proteinas totais

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DETERMINAÇÃO DE PROTEINAS TOTAIS POR ESPECTROFOTOMETRIA
INTRODUÇÃO
As proteínas são consideradas as macromoléculas mais importantes das células. E para muitos organismos, constituem quase 50% de suas massas. As proteínas são formadas a partir da união de muitos aminoácidos. Elas possuem diversas funções nos mais diversos organismos. A partir disso, pode-se notar que as proteínas não são somente as mais abundantes macromoléculas, mas também, são muito importantes para a vida. As milhares de enzimas que um organismo possui são todas proteínas com funções importantes. As informações genéticas, por exemplo, são expressas através de proteínas.
As proteínas, como dito, são formadas a partir da combinação de aminoácidos. Entretanto, só existem 21 aminoácidos primários, a partir dos quais são formados outros aminoácidos e as milhares de proteínas. A diferença é a sequência na qual os aminoácidos se organizam. A partir dessa sequência de organização dos 21 aminoácidos é que a função se destaca.
As proteínas desempenham papéis extremamente importantes, na maioria dos processos biológicos, atuando como enzimas, hormônios, neurotransmissores, transportadores através das membranas celulares e outros. O desenvolvimento de metodologias para determinar proteínas tem, cada vez mais, se tornado de fundamental relevância em várias áreas do conhecimento, como por exemplo, em análises clínicas, favorecendo o diagnóstico de certas doenças correlacionadas com a alteração da quantidade de proteínas nos fluidos biológicos; em nutrição animal, ressaltando o aproveitamento racional de nutrientes; em problemas relacionados à nutrição humana, como obesidade, anorexia nervosa, desnutrição, devendo as dietas apresentar teor balanceado de proteínas; em tecnologia e ciências de alimentos, objetivando o aproveitamento racional da matéria prima e o melhoramento dos produtos novos e já existentes; em ecologia, relacionando o comportamento alimentar com a quantidade de proteína ingerida dos alimentos, favorecendo o entendimento dos vários aspectos da vida dos animais silvestres; e na área de química de proteínas objetivando purificar novas proteínas e enzimas.
Estas são apenas algumas das mais importantes aplicações analíticas para metodologias de determinação de proteínas totais; obviamente, existem muitas outras de grande relevância. Os métodos para a determinação da concentração de proteínas totais são muito variados, no entanto, as metodologias mais utilizadas são as espectrofotométricas no ultravioleta e no visível (UV-Vis).
Para determinar a proteína em algum composto pode-se utilizar espectro eletromagnético. A luz emitida no equipamento é uma forma de radiação eletromagnética que pode ter diversos tipos de ondas com comprimentos de onda distintos, chamada depolicromática. O comprimento de onda é representando pelo símbolo ƛ(gama) que é medido em nanômetros e indica longinquidade entre dois picos ou vales da onda.
Um espectro eletromagnético apresenta diferentes classes de radiação de acordo com o tamanho e a frequência de onda. A frequência é o movimento oscilatório da onda que pode ser medido em Hertz (Hz). Em um espectro eletromagnético as ondas mais intensas e com maior afinidade ficam localizadas à esquerda raios gama e raios-X, enquanto as radiações menos intensas ficam à direita.
Os métodos espectrofotométricos em bioquímica residem basicamente sobre duas leis, que combinadas são conhecidas como a Lei de Beer-Lambert. A parcela de luz consumida por um meio é independente da intensidade da luz incidente e cada parcela sucessiva que passa pelo meio absorve a mesma proporção de luz passando. A quantidade de luz dissipada é proporcional à quantidade de moléculas presente no feixe que representa a concentração do substrato.
OBJETIVO
Determinar a concentração de proteínas totais em amostras biológicas através da espectrofotometria.
Relembrar a formula geral dos aminoácidos e proteínas.
MATERIAS E REAGENTES
2 pipetas automáticas
3 tubos de ensaio
Soro (normal ou patológico)
Banho-maria
3 cubetas
Espectrofotômetro
Papel absorvente
Kit de determinação de proteínas séricas
1 Estante
PRODUTO UTILIZADO
Proteínas Totais, Catálogo 99		ANVISA - 10009010080
Labtest Diagnóstica
Av. Paulo Ferreira da Costa, 600
Lagoa Santa, MG, 33400-000
REAGENTES UTILIZADOS
Reagente Biureto: Armazenar entre 15 - 30 ºC.
Contém hidróxido de sódio 600 mmol/L, sulfato de cobre 12 mmol/L, estabilizador e antioxidante. Manusear com cuidado; reagente corrosivo. Não pipetar com a boca.
Padrão - 4,0 g/dL; Armazenar entre 15 - 30 ºC. Após o manuseio, sugere-se armazenar bem vedado para evitar evaporação. Contém albumina bovina 4 g/dL e azida sódica 15,4 mmol/L.
Precauções e cuidados especiais
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação do reagente. Fazer referência ao manual ou POP de segurança.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições indicadas são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão sujeitos à contaminação de natureza química e microbiana que podem provocar redução da estabilidade. O laboratório deve estabelecer a estabilidade em suas condições operacionais.
O padrão contém azida sódica, que é tóxica. Deve-se tomar cuidado para evitar a ingestão e, no caso de contato com os olhos, lavá-los imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e cobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar o reagente. Fazer referência ao manual ou POP de segurança.
