesso em: 12 mar. 2012. Capilar: tubos de vidro extremamente finos, aberto em ambas às extremidades. Utilizado em técnicas que necessitam de pequenos volumes líquidos. FIGURA 43 Exercícios de Fixação: 1 Quais dos critérios abaixo descritos são usados para a classificação dos Grupos de Riscos dos agentes biológicos? a) Patogenicidade, modo de transmissão, medidas profiláticas e tratamentos disponíveis. b) Grau de sujidade da amostra, número de agentes biológicos envolvidos, tempo de exposição, tempo de tratamento. c) Modo de transmissão, tipo de micro-organismo, capacidade de infecção do agente, d) Medidas de controle do agente, grau de sujidade da amostra, capacidade de proliferação. FONTE: Catálogo Brand e) Número de agentes biológicos envolvidos, capacidade de proliferação, medidas profiláticas e de tratamento disponíveis. 2 Assinale verdadeiro ou Falso: Como deve ser a estrutura de um laboratório? ( ) Cor clara, chão e paredes de azulejo, bancadas largas e corredores estreitos para melhor aproveitamento do espaço. ( ) Piso e paredes de azulejo, bancadas fixas na parede com armários embutidos e centro livre da sala livre. ( ) Chão e paredes laváveis e com cantos arredondados, chão e bancada nivelados e espaço para circulação de pessoas e limpeza do ambiente. ( ) Muitas bancadas distribuídas, chão e paredes brancos laváveis e equipamentos em todas as paredes. Resp. 1 – A 2 – F; F; V; F; F 4 PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA 4.1 CARBOIDRATOS Os carboidratos são as biomoléculas mais abundantes na natureza. A celulose, os açúcares e amidos, são todos carboidratos. Existem carboidratos em toda nossa volta e por isso a seguir veremos sua estrutura e quem são. 4.1.1 Monossacarídeos Os monossacarídeos com quatro, cinco, seis e sete átomos de carbono em seus esqueletos são chamados de tetroses, pentoses, hexoses e heptoses. A cada um destes comprimentos de cadeia existem aldoses e cetoses correspondentes, por exemplo: aldotetroses, cetopentoses e assim por diante. FIGURA 44 FONTE: Adaptado de Lehninger Grupo cetose CETOSE Grupo aldeído ALDOSE http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/5a/DL-Fructose.svg http://en.wikipedia.org/wiki/Image:D-glyceraldehyde-2D-Fischer.png São exemplos de hexoses bastante familiares à glicose, a galactose, a manose e a frutose. FIGURA 45 Além dos monossacarídeos simples existem os derivados, nos quais um grupo hidroxila é trocado por outro grupo substituinte. FIGURA 46 FONTE: Lehninger FONTE: Adaptado de Lehninger cetose aldeídos 4.1.2 Polissacarídeos Os dissacarídeos são constituídos por dois monossacarídeos unidos covalentemente entre si por uma ligação glicosídica. FIGURA 47 Quando uma hidroxila (OH) da molécula de um monossacarídeo reage com o átomo de carbono da outra molécula de açúcar, há a formação da ligação glicosídica com a liberação de H2O. Os oligossacarídeos são pequenos polímeros que possuem vários monossacarídeos. Já os polissacarídeos possuem uma grande quantidade de monossacarídeos ligados, são polímeros de média até alta massa molecular. Também são conhecidos como glicanos. Os polissacarídios Ligação glicosídica FONTE: Adaptado de Lehninger. podem ser compostos por um (Homopolissacarídeos) ou por mais tipos de monossacarídeos (Heteropolissacarídeos) e podem estar ligados entre si em cadeias lineares ou ramificados. FIGURA 48 O amido e o glicogênio, que servem como reserva energética para a maioria dos seres vivos, são homopolissacarídeos e suas moléculas de glicose estão unidas por ligações do tipo α (alfa) já a celulose e quitina, também são homopolissacarídeos, porém, as moléculas de glicose estão unidas por ligações do tipo β (beta). 4.2 PROTEÍNAS Proteínas são macromoléculas biológicas que estão presentes em todas as células, fazem parte da estrutura dos seres vivos e são os instrumentos moleculares pelos quais a informação genética é expressa. São variáveis quanto ao tamanho e função, porém todas são constituídas pelo mesmo conjunto de aminoácidos. FONTE: Lehninger 4.2.1 Aminoácidos As proteínas são polímeros de aminoácidos. Comumente, são encontrados 20 aminoácidos diferentes. Todos esses possuem uma estrutura geral em comum e são α- aminoácidos, pois possuem um grupo carboxila e um grupo amino ligados ao mesmo átomo de carbono (o carbono α). O grupo R (cadeias laterais) ligado ao carbono α é o que difere em cada aminoácido. Esses, não podem ser sintetizados pelo nosso organismo e podem apenas ser obtidos através da alimentação (animal ou vegetal), são chamados de aminoácidos essenciais. Além destes existem outros, que podem ser produzidos pelo corpo, são conhecidos como aminoácidos não essenciais. FIGURA 49 AMINOÁCIDOS ESSECIAIS AMINOÁCIDOS NÃO ESSENCIAIS Fenilalanina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Treonina Triptofano Ácido Aspártico Ácido Glutâmico Alanina Arginina Asparagina CisteínaGlicina FONTE: Lehgninger carbono α Valina Glutamina Histidina Prolina Serina Tirosina 4.2.2 Peptídeos e Proteínas Os aminoácidos podem se unir por ligações peptídicas, formando peptídeos e proteínas. Quando há a união de poucos aminoácidos são considerados oligopeptídeos e quando muitos estão unidos o produto é chamado de polipeptídeo. As proteínas podem ter milhares de aminoácidos e são distinguidas dos polipeptídeos por seu