Aula replicação do DNA 2016 II

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Disciplina de Biologia Molecular 
Profª. Lidia Amorim 
Departamento de Biologia Celular e Molecular 
amorim@vm.uff.br 
Replicação do DNA: 
Procariotos e Eucariotos 
O que é o principio transformante? 
Você já sabe? 
O que os experimentos de Meselson e Stahl conseguiram comprovar? 
Como marcar proteínas e DNA de forma diferencial? 
Qual o dogma central da biologia molecular? 
Quais as propriedades da replicação? 
Que significa oriC em E. Coli ? 
Descrever o processo de replicação em E.coli. ? 
Diferenciar a replicação em eucariontes e procariontes? 
Apontar uma aplicação para a reação de PCR? 
O que é Taq polimerase? 
Descrever a reação de PCR? 
Dogma central da Biologia Molecular 
Replicação 
Como acontece em procariotos? 
 
 
Fonte: 
http://biology.kenyon.edu/courses
/biol114/Chap01/cell.html#bact-
div 
Em eucariotos: Ciclo celular 
Conservativa 
Semiconservativa 
Dispersiva 
 
 Molécula de DNA inteira 
serve como molde para 
uma molécula totalmente 
nova; 
 
 Molécula original – 
completamente 
conservada durante a 
replicação; 
Replicação Conservativa 
 
 Molécula de DNA inteira 
serve como molde para uma 
molécula totalmente nova; 
 
 Molécula original – 
completamente conservada 
durante a replicação; 
 
 Quebra em fragmentos –
síntese de novos fragmentos 
de DNA; 
 Remontagem de duas moléculas 
de DNA completas; 
 DNA resultante – DNA velho e 
novo intercalado; 
 Nenhuma molécula original é 
conservada; 
Replicação Dispersiva 
 
 Duas fitas de 
nucleotídeos se afastam 
e cada uma serve como 
molde para uma nova 
molécula de DNA 
Replicação Semiconservativa 
Qual dos três modelos? 
Experimentos de Meselson e Stahl 
 
Distinção – centrifugação em alta velocidade – 
formação de gradiente de densidade; 
1ª Geração 
2ª Geração 
Dispersivo x Semiconservativo 
Gradiente alcalino _ desnaturação das fitas de DNA 
Segunda geração 
1ª Propriedade da Replicação do DNA 
1)Semiconservativa 
 
 
Unidirecional Bidirecional 
 Teste com cromossomos bacterianos → Cairns 1963 
Experimento de Cairns : 
- Bactérias eram replicadas em meio contendo 3H-thymidina por uma 
geração, 
- O DNA era extraído e espalhado em uma lâmina de vidro 
- Um filme era exposto à lâmina, 
- A autoradiografia era avaliada por microscopia eletrônica. 
Origem e Direção da Replicação 
Origem e Direção da Replicação 
1) As observações são consistentes com o modelo de replicação semiconservativa 
2) DNA parental de E. coli permanece circular em todo o ciclo de replicação DNA 
3) Uma origem de replicação 
Replicação 
bidirecional 
Origem de Replicação em Eucariontes 
 Células eucarióticas - longas moléculas de DNA – muitas origens de replicação; 
 
 Velocidade - 500 a 5000 nucleotídeos por minuto para cada forquilha; 
 
  Diversas bolhas de replicação – fusão – formação de suas moléculas de DNA 
idênticas; 
Plasmídeo Col E1de Campylobacter Coli → Unidirecional 
Fagos de genoma circular (fago λ) → Única forquilha de replicação → Círculo rolante 
Propriedades da Replicação do DNA 
2ª Semiconservativa 
 
3ª Em geral Bidirecional 
 
 
1) Iniciação 
 
2) Alongamento 
 
3) Terminação 
 
A origem de replicação em E. Coli - oriC 
DUE - DNA 
unwinding 
element 
Origem de Replicação - Procariotos 
Deselicoidização do DNA 
Helicases → abrem a 
dupla hélice, rompendo as 
pontes de hidrogênio. 
SSB 
SSB → impedem a 
reestruturação do DNA 
Super-helicoidização do DNA 
Topoisomerases → alteram a 
helicoidização do DNA 
Super-helicoidização do DNA 
Síntese das fitas de DNA 
Fita descontinua 
Fita continua 
Direção da forquilha 
DNA Polimerases 
TIPOS DE DNA POLIMERASES E SUAS RESPECTIVAS FUNÇÕES 
 