MÉTODOS
Procedimento Identificar 3 tubos de ensaio como B (branco), P (padrão) e A (amostra) e pipetar:
	
	Branco
	Padrão
	Teste
	Amostra
	---------------
	0,04 ml
	---------------
	Padrão (nº2)
	---------------
	---------------
	0,04ml
	Água destilada ou
Deionizada
	0,04 ml
	---------------
	---------------
	Reagente
	2,0 ml
	2,0 ml
	2,0 ml
Utilizamos três tubos de ensaio (padrão, teste e branco), e com a pipeta automática, foram pipetados em cada tubo, 2 ml do reagente de cor.
No tubo de ensaio teste, que continha o reagente de cor, acrescentamos 0,02 ml da solução de ’Soro’.
No tubo de ensaio padrão, que continha o reagente de cor, acrescentamos 0,02 ml da solução de ‘padrão nº2.
No tubo de ensaio branco, que continha o reagente de cor, acrescentamos 0,02 ml de água destilada ou deionizada.
Os tubos foram agitados para que ocorresse maior oxigenação das soluções finais, e posteriormente colocados em banho-maria por 10 minutos a uma temperatura de 37°C. O controle da temperatura é verificado com atenção, para que a temperatura não se eleve demasiadamente causando a desnaturação das soluções.
As soluções, bem como o reagente de cor, são colocadas em cubetas. A primeira cubeta continha à chamada substância branca, havendo apenas o reagente de cor e água destilada ou deionizada para calibração do espectrofotômetro, que foi ajustado a 545 nm. A segunda cubeta continha a solução de teste, e a terceira cubeta continha a solução padrão.
RESULTADOS E DISCUÇÕES
No espectrofotômetro foram regulados os valores de absorbância e de transmitância para a substância branca, os quais seriam zero de absorbância (não absorve nada de luz) e 100% de transmitância (deixa passar toda a luz).
Para a obtenção do valor final de proteínas na amostra, são utilizados apenas os valores de absorbância da solução padrão e da amostra, e o valor de transmitância da substância branca.
Para determinar o valor, é utilizado um cálculo, que é similar a uma regra de três. A absorbância da solução padrão foi de 0, 011 o que corresponde a 100% de absorção da luz. Já a solução teste teve absorbância de 0,264 que corresponde a um valor desconhecido de absorção da luz.
Segundo o método, quanto maior for da absorção da luz, maior é a quantidade, então para determinar a quantidade proteínas na amostra, é necessário descobrir qualé esse valor de absorção da luz na solução de amostra.
Sendo assim:
Proteínas totais (mg/dL) = x 4g/dL = x 4g/dL= 9,51g/dL
Valores desejáveis ou recomendados
Estes valores devem ser usados apenas como orientação. Eles substituem os valores de referência e são determinados a partir de dados epidemiológicos, calculados estatisticamente.
	IDADE
	g/dL
	PREMATURO
	3,6 a 6,0
	RECÉM-NASCIDO A TERMO
	4,6 a 7,0
	7 DIAS A 1 ANO
	4,4 a 7,6
	1 a 2 ANOS
	5,6 a 7,5
	ACIMA DE 3 ANOS
	6,0 a 8,0
SIGNIFICADO CLÍNICO
A dosagem isolada da proteína total tem pouco valor, porque a alteração em uma das frações pode ser compensada por alteração oposta de outra fração, como ocorre nas doenças crônicas em que há diminuição de albumina com aumento de gamaglobulina. Ocorrência similar pode ser observada em respostas de fase aguda, tais como infecções ou traumas, ocasião em que muitas proteínas plasmáticas produzidas no fígado aumentam sua concentração, enquanto a albumina se reduz, mantendo a concentração protéica total praticamente inalterada.
As proteínas estão aumentadas em algumas neoplasias, especialmente em mieloma múltiplo; na macroglobulinemia; doenças autoimunes, como artrite reumatóide e lupus eritematoso sistêmico; doenças granulomatosas como a sarcoidose, leishmaniose visceral; endocardite bacteriana sub-aguda e linfogranuloma; em alguns casos de doença hepática crônica, como hepatite autoimune e na desidratação.
	Para adultos, os dados de referência de proteínas totais são de 6,6 A 8,3 g/d L. De acordo com a amostra analisada, obtivemos o resultado 9,51 g/dL isso nos mostra que a quantidade de proteínas totais está acima dos padrões da normalidade.
CONCLUSÃO
Diversos fatores devem ser analisados antes da escolha de uma metodologia para a determinação de proteínas totais, porém, um deles é essencial: o conhecimento, o mais preciso possível, da natureza dos constituintes da amostra e de suas concentrações aproximadas. Isto facilitará a identificação dos possíveis interferentes e consequentemente ajudará na escolha do método mais apropriado para cada situação.
Outros fatores, também importantes, é a sensibilidade necessária, que é dependente da concentração de proteína na amostra e do volume de amostra disponível; a rapidez e o custo da metodologia; e, não menos importante, o grau de confiabilidade nos resultados obtidos devido aos interferentes no método escolhido
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark eds, Rio de Janeiro, 1997.
Albuquerque, M. P. D. e M. P. D. Albuquerque. Processamento de Imagens: Métodos e Análises. Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas. Rio de Janeiro, p.12. 2003. (Relatório Técnico)
Proteínas totais. Catalogo 99. Instruções de Uso, Labtest S.A. Maio, 2014.