alto peso molecular. A sequência de aminoácidos, em uma proteína, é característica para cada proteína e esta é chamada de sua estrutura primária. Há vários níveis de estrutura proteica, podendo chegar até a estrutura quaternária. A cada nível estrutural a proteína se dobra, enovela, ficando mais compactada e com uma estrutura mais complexa. FIGURA 50 FONTE: Lehgninger Estas estruturas são mantidas por forças e ligações químicas entre as moléculas e dependem de condições especiais para manterem esta conformação estrutural. Condições diferentes, como por exemplo, elevação de temperatura, resulta em perda da estrutura tridimensional e é denominada de desnaturação. A função de uma proteína depende de sua forma estrutural, ou seja, a forma como a estrutura secundária, terciária e/ou quaternária estão dobradas. Desse modo, se por algum motivo a proteína perder sua forma ela também deixará de ter sua função. 4.2.3 Enzimas Uma das qualidades básicas e fundamentais para a manutenção e sucesso da vida é a capacidade de uma célula, ou ser vivo, realizar reações químicas. É fácil entender esta relação ao lembrar que para a vida existir é necessário energia. E para a obtenção, armazenamento e liberação de energia são necessárias inúmeras reações químicas. E onde as enzimas entram neste contexto? Bem, algumas reações não ocorreriam espontaneamente na natureza, ou então demorariam horas ou até mesmo anos para acontecer. E aí que as enzimas entram, elas são as catalizadoras destas reações, ou seja, são aceleradoras de todo este processo. As enzimas, com exceção de um pequeno grupo de moléculas de RNA, são proteínas. E sua função, assim como de todas as proteínas, depende de sua forma. Desse modo, se uma enzima for desnaturada também perderá sua função. Muitas enzimas têm seu nome de acordo com o substrato em que age ou o tipo de atividade. Em geral sempre terminam com o sufixo ‘ase’ – lípase, amilase, protease. As enzimas são classificadas de acordo com as reações que catalisam, abaixo podemos ver a Classificação internacional de enzimas e o tipo de reação catalisada por cada grupo de enzimas. FIGURA 51 4.3 LIPÍDIOS Os lipídios são a principal forma de reserva energética em muitos organismos. Também podem agir como cofatores (auxiliando enzimas nas reações), como sinalizadores e até como pigmentos. Porém, sua principal função é estrutural, como componente das membranas celulares, que são bicamadas lipídicas. São insolúveis na água e possuem estruturas químicas diversificadas que podem ser extraídos por solventes não polares. FONTE: Lehgninger 4.3.1 Ácidos Graxos As gorduras e óleos são derivados de ácidos graxos. Os ácidos graxos, como seu próprio nome já diz, possuem em sua composição um ácido carboxílico com uma cadeia de hidrocarboneto associada (grupo R). FIGURA 52 A cadeia de hidrocarbonetos varia de 4 a 36 átomos de carbono. Em alguns casos essa cadeia não é ramificada e saturada, isto é, não contém ligações duplas entre os carbonos. Alguns, poucos, contêm ramificações ou grupos hidroxila. 4.3.2 Triglicerídeos Os lipídios mais simples que possuem ácidos graxos em sua composição são os trigliceróis, popularmente chamados por triglicerídeos. São compostos por 3 moléculas de ácido graxo unidas por uma ligação do tipo éster a uma molécula de glicerol. FONTE: Lehgninger Grupo R Ácido carboxílico FIGURA 53 4.3.3 Fosfolipídios Também chamados de glicerofosfolipídios, são os lipídios que compõem a membrana celular. Sua estrutura é feita de dois ácidos graxos ligados a um ácido fosfatídico. Sua característica principal, e o que torna possível como membrana, é o fato de possuir um grupo polar (grupo fosfato), hidrofílico e um grupo apolar (ácidos graxos) hidrofóbico. Glicerol Triglicerídeos FONTE: Lehgninger 5 PRINCÍPIOS DE MICROBIOLOGIA A Microbiologia é a ciência que estuda os micro-organismos, sua bioquímica, biologia e interação com outros seres vivos. Os micro-organismos compreendem um imenso grupo com membros que podem ser encontrados em células únicas ou em agrupamentos celulares e que podem existir em praticamente todos os tipos de ambientes. Os membros deste grupo de estudo são todos seres microscópicos que podem ser encontrados nos Reinos Monera (bactérias) e Protista (protozoários), alguns no Reino Fungi (leveduras e bolores). Os micro-organismos podem ser diferenciados dos organismos multicelulares por serem autônomos realizando todos os seus processos vitais e se multiplicar, mesmo consistindo em uma única célula. A célula é a unidade básica do ser vivo, separa-se de outras pela membrana celular, que consiste em uma barreira física que separa o interior da célula do exterior e atua também como selecionador do que deve ou não entrar na célula, através de vários mecanismos de permeabilidade. Dentro da célula encontra-se o material genético, o DNA, que fica no núcleo ou nucleoide, e possui todas as informações para a formação e manutenção celular. Ocupando o interior da célula está o citoplasma, onde ficam todas as organelas que compõem a maquinaria celular. Essa é a composição básica de qualquer célula. FIGURA 54 Você sabia? Que vários autores não consideram os vírus como seres vivos. Isto porque os vírus usam a maquinaria celular de outros seres vivos para reprodução e produção da própria constituição da partícula viral. Membrana Celular DNA Organelas Citoplasma FONTE: arquivo pessoal. 