DNA POLIMERASE DNA-DEPENDENTE 
Envolvida em replicação, reparo e recombinação do DNA. Catalisa a adição de um 
desoxiribonucleotídeo ao terminal 3´ de uma cadeia preexistente, utilizando uma cadeia de DNA 
complementar como molde . Portanto, depende de uma fita molde e de um primer. 
 
DNA POLIMERASE RNA-DEPENDENTE 
Transcriptase reversa 
Envolvida na replicação de retrovírus. Descoberta por Temein e Baltimore, em 1970. Não 
apresenta atividade exonuclease 3´-5´. Além da atividade DNA polimerase RNA dependente, 
apresenta também as atividades RNAse H e DNA polimerase DNA-dependente. Catalisa a adição 
de desoxiribonucleotídeos ao terminal 3´ de uma cadeia de DNA preexistente, utilizando uma 
cadeia de RNA complementar como molde e um primer exógeno específico. Num estágio 
seguinte, a fita híbrida DNA-RNA é convertida em DNA-DNA, por ação das atividades RNAse H 
e DNA polimerase DNA dependente. Portanto, depende de uma fita molde e de um primer. 
Telomerase 
Envolvida na manutenção do tamanho dos telômeros. Catalisa a adição de um desoxi-
ribonucleotídeo ao terminal 3´ de uma cadeia pré existente, utilizando uma seqüência de RNA 
complementar interna (grupo prostético) como molde. Portanto, depende apenas de uma fita 
molde de DNA. Enzima encontrada em células germinativas de eucariotos. 
DNA Polimerases 
 Todas as DNA polimerases precisam: 
 
a)Uma fita Molde 
 
b)Um Inicializador ou Primer 
Primer ou Iniciador 
OH livre 
DNA Polimerases - Procariotos 
 DNA polimerase I  90% 
 
 DNA polimerase II 
 
 DNA polimerase III principal enzima da 
replicação em procariotos 
 
 DNA polimerase IV 
 
 DNA polimerase V 
 
 
DNA Polimerases 
Exonucleases Endonucleases 
Figure 5-8 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
DNA Polimerases também corrigem erros 
Formas Tautoméricas podem causar 
mutações pontuais 
Mutação Puntiforme 
 Silenciosa 
 
 Missense – Perda de 
Sentido 
 
 Nonsense – Sem Sentido 
 
UCA 
(serina) 
CCA 
(prolina) 
UAA 
(terminação) 
UCU 
(serina) 
Silenciosa 
Nonsense 
Missense 
E se não corrigir → MUTAÇÃO 
DNA Polimerases 
Taxa de erro da duplicação → 1x a cada 1010 
Síntese de DNA 
 Semi-descontínua: 
 
 Fita contínua (Líder) 
 
 Fita descontínua (fragmentos) 
DNA Polimerase 
http://www.dnatube.com/video/2335/Video-for-DNA-Replication 
Síntese fita contínua - Líder 
Primer 
DNA polimerase - Atividade Polimerase 5’ para 3’ 
Pol III - Atividade Polimerase 5’ para 3’ 
Síntese fita descontínua 
Pol I - Atividade Exonuclease 5’ para 3’ 
 Atividade Polimerase 5’ para 3 
Primer 
Complexo Protéico 
Procariotos 
Terminação 
Terminação - E. coli 
Terminação - E. coli 
Replicação Procariotos - E. 
coli 
1. Iniciação 
 
 
3.Terminação 
 
2.Alongamento 
 
 
Replicação - Procariotos 
http://www.dnatube.com/video/3028/Semiconservative-Replication 
Eucariotos 
 Características essenciais ≈ procariotos 
 