5.1 ESTRUTURAS PROCARIONTES Dependendo do tipo de ser vivo, serão encontradas estruturas e composições diferentes. Existem basicamente dois tipos de organizações celulares: eucariotos e procariotos. A diferença entre eles é o modo como o material genético se encontra. No caso dos seres eucariotos o DNA está organizado em um núcleo. Já nos procariontes o núcleo encontra-se desorganizado, na realidade nem existe um núcleo propriamente dito, mas apenas o DNA ‘solto’ no citoplasma, são os seres vivos mais primitivos. O nosso foco serão as células procariotas, já que as bactérias, grupo dominante na microbiologia clínica, são procariontes. 5.1.1 Membrana Citoplasmática Fina e flexível é a barreira que separa a parte interna da célula do meio exterior. A espessura gira em torno de 8nm, e se rompida à célula morre. As membranas biológicas são feitas de duas camadas de fosfolipídios, intercaladas por proteínas. O fosfolipídio é considerado um lipídio complexo porque tem associado ao lipídio uma molécula de fósforo, isso o torna anfipático, ou seja, tem uma parte hidrofóbica (lipídio) e uma hidrofílica (fósforo). FIGURA 55 proteínas Molécula fosfolipídeo fosfolipídeos FONTE: Microbiologia de Brock 5.1.2 Parede Celular A parede celular é a parte externa da célula procarionte. Sua estrutura é mais resistente do que a membrana, oferece proteção e é quem dá a forma bacteriana. Quanto à forma, as bactérias podem ser: cocos, bacilos, cocobacilos, vibrião, espirilo ou espiroqueta. Podem ser encontradas sozinhas ou em arranjos, quando em grupos. Veja a seguir algumas formas e arranjos comuns de bactérias. FIGURA 56 5.1.3 Cílios e Flagelos Essassão as estruturas responsáveis pela locomoção de grande parte dos micro- organismos. São muito finos, parecendo um fio de cabelo. Podem ser compridos e únicos (ou em pequeno número), no caso dos flagelos, ou curtos e numerosos, como os cílios. Um micro- organismo pode possuir apenas um ou os dois tipos de estrutura e ao baterem milhares de vezes por minuto e em alta velocidade causam o deslocamento da bactéria. FIGURA 57 FONTE: Alterado de <http://little-monsters-espaa.blogspot.com.br/2010/11/bacterias.html> FONTE: Alterado de http://pathmicro.med.sc.edu/fox/coli1.jpg. Acesso em: 16 mar.2012. 5.1.4 Material Genético FIGURA 58 O nucleoide, também conhecido por DNA bacteriano, consiste em uma única grande molécula de DNA com proteínas associadas, sem delimitação por membrana. Nas bactérias, ainda como material genético, existem os plasmídeos, que são moléculas circulares de DNA capazes de se reproduzir independentemente do DNA cromossômico. cílios flagelos DNA bacteriano plasmídeos FONTE: Disponível em: <http://pt.wikipedia.org/wiki/Wikip%C3%A9dia:Artigos_de stacados/arquivo/Plasm%C3%ADdeo>. Acesso em: 26 mar. 2012. http://pt.wikipedia.org/wiki/DNA http://pt.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9cula http://pt.wikipedia.org/wiki/DNA http://pt.wikipedia.org/wiki/Cromossoma http://pt.wikipedia.org/wiki/Cromossoma 5.1.5 Componentes citoplasmáticos O citoplasma é uma solução aquosa que preenche o interior da célula bacteriana. Nele está o DNA, ribossomos e demais organelas. Os ribossomos são partículas de RNA e proteína e atuam na síntese proteica. Existem também grânulos ou inclusões, que podem variar de bactéria para bactéria quanto à composição, mas basicamente são reservas de energia ou de constituintes estruturais. 5.2 NUTRIÇÃO E METABOLISMO Para que um ser vivo cresça, replique e tenha energia para todos os processos envolvidos em sua manutenção são necessárias várias reações químicas que podem ser chamadas de metabolismo. As reações metabólicas ocorrem tanto para a produção de energia – Catabolismo – quanto para o consumo de energia – Anabolismo. E é com base nestes conhecimentos que o cultivo celular em laboratório ocorre. Assim como nós precisamos de alimentos para nosso corpo ter energia e manter o metabolismo, as bactérias também. Para a manutenção de uma cultura de bactérias precisamos alimentá-las com nutrientes. Nem todos os nutrientes são necessários nas mesmas quantidades, alguns são necessários em grandes quantidades – Macronutrientes – enquanto outros, apenas com traços, são suficientes – Micronutrientes. A seguir estão alguns exemplos de Macro e Micronutrientes. FIGURA 59 5.3 CRESCIMENTO MICROBIANO Em microbiologia, crescimento pode ser entendido como aumento no número de células. A célula bacteriana é capaz de se duplicar e na maioria dos micro-organismos ocorre por fissão binária. A medição desse crescimento por unidade de tempo é chamada de taxa de MACRO Nutrientes Função celular Carbono (C) 50% da constituição celular Nitrogênio (N) 12% da constituição celular (aminoácidos) Fósforo (P) Componente dos ácidos nucléicos e fosfolipídios Enxofre (S) Componente de aminoácidos Potássio (K) Componente de várias enzimas Magnésio (Mg) Componente de membranas, ácidos nucléicos e enzimas Cálcio (Ca) Componente de membranas e esporos. Ferro (Fe) Papel chave na respiração, nos citocromos e proteínas. MICRO Nutrientes Função celular Cobalto (Co) Constituição de vitaminas Cobre (Cu) Participação na respiração Manganês (Mn) Ativador de enzimas Zinco (Zn) Atuação na replicação celular crescimento. Cada célula gera outras duas novas células, este intervalo de tempo é chamado de geração e, o tempo necessário para que isso ocorra de tempo de geração. Este tempo é variável de um organismo para outro, algumas bactérias levam dias para se dividir enquanto outras, em questão de minutos se multiplicam, já a maioria das bactérias leva de 1 a 3 horas para se duplicar. Este tempo também depende da qualidade e condições do ambiente. Em um meio de cultura com os nutrientes adequados, quantidade suficiente, e com umidade e temperaturas ideais, levarão a cultura de bactérias ao seu desenvolvimento máximo. 5.3.1 Ciclo de Crescimento Como já vimos, cada célula dá origem a 2 células filhas e por isso o padrão de aumento populacional é exponencial. Entretanto, existem fases no crescimento bacteriano em que não são tão aceleradas. Quando uma população microbiana é inoculada em um novo meio (natural ou em laboratório), o crescimento não se inicia de imediato. Isso porque o organismo precisa de um período para adaptação, a este período damos o nome de Fase lag. A fase seguinte é a Fase exponencial, onde as células encontram-se em seu pico de multiplicação. Depois de um período de crescimento acelerado há certa estabilização na população microbiana e isso acontece porque chega um período em que as células, assim como se dividem e ‘nascem’, outro tanto de células também morrem e somado à limitação da capacidade de nutrientes e espaço disponível, o crescimento chega a uma Fase estacionária ou platô. Se uma população que atingiu a fase estacionária permanecer nestas condições sem acréscimo de nutrientes, depois de um tempo haverá um maior número de morte celular do que de novas células, a esta fase, dá-se o nome de Fase de morte ou declínio. FIGURA 60 FONTE: Arquivo pessoal. Fase lag Fase exponencial Fase estacionária (platô) Fase de morte (declínio) Número de células Tempo 6 PRINCÍPIOS DE HEMATOLOGIA O sangue apresenta duas fases, uma líquida e uma sólida. A fase líquida é o plasma e a fase sólida é composta pelos chamados elementos figurados, que são os glóbulos vermelhos e brancos e as plaquetas. De forma geral o sangue é responsável pela nutrição de todas as células do corpo, pela defesa contra agentes desconhecidos e pela manutenção estrutural dos tecidos (cicatrização). 6.1 PLASMA A parte líquida do sangue é o plasma, um líquido denso amarelado com composição de 90% de água e 10% de proteínas, carboidratos, ácidos graxos, vitaminas, minerais, hormônios e eletrólitos que possuem fundamental importância para a nutrição e manutenção das atividades celulares. 6.2 HEMÁCIAS FIGURA 61 Fonte: Disponível em: <http://www.topnews.in/health/new-finding-may-pave- way-improved-diabetes-treatment-23294>. Acesso em 26 mar. 2012. As hemácias, também conhecidas por eritrócitos ou glóbulos vermelhos, são as células mais abundantes no sangue. É devido à hemoglobina, presente nas hemácias, que o sangue possui sua cor vermelha característica. É ela também a responsável pelo transporte do oxigênio e gás carbônico. A hemácia, nos mamíferos, não possui núcleo e tem um formato de disco bicôncavo. Seu tamanho varia de 6 a 8,5 micrômetros. As hemácias, assim como todos os elementos figurados do sangue, são produzidos pela medula óssea e sua vida média é de 120 dias. A escassez de glóbulos vermelhos é o motivo da anemia e o excesso destas células é chamado de policitemia. 6.3 LEUCÓCITOS Os leucócitos, ou glóbulos brancos, são as células representantes do sistema imune do organismo. São eles que defendem o corpo do ataque e presença de agentes agressores ou tóxicos. Os leucócitos são divididos em dois principais grupos: granulócitos e agranulócitos, de acordo com a presença ou não de grânulos no citoplasma. Os granulócitos, por sua vez, estão divididos em: neutrófilos, eosinófilos e basófilos e os agranulócitos podem ser monócitos ou linfócitos. FIGURA 62 Você sabia? Que os homens possuem mais hemácias do que as mulheres. Enquanto o valor normal, para mulheres adultas, é de 4 a 5 mil hemácias por microlitrode sangue os homens podem ter até 6 mil hemácias por microlitro. FONTE: Disponível em: <ap-imune.webuda.com/>. Acesso em: 27 fev. 2012 Normalmente uma pessoa sadia apresenta de 6000 a 8000 leucócitos por ml de sangue. Os leucócitos são produzidos e armazenados na medula óssea e são liberados na corrente sanguínea apenas quando necessário e tem uma vida útil de 2 a 3 dias. 6.4 PLAQUETAS As plaquetas são pedaços de células com formato arredondado formados a partir de um megacariócitos, que é uma célula gigante produzida na medula óssea e fragmentada. A cada ml são encontrados de 150 a 400 mil plaquetas em um indivíduo saudável, e cada plaqueta possui uma vida média de 10 dias. Possuem papel fundamental na formação de coágulos, graças a sua propriedade de adesão e agregação umas com as outras. Além disso, liberam outras substâncias participantes do processo de coagulação sanguínea, tais como enzimas e hormônios com propriedades coagulantes e vasodilatadoras. http://ap-imune.webuda.com/ 7 PRINCÍPIOS DE IMUNOLOGIA Imunidade é a proteção de nosso corpo contra doenças. O chamado sistema imune atua contra qualquer invasor, que pode ser um microrganismo infeccioso ou mesmo uma substância estranha ao organismo, como macromoléculas, proteínas ou polissacarídeos não reconhecidos pelo sistema. 