 Bidirecional a partir de múltiplos pontos de 
origem de replicação 
 
 Iniciação da replicação – complexo de 
reconhecimento de origem (ORC) 
Replicação Eucariotos 
Origem de Replicação - Eucariotos 
Origem de Replicação - Eucariotos 
 DNA Pol α → síntese de iniciadores e 
atividade polimerásica 
 
 DNA Pol  e δ → funções análogas a 
Pol III; exonuclease de revisão 3’5’ 
Replicação Eucariotos 
Replicação Eucariotos 
1. Iniciação 
 
 
3.Terminação 
 
2.Alongamento 
 
 
Síntese do DNA no Telômero 
Síntese do DNA no TelômeroTérmino - Telomerase 
Término - Telomerase 
Término - Telomerase 
Telomerase 
 
-Células germinativas, células embrionárias iniciais e algumas 
células somáticas proliferativas (medula óssea, células que 
revestem o intestino) 
 
-células somáticas pouca ou nenhuma atividade da telomerase 
– cromossomos se encurtam a cada divisão. 
 
* Associação com envelhecimento 
Telomerase 
http://www.dnatube.com/video/6886/Telomere-Replication-Science-video 
Síndrome de Werner 
 Envelhecimento precoce 
 Eventos relacionados ao 
envelhecimento 
- rugas na pele, cataratas, 
osteoporose, cabelos grisalhos e 
doença cardiovascular 
Causa – telômeros mais curtos do 
que normais (mutação no 
gene WRN, codifica proteína de 
revestimento do telômero) 
9 anos e 8 anos 
T-loop 
Aplicações 
Reação em cadeia da polimerase 
Aplicações - PCR 
Primers 
dNTPs 
Taq DNA Pol 
Tampão 
+ Mg 
Amostra 
ATP, TTP, 
CTP, GTP 
Desnaturação inicial (94 °C, 5 min) 
 
Anelamento (30-60 °C, 30 seg) 
Desnaturação (94 °C, 30 seg) 
CICLOS 35 
Extensão (72 °C, 1 min) 
 
Extensão final (72 °C, 7-10 min) 
 
Aplicações - PCR 
Aplicações - PCR 
 Biologia Forense 
 Teste de paternidade 
 Estudos de susceptibilidade 
 Teste diagnóstico: 
 HIV 
 Hepatites B e C 
 Doenças Genéticas 
 
Aplicações 
Aplicações - PCR 
http://www.dnatube.com/video/1397/The-polymerase-chain-reaction-PCR 
Vídeos 
 
https://highered.mheducation.com/sites/9834092339/student_view0/chapter14/meselson_a
nd_stahl_experiment.html 
 
Artigo nature falando da replicação em proca 
Fonte: http://www.nature.com/nrmicro/journal/v10/n1/fig_tab/nrmicro2671_F1.html 
 
Site replic de proca: 
http://virtuallaboratory.colorado.edu/Biofundamentals/lectureNotes-Revision/Topic5-
1_CellDivision.htm 
Ação da Telomerase: 
https://www.youtube.com/watch?v=AJNoTmWsE0s 
Replicação d DNA 
https://www.youtube.com/watch?v=dKubyIRiN84 
 
https://www.youtube.com/watch?v=-mtLXpgjHL0 
 
PCR 
http://www.dnalc.org/view/15924-Making-many-copies-of-DNA.html 
 
http://content.dnalc.org/content/c15/15475/19_polymerase_chain_reaction.mp4 
 
Referências 
ALBERTS, B. ET AL. BIOLOGIA MOLECULAR DA CÉLULA 4ª ED. PORTO 
ALEGRE, EDITORA ARTES MÉDICAS, 2004. 
 
COX, M, ET AL., PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA, LEHNINGER , 
EDITORA:ARTMED, 2013 
 
STRYER, BIOQUÍMICA, 6A ED., EDITORA: GUANABARA KOOGAN 2008 
 
VOET ET AL. BIOQUÍMICA. 4TH ED. PORTO ALEGRE, ARTMED, 2013. 
 
WATSON, J. D. ET AL. BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE, 5A ED. ARTMED, 
2006. 
 
ZAHA, A. ET AL. BIOLOGIA MOLECULAR BÁSICA.4ª ED. PORTO ALEGRE, A, 
2012.