7.1 IMUNIDADE INATA Logo no início de uma infecção a imunidade inata – ou natural – é quem reage em defesa do organismo, isso porque ela já está presente no organismo antes de qualquer invasor chegar. A imunidade inata consiste em mecanismos que existem antes da infecção, que são capazes de rápidas respostas aos micro-organismos e que, reagem essencialmente do mesmo modo às infecções repetidas. A imunidade inata é ativada por estruturas comuns presentes nos micro-organismos, que podem ser semelhantes a outras substâncias estranhas. São componentes deste tipo de imunidade fatores físicos, químicos e biológicos. 7.1.1 Fatores Físicos São barreiras mecânicas à invasão de agentes não desejados. A pele é nossa primeira linha de defesa, agindo como um muro de proteção devido sua impermeabilidade. A região do interior do nariz possui pelos que juntamente com o muco produzido agem como uma ‘cola’ onde partículas ficam presas. 7.1.2 Fatores Químicos Substâncias antimicrobianas são secretadas pelo nosso organismo como sistema de defesa. São exemplos deste mecanismo a presença de lisozimas e fosfolipases na lágrima, saliva e muco nasal, que são inibidoras do crescimento bacteriano, o pH do estômago é altamente ácido o que reduz drasticamente as condições de vida de microrganismos neste meio. 7.1.3 Fatores Biológicos Proteínas do sangue regulam e coordenam atividades do sistema imunológico e existem também células brancas, neutrófilos e macrófagos, que fagocitam agentes intrusos, além de células matadoras naturais (natural killers) que matam as próprias células hospedeiras quando invadidas por micro-organismos. 7.2 IMUNIDADE ADQUIRIDA Após este primeiro contato, o sistema imune tem outra resposta tardia, mais complexa e específica, a imunidade adquirida. Os componentes da imunidade adquirida são os linfócitos e seus produtos. Esta imunidade é específica contra diferentes tipos de invasores e é aumentada a cada exposição repetida destes agentes porque possui uma memória imunológica. Existem dois tipos de resposta imune adquirida: imunidade humoral e imunidade celular. A imunidade humoral é mediada pelos anticorpos, que são produzidos pelos linfócitos B. Os anticorpos reconhecem, se ligam aos agentes invasores, neutraliza-os e os ‘marcam’ para que sejam eliminados posteriormente. Já a imunidade celular é mediada pelos linfócitos T. Sua ação consiste em destruir os micro-organismos que invadem os fagócitos e outras células do hospedeiro. A imunidade adquirida também pode ser dividida em imunidade ativa e passiva. A imunidade ativa ocorre quando o sistema imune do indivíduo entra em contato com o micro- organismo ou substância estranha, e reage produzindo anticorpos e células imunes. Esse tipo de imunidade pode durar por vários anos. A vacinação é um exemplo de imunidade ativa. Quando um anticorpo ou linfócito específico é transferido para o organismo este é chamado de imunidade passiva. Este tipo de imunidade produz uma ação temporária, com rápida e eficiente proteção. Um exemplo desse tipo de imunidade é a transferência de anticorpos da mãe para o feto. Esses dois tipos de imunidade geram proteção ao indivíduo, porém, no caso da imunidade passiva não há constituição de memória imunológica, pelo fato dos anticorpos não terem sido produzidos neste organismo. 7.3 ANTICORPOS E ANTÍGENOS Os anticorpos são glicoproteínas produzidas pelos linfócitos B. Depois de sintetizados os anticorpos, também conhecidos como imunoglubulinas, podem ficar presos aos linfócitos B ou secretados. Os anticorpos ligados à membrana do linfócito funcionam como mediadores da imunidade humoral, servindo como ponte de ligação com os agentes infecciosos. Quando a parte sólida do sangue e o plasma são separados, resta o que chamamos de soro, que é onde ficam os anticorpos secretados pelos linfócitos, por isso, o estudo dos anticorpos e suas reações com antígenos é chamada de sorologia. São chamados de antígenos ou imunógenos, as moléculas ou macromoléculas, que se ligam especificamente aos anticorpos, desencadeando uma resposta imune do organismo. No caso de antígenos macromoleculares a região ou regiões que se ligam ao anticorpo são os epítopos. Estes epítopos podem ser uma proteína, um carboidrato, um lipídio ou até mesmo um ácido nucleico. A ligação antígeno-anticorpo funciona como um sistema de encaixe molecular, como uma interação chave-fechadura altamente específica. Apesar disso, podem ocorrer reações cruzadas, em que o anticorpo pode reconhecer uma molécula muito semelhante ao antígeno original. Abaixo está uma figura representando um anticorpo e um antígeno ligados. Perceba como apenas um dos antígenos exemplificados possui encaixe perfeito no sítio de ligação do anticorpo. FIGURA 63 Exercícios de Fixação: 3 O termo que preenche corretamente a lacuna é: _____________ são macromoléculas biológicas que fazem parte da estrutura dos seres vivos, estão em todas as células e são os instrumentos moleculares pelos quais a informação genética é expressa. a) Lipídios b) Proteínas c) Carboidratos d) Enzimas e) Monossacarídeos Antígenos Antígeno Sítio de ligação ANTICORPO Ligação ‘chave-fechadura’ Antígenos Antígeno Sítio de ligação ANTICORPO Ligação ‘chave-fechadura’ FONTE: Disponível em: <wikipedia.org>. Acesso em: 27 fev.2012. 4 Em relação aos conceitos aprendidos em microbiologia assinale verdadeiro ou falso dentre as abaixo citadas. ( ) A diferença entre os eucariotos e procariotos é que os procariotos possuem vacúolos e os eucariotos não. ( ) A membrana plasmática é fina e flexível e se rompida a célula morre. ( ) Macronutrientes são assim chamados devido ao tamanho das moléculas que os compõem. ( ) Fase lag é o período de tempo em que os micro-organismos estão com o crescimento mais acelerado. 5 Faça a correlação correta: a) Forma a fase líquida do sangue b) Forma a fase sólida do sangue c) Células atuantes no sistema imunológico d) Pedaços de células que atuam na coagulação sanguínea I - plaquetas II - leucócitos III - plasma IV - elementos figurados 6 Múltipla escolha O que é imunidade humoral? a) A imunidade humoral é aquela na qual os anticorpos se ligam aos agentes invasores, neutraliza-os e os ‘marcam’ para que sejam eliminados posteriormente. b) A imunidade humoral é aquela mediada pelos linfócitos T, e consiste na destruição dos micro-organismos que invadem os fagócitos e outras células do hospedeiro. c) A imunidade humoral é aquela que ocorre quando o organismo está debilitado e os linfócitos T atacam agentes invasores. d) A imunidade humoral é aquela onde um anticorpo ou linfócito específico é transferido para o organismo. Respostas 3 – B 4 – F; V; F; F; 5 – A – plasma / B – elementos figurados / C – leucócitos / D – plaquetas. 6 – A 8 INTRODUÇÃO A qualidade de um resultado diretamente ligada às técnicas empregadas no dia a dia. Muitos são os fatores que podem alterar esta qualidade e até mesmo fornecer resultados imprecisos e errados. A qualidade dos reagentes e da amostra colhida, a manutenção e calibração dos equipamentos e materiais utilizados, a técnica utilizada e como o operador realiza as análises são exemplos destas variáveis. Não adianta um laboratório ter uma boa quantidade de amostra, os mais caros e avançados equipamentos se o operador, ou técnico, estiver destreinado realizando as análises sem cuidado e técnica apropriada. Por isso a seguir estudaremos as técnicas e modos corretos de operação dos equipamentos fundamentais encontrados nos laboratórios. 9 TÉCNICAS DE PIPETAGEM E MICROPIPETAGEM A coisa que mais fazemos em um laboratório é medir volumes. Existem inúmeros instrumentos para esta finalidade: balão volumétrico, béquer, erlenmeyer, mas os mais usados e que exigem maior técnica são as pipetas e micropipetas. 9.1 PIPETAS Como já vimos no primeiro módulo Existem dois tipos de pipetas: graduadas e volumétricas. As pipetas volumétricas possuem uma dilatação no centro do corpo da pipeta que a torna mais precisa e possui apenas uma opção de volume, o volume total. As pipetas graduadas são as mais comuns e possuem uma graduação indicativa do volume. Na parte superior da pipeta estão informações auxiliares como: volume total da pipeta, qual volume corresponde cada traço da graduação e temperatura máxima que pode ser submetida. Nesta pipeta da figura abaixo, por exemplo, é uma pipeta de 25 ml onde cada traço corresponde a 0,1 ml e pode chegar até 20ºC sem problemas. FIGURA 64 FONTE: Disponível em: volumétrica graduada <http://t.r4.com.br/templates/casaq/www.casadaquimica.com/SUB/detalhe/8321/>. Acesso em: 14 mar. 2012. Esses são detalhes que precisamos prestar atenção antes de escolher a pipeta, dependendo para que iremos utilizar. É aconselhável, antes de iniciar um procedimento, verificar quais volumes terão de ser pipetados e escolher a pipeta com volume mais próximo e com a graduação correta. No caso de em uma análise for necessário pipetar 3 ml de um reagente e 7 ml de outro então o adequado é usar uma pipeta de 5 ml e outra de 10 ml. Uma dúvida recorrente é quando o volume necessário é ‘quase’ o de uma pipeta, por exemplo, uma pipetagem de 10,5 ml. O que fazer neste caso? O correto é usar uma pipeta com volume maior mais próxima. Se só tiver a de 20 ml, deverá ser essa a opção. Algumas vezes a pipeta precisa ser esterilizada, em autoclave, a temperatura chega a 121ºC, neste caso é necessário escolher uma pipeta que resista tanto sua integridade quanto sua calibração, a altas temperaturas. Sempre use pipetas sem pontas ou partes quebradas, limpas e secas. Também se usa colocar um pequeno chumaço de algodão hidrofóbico na extremidade superior da pipeta como uma espécie de filtro de proteção. A pipetagem consiste em aplicar uma pressão negativa na abertura superior da pipeta para a sucção de líquidos. É expressamente proibido pipetar com a boca e também nem há necessidade, pois existem no mercado vários tipos e modelos de dispositivos auxiliares para pipetas. FIGURA 65 Pipetador tipo pipump FONTE: compresaude.com.br Pipetador tipo pipetaid FONTE: ciencor.com.br Pêra FONTE: taroa.com.br Ao pipetar uma solução sempre se enche a pipeta até seu volume máximo e então é feita a dispensa do líquido até ao volume desejado. O operador deve olhar de frente para a marcação, em linha reta, para verificar se o volume está na marcação. Quando um líquido está em um recipiente cilíndrico ele não fica em linha reta, há uma espécie de curva, a parte inferior desta é o menisco. Quando medimos um líquido os olhos devem estar na altura do menisco e a pipeta deve estar verticalmente reta. FIGURA 66 FONTE: kontrol-kalidad.blogspot.com FONTE: juntadeandalucia.es 9.2 MICROPIPETAS As micropipetas são utilizadas para volumes pequenos, em torno de 1 a 1000ul (microlitros). Existem micropipetas para diversas faixas de volume e usam ponteiras descartáveis para cada pipetagem. Existem as micropipetas monocanal que utilizam uma ponteira de cada vez e micropipetas multicanal que são usadas para trabalhar em microplacas ou tiras de microtubos, com várias ponteiras (em geral de 8 a 12) de cada vez. FIGURA 67 Existem dois estágios no embolo da micropipeta que dependendo da modalidade de pipetagem (direta ou reversa) é usado. FIGURA 68 FONTE: tudolab.com.br Micropipeta Monocanal Micropipeta Multicanal Micropipeta Multicanal 1ºestágio 2ºestágio Fonte: frilabo.pt embolo 1ºestágio 2ºestágio Fonte: frilabo.pt 1ºestágio 2ºestágio 1ºestágio 2ºestágio Fonte: frilabo.pt embolo 9.2.1 Pipetagem Direta É o modo padrão de pipetagem, usada para amostras com viscosidade normal. Na pipetagem direta, primeiro esvazia-se o ar da ponteira apertando o embolo até o 1º estágio e leva-se a ponteira, com o embolo ainda apertado, até metade do líquido que será pipetado. Em seguida se solta lentamente o embolo até o preenchimento da ponteira. Para transferir, com o recipiente receptor inclinado, colocar a ponteira até o meio do tubo e apertar o embolo até o final (2º estágio), dispensando lentamente todo o líquido e só quando estiver fora do líquido, solta o embolo. FIGURA 69 9.2.2 Pipetagem Reversa 2º estágio 1º estágio PREPARAÇÃO ASPIRAÇÃO TRANSFERÊNCIA ESGOTAMENTO REPOUSO Segurar o embolo até o 1º estágio – fora do líquido Soltar o embolo – dentro do líquido Inserir ponteira dentro do recipiente receptor inclinado Apertar o embolo até o 2º estágio - devagar Soltar completamente o embolo – fora do líquido Fonte: adaptado de Infotec - Labtest 2º estágio 1º estágio PREPARAÇÃO ASPIRAÇÃO TRANSFERÊNCIA ESGOTAMENTO REPOUSO Segurar o embolo até o 1º estágio – fora do líquido Soltar o embolo – dentro do líquido Inserir ponteira dentro do recipiente receptor inclinado Apertar o embolo até o 2º estágio - devagar Soltar completamente o embolo – fora do líquido 2º estágio 1º estágio PREPARAÇÃO ASPIRAÇÃO TRANSFERÊNCIA ESGOTAMENTO REPOUSO Segurar o embolo até o 1º estágio – fora do líquido Soltar o embolo – dentro do líquido Inserir ponteira dentro do recipiente receptor inclinado Apertar o embolo até o 2º estágio - devagar 2º estágio 1º estágio PREPARAÇÃO ASPIRAÇÃO TRANSFERÊNCIA ESGOTAMENTO REPOUSO Segurar o embolo até o 1º estágio – fora do líquido Soltar o embolo – dentro do líquido Inserir ponteira dentro do recipiente receptor inclinado Apertar o embolo até o 2º estágio - devagar Soltar completamente o embolo – fora do líquido Fonte: adaptado de Infotec - Labtest Esta modalidade de pipetagem é utilizada mais frequentemente para amostras densas, difíceis de pipetar. Antes de imergir a ponteira no líquido aperta-se o embolo até o 2º estágio e então, dentro do líquido, solta-se o embolo totalmente. Colocar em seguida a ponteira dentro do recipiente de transferência ligeiramente inclinado e soltar o embolo até o 1º estágio, lentamente. FIGURA 70 2º estágio 1º estágio PREPARAÇÃO ASPIRAÇÃOTRANSFERÊNCIA RE-ASPIRAÇÃO REPOUSO Segurar o embolo até o 2º estágio – fora do líquido Soltar o embolo – dentro do líquido Inserir ponteira dentro do recipiente receptor inclinado e apertar até o 1º estágio Se for aspirar outro líquido, manter pressionado no 1º estágio Depois de pipetar, soltar completamente o embolo – fora do líquido e se não for mais pipetar descartar a ponteira Fonte: adaptado de Infotec - Labtest 2º estágio 1º estágio PREPARAÇÃO ASPIRAÇÃO TRANSFERÊNCIA RE-ASPIRAÇÃO REPOUSO Segurar o embolo até o 2º estágio – fora do líquido Soltar o embolo – dentro do líquido Inserir ponteira dentro do recipiente receptor inclinado e apertar até o 1º estágio Se for aspirar outro líquido, manter pressionado no 1º estágio Depois de pipetar, soltar completamente o embolo – fora do líquido e se não for mais pipetar descartar a ponteira Fonte: adaptado de Infotec - Labtest 10 USO DE CAPELA E CABINES DE SEGURANÇA BIOLÓGICA 10.1 CAPELA FIGURA 71 F ONTE: Disponível em: <http://www.lmf.df.ufscar.br/images/capela.JPG>. Acesso em: 15 mar. 2012. Como já vimos anteriormente Capelas são câmaras para manipulação de reagentes e substâncias tóxicas e voláteis. Os frascos contendo estes reagentes devem ser abertos apenas dentro da Capela, com o sistema de exaustor ligado e com a tampa frontal parcialmente aberta, com espaço suficiente apenas para colocar os braços dentro. Apesar de estar trabalhando dentro da capela com os reagentes tóxicos e perigosos ainda é obrigatório o uso de EPI para este tipo de manipulação, como óculos de segurança, luvas e dependendo do tipo de produto, se muito concentrado e/ou tóxico, até máscara com sistema de filtração. 10.2 CABINES DE SEGURANÇA BIOLÓGICA As Cabines de Segurança Biológica (CBS) tem por objetivo proteger o operador, o meio ambiente e as amostras manipuladas. Há vários níveis de CBS que dependem do grau de segurança necessário e nível de periculosidade dos agentes biológicos envolvidos nas atividades. A seguir conheceremos quais são os tipos existentes de Cabines de Segurança Biológica. 10.2.1 CBS Classe I O ar é sugado para a cabine através da abertura frontal, circula pelo seu interior e depois é eliminado por um condutor que fica na parte de trás da cabine, passando antes por um filtro especial – filtro HEPA. Quando manipulamos meios líquidos e amostras podemos gerar aerossóis que consiste no desprendimento de partículas microscópicas contendo os agentes infecciosos – vírus, bactérias, etc. O sistema das cabines de segurança faz o ar no interior da cabine circular, evitando dessa forma que estes aerossóis e que os agentes infectantes permaneçam na cabine. FIGURA 72 A: Abertura frontal B: Painel de observação C: Filtro exaustor HEPA FONTE: Manual de Segurança Biológica OMS. 10.2.2 CBS Classe II As câmaras da Classe II diferem das anteriores por proteger também o interior da cabine de contaminações externas. O ar que entra na cabine passa antes por um filtro do tipo HEPA e assim tanto operador quanto amostras são protegidas de contaminações. Neste sistema 70% do ar é recirculado dentro da cabine e 30% é expelido, depois de passar por outro filtro HEPA. As CBS Classe II são adequadas para a manipulação de agentes dos grupos de rico 2 e 3. FIGURA 73 Existem quatro tipos de CBS da Classe II : A1, A2, B1 e B2. A diferença entre eles está na quantidade de ar recirculado e a velocidade de captação externa do ar. Sendo que as CBS Classe II dos tipos B possuem no máximo 30% de recirculação do ar. FONTE: Manual de Segurança Biológica OMS. A: Abertura frontal B: Painel de observação C:Filtro exaustor HEPA D:Conduta traseira E:Filtro HEPA de abastecimento FIGURA 74 10.2.3 CBS Classe III Esse tipo de cabine oferece a maior proteção para o operador e é o tipo indicado para uso com agentes biológicos do grupo de risco 4. O ar expelido da cabine passa por um sistema de filtração com 2 filtros HEPA e atua com pressão negativa, ou seja, nenhum ar sai da cabine a não ser pelo sistema de filtragem. A manipulação na CBS Classe III costuma ser realizada com luvas grossas de borracha presas a mangas na parte frontal da cabine, sendo essa totalmente vedada. FONTE: Manual de Segurança Biológica OMS. A: Abertura frontal B: Painel de observação C:Filtro exaustor HEPA D: Filtro de admissão HEPA FIGURA 75 10.3 TRABALHANDO COM CABINES DE SEGURANÇA BIOLÓGICA Independente da Classe de segurança alguns cuidados são necessários antes, durante e após a operação na Cabine de Segurança Biológica, para a garantia da qualidade do trabalho e segurança do meio ambiente e operador. 10.3.1 Luz ultravioleta A: Porta-luvas (cobrindo o braço todo) B: Painel de observação C: Filtros exaustores HEPA duplos D: Filtros de admissão HEPA FONTE: Manual de Segurança Biológica OMS. A maioria das cabines possui lâmpadas de luz ultravioleta que servem para esterilização antes e após o uso da cabine. Essa lâmpada deve ficar acesa de 15 a 30 minutos apenas. É preciso ter uma planilha para anotação acumulativa das horas utilizadas, pois, este tipo de lâmpada possui um período de vida útil e após este tempo não tem mais o mesmo poder de ação esterilizante. Também não se deve olhar diretamente para a luz ultravioleta e nem usar a cabine com ela acessa, pois ela pode queimar a pele e córnea, sendo recomendado que quando esta luz estiver acesa evitar ficar por perto. 10.3.2 Limpeza A limpeza da cabine deve ser realizada antes do uso, antes de ligar a luz ultravioleta e após o uso, após o período de esterilização com a luz ultravioleta. A limpeza deve ser realizada com algodão ou gaze embebido em álcool 70%. Em casos especiais, quando há uso com agentes biológicos de maior risco, deve-se primeiro efetuar uma limpeza com hipoclorito de sódio diluído e depois um enxágue com água no mínimo destilada, terminando a limpeza com álcool 70%. Uma vez por semana, ou em menos tempo dependendo do uso da cabine, deve ser feita uma limpeza mais profunda. Nesta limpeza profunda toda a área de trabalho deve ser lavada com água e sabão neutro e enxaguada. Em qualquer processo de limpeza deve-se ter muito cuidado para não molhar e estragar os filtros HEPA. O enxágue deve ser feito de forma delicada, não jogando água, mas sim com o auxílio de uma esponja ou pano, exclusivos para esta finalidade ou com gaze e algodão. 10.3.3 Cuidados durante operação CBS Depois de limpar, passar álcool 70% e ligar a luz ultravioleta, o motor da cabine deve ser ligado e permanecer em repouso por 15 a 30 minutos antes do uso. Este repouso é necessário para que haja uma renovação do ar dentro da cabine, garantindo desta forma que o ar interno ao início do procedimento esteja estéril. Todo o sistema da cabine tem como princípio a circulação de ar, há uma ‘cortina’ de ar na abertura frontal que evita a entrada de ar que não seja previamente filtrado. Por isso não pode haver circulação de pessoas na frente da CBS, a cabine deve ser posicionada, dentro do laboratório, de forma a evitar este tipo de situação, evitando, por exemplo, colocá-la em frente a uma porta. O operador também não pode trabalhar com movimentos bruscos, para evitar a ‘quebra’ desta cortina de ar, devendo, inclusive, aguardar alguns minutos depois de organizar os materiais e já com as mãos dentro da cabine. Todo material que será utilizado dentro da cabine deve ser previamente desinfetado de alguma forma. O mais comum é embeber todo o material com álcool 70% antes de colocá-los dentro da cabine. As vidrarias e insumos